загрузка...
 
Комплексная оценка уровня спонтанной продукции цитокинов в культуре мононуклеарных клеток периферической крови здорового человека
Повернутись до змісту

Комплексная оценка уровня спонтанной продукции цитокинов в культуре мононуклеарных клеток периферической крови здорового человека

В.И. Коненков, И.Г. Ракова, В.В. Авдошина, Е.Л. Гельфгат

ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск

Целью работы была комплексная оценка уровня спонтанной продукции цитокинов в супернатантах культивируемых мононуклеарных клеток здоровых лиц европеоидного происхождения. Проведено сравнение уровня цитокинов по различным группам и выявлено, что продукция INFY ТМ-клетками преобладает над продукцией ^-2 этими же клетками. Анализ цитокинов 1Ъ2-группы обнаружил преобладание ^-б над уровнем продукции других цитокинов. Также у здоровых людей выявлено преобладание интенсивности продукции ^-4 над ^-13 — другим костимулятором пролиферации преактивированных В-клеток. Сопоставление концентраций ростовых факторов показало, что интенсивность продукции G-CSF значительно выше, чем продукция GM-CSF. Концентрация ^-8 достоверно выше концентрации других хемокинов. Комплексная оценка уровней спонтанной продукции цитокинов выявила их достоверную зависимость от возраста и пола. (Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 2. С. 33-37.)

Ключевые слова: цитокины, Bio-PLex, здоровые доноры, гетерогенность.

 

 

 

 

Нормальное функционирование иммунной системы обеспечивается физиологическим балансом продукции и акцепции цитокинов клетками различного происхождения и различных функций, образующих т.н. цитокиновую сеть, регулирующую как интенсивность иммунных реакций, так и процессы пролиферации, миграции и дифферен- цировки клеток [1, 2].

К настоящему времени описано значительное и постоянно растущее число цитокинов, их антагонистов и рецепторов, что представляет определенные трудности в комплексной интерпретации их биологических функций как единого целого и, вероятно, потребует в перспективе использования математических методов системного анализа. Особенное значение эти трудности приобретают при попытках использования измерения уровня продукции цитокинов в диагностических целях и при создании патогенетических моделей развития патологии человека. Это происходит в связи с тем, что изменения в продукции цитокинов часто являются маркером воздействия неблагоприятных факторов на саму иммунную систему. Существенным недостатком наиболее распространенных методов определения концентрации цитокинов является короткий период их жизни в сыворотке крови и способность активно связываться в комплексы с различными сывороточными белками, что не позволяет адекватно использовать результаты таких измерений в клинических целях [3]. Исходя из этого, предпочтительнее проводить определение концентраций цитокинов в супернатантах клеток, культивируемых как без стимуляторов, так и с различными стимуляторами, т.к. цитокины относятся к группе белков с высоким уровнем индуцибельности.

Другим существенным моментом, затрудняющим комплексную оценку биологической активности цитокиновой сети, является общепринятое использование моноспецифических тест-систем, позволяющих проводить в данном образце и в данный момент определение лишь одного цитоки- на с использованием соответствующей калибровочной кривой.

Эти проблемы приводят и к значительным колебаниям доверительных интервалов нормативных значений измерения концентраций различ-

 

 

 


ных цитокинов в группах здоровых лиц, что в значительной мере связано с генетической гетерогенностью популяции по аллельным вариантам генов цитокинов, однако, затрудняет выработку диагностических критериев иммунопатологических состояний при заболеваниях человека [4].

Существенным шагом к преодолению этих трудностей является использование проточных систем измерения с одномоментным анализом связывания значительного числа цитокинов со специфическими моноклональными антителами на твердой фазе.

Появление новой технологии Bio-Plex Protein Assay System фирмы Bio-Rad, разработанной на базе Luminex R/O, позволяет с меньшими затратами обнаруживать и производить количественную оценку в режиме реального времени в малом объеме образца (50 мкл) до 100 цитокинов (к настоящему времени, семнадцати: IL-1ß, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, G-GSF, GM-GSF, MCP-1, MIP-1ß. Одним из существенных преимуществ данной технологии является применение унифицированных калибровочных стандартов для каждого цитокина в отдельности, что позволяет достоверно оценивать уровень продукции большого числа цитокинов в одном образце одновременно.

В настоящем исследовании проведено определение концентрации 17 цитокинов в супернатантах культивированных без стимуляции мо- нонуклеарных клеток крови здоровых лиц европеоидного происхождения, постоянно проживающих в Сибири.

Материалы и методы

Для исследования использовали цельную кровь 48 здоровых добровольцев. В исследование были включены здоровые (по клиническим и параклиническим данным) доноры европеоидного населения Новосибирской области в возрасте от 18 до 58 лет, из них 22 женщины и 26 мужчин. Периферическую кровь получали из локтевой вены в асептических условиях в пробирки, содержавшие 25 ЕД гепарина на 1 мл крови.

Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из свежей гепа- ринизированной крови доноров в градиенте урографина-фик- кола (плотность 1,077 г/мл). Полученную клеточную взвесь трижды отмывали средой RPMI-1640 (Sigma, USA). Выделенные и отмытые клетки культивировали 48 часов без добавления каких-либо митогенов. В качестве питательной среды для МНК использовали RPMI-1640 с добавлением 5%-ной инактивированной эмбриональной сыворотки (Sigma, USA). После 48-часовой инкубации собирали супернатанты, центрифугировали и хранили при -70 °С.

Концентрацию 17 цитокинов (IL-1ß, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17, G-GSF, GM-GSF, MCP-1, MIP-1ß) в супернатантах клеточных культур оценивали методом проточной иммунофлюорометрии на двухлучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, BioRad, USA). Перед исследованием супернатанты размораживали и фильтровали через одноразовые нитроцеллюлозные фильтры с порами 0,4 мкм в диаметре. Для исследования концентрации цитокинов в 50 мкл образца использовали коммерческую тест-систему «17-plex» фирмы Bio-Rad в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Диапазон измерений от

до 32000 пкг/мл. Анализ проводили тремя независимыми экспериментальными сериями, при этом как калибровочные разведения, так и исследуемые образцы были хорошо воспроизводимы. Расчеты концентрации 17 исследуемых цитокинов по стандартным калибровочным разведениям производили при помощи программного обеспечения, поставляемого фирмой Bio-Rad (Bio-Plex Manager 3.0). Данные представлены в пкг/мл.

Для характеристики продукции цитокинов использовали методы описательной и структурной статистики. Для выделения различных диапазонов варьирования, связанных с оптимальной продукцией, ее повышением и снижением, использовали методы квантильного анализа по Мостеллеру и Тьюки. Диапазон оптимума ограничивался значениями квантилей р25 и р75. В качестве параметров сниженной и повышенной продукции цитокинов принимались диапазоны выше р90 и р95, а сниженной — р10 и р5. Для оценки типа распределения использовали показатели эксцесса, ассиметрии и критерий х2 [5]. Расчет показателей осуществляли с использованием пакета статистических программ Statistica 6.0.

Результаты и обсуждение

Согласно инструкции производителя тест-системы «17-plex» (Bio-Rad, USA), устойчивый диагностический диапазон определения объявлен от

пкг/мл до 32000 пкг/мл. Однако детальный анализ калибровочных кривых тест-системы показал, что оптимальная чувствительность находится в пределах от 1 пкг/мл до 4000 пкг/мл. На приведенном ниже примере калибровочной кривой (рис. 1) видно, что концентрации выше 4000 пкг/мл находятся на плато, и определение концентрации цитокинов может происходить с вероятной погрешностью.

На основании анализа калибровочных кривых было обнаружено, что большинство значений IL-8, IL-17 и MIP-1P находятся выше 4000 пкг/мл; они были исключены из дальнейшего рассмотрения, т. к. не могут характеризовать достоверные диапазоны колебаний исследуемых цитокинов. Однако для характеристики уровня продукции цито- кинов им была условно присвоена концентрация > 4000 пкг/мл.

Результаты распределения показателей спонтанной продукции цитокинов в культуре моно- нуклеарных клеток представлены в табл. 1.

Определение нормативных показателей часто производится общепринятыми в иммунологических исследованиях статистическими методами обработки данных, которые подходят для нормального распределения. Это не всегда правомерно, т. к. данные, которыми располагает исследователь, не всегда имеют нормальное распределение. Поэтому на первом этапе анализа был определен тип распределения полученных данных.

 

 

 


Как видно из табл. 1, индивидуальные значения показателей концентраций цитокинов значительно варьируют от нижней до верхней границ чувствительности, а тип их распределения характеризуется высоким уровнем асимметрии и эксцесса. Это свидетельствует о скошенности и об островершинном типе распределения в достаточно узком диапазоне значений. Это подтверждается и высоким значением критерия %2, указывающим на наличие достоверного отклонения от нормального распределения. Эти три показателя указывают на то, что среди здоровых лиц уровень продукции цитокинов характеризуется высокой вариабельностью, при которой индивидуальные значения колеблются в широких пределах, и в ряде случаев мы имеем дело с различными типами распределения данных, что делает неприемлемым сравнение различных групп обследуемых по средним величинам. Более обоснованной является оценка распределения по диапазонам, связанным с различным типом продукции. Для того чтобы определить тип продукции, необходимо выделение соответствующих диапазонов и разделение генеральной выборки на группы с низкой, умеренно низкой, оптимальной, умеренно высокой и высокой продукцией.

Подпись:  
—	 IL-la --Д--	— IL-lß -Є	IL-2	-*	IL-4 --*■	IL-5
В качестве альтернативного метода оценки среднего уровня продукции и выделения оптимальных значений, а также диапазонов высокой и низкой продукции, нами были применены рекомендуемые методы квантильного

 

 


Цитокин

Средняя

величина

Минимум

Максимум

Среднее

квадратическое

отклонение

Ошибка

средней

Ассиметрия

Эксцесс

Критерий х2

Уровень

значимости

INFy

15,71

0,02

89,3

16,3

2,37

2,82

10,07

27,70

< 0,0001

IL-2

2,71

0,04

8,6

2,01

0,29

0,88

0,62

2,99

> 0,1

IL-4

4,38

0,04

9,98

2,02

0,29

0,21

0,32

3,07

> 0,1

IL-5

0,046

0,01

0,250

0,04

0,01

3,27

13,34

29,60

< 0,0001

IL-6

3778,2

7 5,1

8216,3

2516,2

367,03

0,03

-1,28

6,85

> 0,1

IL-10

28,79

0,01

136,3

30,065

4,43

2,21

5,05

30,49

< 0,0001

IL-13

0,28

0,00

3,00

0,45

0,07

5,20

31,32

34,34

< 0,0001

IL-1ß

57,58

0,09

533,4

110,0

16,04

3,56

13,62

91,48

< 0,0001

TNFa

26,72

2,43

219,6

37,57

5,48

3,49

15,13

64,69

< 0,0001

IL-12

10,39

0,56

82,3

15,33

2,42

3,29

12,65

34,10

< 0,0001

IL-7

0,132

0,01

3,03

0,45

0,08

6,40

42,11

125,5

< 0,0001

G-CSF

371,4

1,31

3898,8

635,13

93,64

4,25

21,78

57,57

< 0,0001

GM-CSF

42,5

9,6

138,1

23,191

3,42

1,93

5,71

6,07

> 0,1

MCP-1

618,1

0,001

1083,0

266,10

39,23

-0,69

-0,30

8,44

< 0,05

Таблица 1

 

За диапазон оптимума нормативных значений принимали диапазон, который находится в пределах от 25 до 75 квантили, т. е. в этот диапазон включалось 50 % значений измерения показателя у здоровых лиц, распределенных по 25 % слева и справа от средней величины продукции. Значения показателей в интервале от р25 до р10 и от р75 до р90 относились к умеренно сниженным и умеренно повышенным величинам показателям, от p1 до p10 — к низким, и от р90 до р99 — к высоким.

Таким образом, были выделены подгруппы индивидов с низким и умеренно низким уровнем продукции каждого цитокина, в которые вошли

% и 13 % значений, соответственно, а также подгруппы с умеренно высоким и высоким уровнем продукции (15 % и 11 %, соответственно).

Для сравнительной характеристики уровня продукции цитокинов нами был проведен анализ в диапазоне оптимума. Сравнивались различные подгруппы цитокинов по их продукции теми или иными клетками иммунной системы (табл. 2).

Так, при сопоставлении уровня продукции ци- токинов, синтезируемых TM-клетками, установ-

Квантильные диапазоны концентрации цитокинов в супернатантах культур мононуклеарных клеток здоровых лиц и частота их встречаемости

Цитокин

Уровни снижения, пкг/мл; %

Диапазон

оптимума

Уровни повышения пкг/мл; %

Низкий

Умеренно

низкий

Умеренно

высокий

Высокий

INFy

< 2,00;

2,10-6,19;

6,20-19,5;

19,6-26,0;

> 2б,1;

 

10,б

12,8

48,8

17,2

10,б

IL-2

< 0,21;

0,22-1,28;

1,29-3,91;

3,92-5,10;

> 5,11;

 

10,б

12,8

51,1

12,8

12,8

IL-5

< 13,0;

13,1-20,0;

20,1-48,0;

48,1-65,0;

> б5,1;

 

13,0

15,2

50,1

13,0

8,7

IL-13

< 0,01;

0,02-0,08;

0,09-0,30;

0,31-0,51;

> 0,52;

 

13,0

15,2

45,7

17,4

8,7

IL-1ß

< 0,50;

0,51-4,40;

4,41-48,7;

48,8-95,0;

>95,1;

 

8,7

13,0

51,1

17,4

10,9

TNFa

< 4,40;

4,41-7,00;

7,10-32,0;

32,1-47,5;

> 47,б;

 

10,б

14,9

48,9

12,8

12,8

IL-12

< 1,50;

1,51-2,36;

2,37-10,8;

10,9-15,3;

> 15,4;

 

12,5

12,5

47,5

15,0

12,5

IL-5

< 427;

428-1371;

1372-5908;

5909-7233;

> 7234;

 

12,8

14,9

46,8

14,9

10,б

IL-4

< 1,б3;

1,64-2,34;

2,35-5,60;

5,61-6,50;

> б,51;

 

10,б

12,8

53,2

12,8

10,б

IL-10

< 5,40;

5,41-9,91;

9,92-34,3;

34,4-55,8;

> 55,9;

 

8,7

13,0

52,2

15,2

10,9

IL-7

< 17,0;

17,1-36,5;

36,6-58,0;

58,1-75,0;

> 75,1;

 

8,7

10,8

52,2

17,4

10,9

g-csf

< 15,0;

15,1-46,5;

46,6-408;

409-696;

> б97;

 

10,9

10,9

50,0

15,2

13,0

gm-csf

< 19,8;

19,9-27,4;

27,5-50,4;

50,5-63,5;

> б3,б;

 

10,9

10,9

52,2

15,2

10,8

MCP-1

< 191;

192-379;

380-816;

817-850;

> 851;

 

8,7

13,0

56,5

10,9

10,9

Необходимо отметить и значительное преобладание интенсивности продукции ^-4 над ^-13, несмотря на то, что оба эти цитокина являются костимуляторами пролиферации преактивиро- ванных В-клеток. Возможно, такой баланс продукции активаторов гуморального иммунитета связан с участием ^-13 в регуляции синтеза IgE, потребность в котором у здорового человека без аллергических реакций минимальна.

Возвращаясь к вопросу о высокой гетерогенности группы здоровых лиц, относящихся к одной этнической группе европеоидов, можно предположить, что она может быть связана как с генетическими, так и физиологическими факторами. Оказалось, что, помимо показанной нами [4] зависимости уровня спонтанной и митоген-стимулированной продукции цитоки- нов от аллельного полиморфизма их генов, для некоторых цитокинов выявляется и зависимость от половой принадлежности человека.

Так, в настоящем исследовании нами установлено, что оптимальные значения №N7 и ^-4 в два раза чаще выявляются среди женщин, чем среди мужчин. Низкие значения таких цитокинов, продуцируемых №2-клетками, как ^-5 и ^-13, достоверно чаще ф < 0,02) выявляются среди мужчин, а высокие — среди женщин.

Значимость физиологических факторов в колебаниях уровня спонтанной продукции цитокинов мо- нонуклеарными клетками здоровых лиц, вероятно, связана с широким уровнем колебания интенсивности нормальных реакций иммунитета, связанным с необходимостью постоянной элиминации инфекционных агентов и поддержания постоянства антигенного состава тканей собственного организма на момент обследования. Значимость функциональных флюктуаций в уровне продукции цитокинов подтверждается и проведенным нами анализом возрастного аспекта в группе здоровых лиц. При их условном разделении на группы молодых лиц в возрасте от 18 до 30 лет и пожилых лиц в возрасте от 40 до 58 лет было установлено, что для молодых здоровых лиц характерно повышение уровня продукции ^-13, гранулоцитарно-моноцитарно-колоние- стимулирующего фактора и макрофагального хемо- кина MCP-1. В старшей возрастной группе выявляется повышение уровня продукции ^-2 и ^-10, а также снижение способности клеток продуцировать ^-12 и GM-CSF. Эти данные, вероятно, отражают возрастную динамику функциональной активности иммунной системы и наличие большего числа клинически стертых форм иммунопатологии в старшей возрастной группе.

Можно сделать заключение, что проведенный анализ выявил необходимость комплексного анализа баланса в уровнях продукции интерлейкинов, участвующих в формировании цитокиновой сети. Данные о высоком уровне гетерогенности в уровне спонтанной продукции цитокинов у здоровых лиц должны быть учтены при разработке нормативных значений их исследования и в установлении диагностической и прогностической значимости изменения уровня концентраций цитоки- нов в клинической практике.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 02-04-48145.

 

 

 

ЛИТЕРАТУРА

 

 ования уровней цитокинов в клинической практике // Цитокины и воспаление. — 2003. — Т. 2, № 3. — С. 20-35.

Коненков В.И., Смольникова М.В. Полиморфизм промоторных регионов генов интерлейкинов 4 и 10 и фактора некроза опухолей-а у ВИЧ-инфицированных // Бюл. эксперим. биол. и мед. — 2002. — Т. 133, № 4. — С. 449-451.

Лакин Г.Ф. Биометрия. — М.: Высшая школа, 1973. — 343 с.

 

 



загрузка...