загрузка...
 
Цитокин-зависимые механизмы Т-клеточных дисфункций при хирургическом сепсисе
Повернутись до змісту

Цитокин-зависимые механизмы Т-клеточных дисфункций при хирургическом сепсисе

Е.Р. Черных, Е.В. Курганова, В.В. Сенюков, Е.Я. Шевела, Е.И. Стрельцова,

В.С. Кожевников, А.А Останин, В.А. Козлов

ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск

Проведен сравнительный анализ продукции Th1- и ^2-цитокинов (TNFa, IFNy, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, GM-CSF), а также количества CD4 и CD8 Т-лимфоцитов, внутриклеточно экспрессирующих IFNy и/или IL-4, в группах здоровых доноров и больных сепсисом, включая пациентов со сниженной (более чем на 50 %) и сохранной пролиферацией Т-клеток в ответ на стимуляцию анти-^3-антителами. Показано, что у больных со сниженной пролиферативной активностью Т-клеток имеется угнетение продукции IL-2, IFNy и IL-4, которое ассоциировано со снижением относительного количества IFNy- и IL-4-позитивных CD4 Т-клеток и, таким образом, является проявлением анергии Th1 и Th2. Увеличение у данной категории больных продукции IL-10, возможно, отражает накопление регуляторных Т-клеток с супрессорной активностью (Tri). В свою очередь, у больных с сохранной пролиферативной активностью наблюдается усиление продукции TNFa, GM-CSF, IL-4, IL-5, IL-13 и IL-10, что сопровождается смещением цитокинового баланса в сторону Th2. Поскольку дисбаланс ^1-/^2-цитокинов сопряжен со снижением количества IFNY+CD8+ Т-клеток и увеличением доли IL-4+CD8+ Т-лимфоцитов, выявленные изменения отражают феномен переключения Ts1^Ts2. (Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 2. С. 45-53.)

Ключевые слова: анергия Т-клеток, Th1/Th2, Ts1/Ts2, цитокины, сепсис.

 

 

Т-клеточная недостаточность при системном воспалительном ответе (SIRS) инфекционного и неинфекционного генеза признается большинством авторов и расценивается в качестве неблагоприятного прогностического фактора [4, 19]. Дефект Т-клеточного иммунитета при сепсисе (инфекционный SIRS) во многом связывают с повышенной гибелью лимфоцитов по механизму апоп- тоза [6, 29]. В качестве другой причины Т-клеточ- ных дисфункций при сепсисе и тяжелой травме (неинфекционный SIRS) рассматривается активная супрессия вследствие смещения цитокиново- го баланса в сторону противовоспалительных медиаторов в популяции моноцитов/макрофагов и переключения Th1^№2 [2, 7, 19, 23, 26]. Недавними исследованиями показано, что еще одним механизмом дефекта при тяжелой травме Т-кле- ток может быть пребывание их в состоянии анергии [14]. Аналогичные данные были нами получены при хирургическом сепсисе. В частности, четкие признаки анергии Т-лимфоцитов в виде глубокого угнетения пролиферативной активности Т-клеток, ассоциированного с блоком клеточного цикла и снижением продукции ^-2, были выявлены нами у 40 % больных сепсисом. Причем индукция анергии была сопряжена с накоплением естественных регуляторных клеток с супрессорной активностью (CD4+CD25+ Т-лимфоцитов) и снижением пролиферативного ответа Т-клеток на различные стимулы [1, 5].

Несмотря на определенные успехи в изучении феноменологии Т-клеточных дисфункций при системном воспалительном ответе инфекционного и неинфекционного генеза, данные, характеризующие механизмы их развития, остаются немногочисленными и достаточно разноречивыми, особенно касательно больных сепсисом. Так, например, угнетение пролиферативной активности и снижение продукции Th1-цитокинов в качестве проявлений иммунной недостаточности выявляется не у всех больных и не на все стимулы. Что касается продукции №2-цитокинов, то описываются все возможные варианты, включая неизмененную продукцию, ее усиление или глубокое угнетение. При этом целый ряд вопросов остается открытым. Действительно ли глубокое угнетение пролиферации Т-клеток при их стимуляции через Т-клеточный рецептор связано с анергией Т-кле- ток, и какая из субпопопуляций CD4 Т-клеток подвержена анергии — Th1, Th2 (или и та, и другая); каковы особенности спектра цитокинов, продуцируемых анергичными Т-клетками при хирургическом сепсисе; у какой категории больных имеет место Th1^№2 переключение и в каких субпопуляциях Т-клеток (CD4, CD8 или обеих) это происходит? Остается неисследованным вопрос о возможном сочетании различных механизмов развития Т-клеточных дисфункций и их удельном весе у различных пациентов.

С целью выяснения этих вопросов нами был проведен анализ продукции широкого спектра Th1/Th2-цитокинов (TNFa, IFNy, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, GM-CSF) у больных с хирургическим сепсисом, в том числе в группах пациентов с сохранной и сниженной пролиферативной активностью Т-клеток. Для идентификации Т-клеточных субпопуляций, причастных к изменению цитоки- нового баланса, наряду с анализом продукции ци- токинов, также исследовалось относительное количество лимфоцитов с внутриклеточной экспрессией IFNy, IL-4 или обоих цитокинов в субпопуляциях CD4 и CD8 Т-клеток.

Материалы и методы

В исследование были включены 24 больных с хирургическим сепсисом (54 % мужчин и 46 % женщин, средний возраст 43,0 ± 3,1 года), находящихся в отделении реанимации и интенсивной терапии. В 62,5 % случаев сепсис был вызван гнойно-воспалительными заболеваниями органов брюшной полости и в 20,8% — нагноительными заболеваниями органов грудной полости. В остальных случаях (16,7%) регистрировался ангиогенный сепсис. Диагностика сепсиса в соответствии с рекомендациями Чикагской согласительной конференции основывалась на выявлении двух и более признаков синдрома системного воспалительного ответа (SIRS) при наличии очага инфекции [9]. Тяжелый сепсис, сопровождающийся развитием синдрома полиорганной недостаточности (СПОН), в структуре обследованных больных составил 54,2 %. Обследование всех пациентов проводилось при получении информированного согласия. Контрольная группа была представлена 35 здоровыми донорами крови, сопоставимыми по полу и возрасту.

Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из периферической крови стандартно в градиенте плотности фиккола-верог- рафина. Клетки в концентрации 0,1 х 106/лунку культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований в среде RPMI-1640 (Sigma, США), дополненной 0,3 мг/мл L-глутамина, 5 мМ HEPES, 100 мкг/мл гентамицина и 10 % инактивированной сыворотки доноров AB(IV) группы. Для стимуляции Т-клеток использовали моноклональные анти^3-антитела IC0-90 (анти^3, «Мед- биоспектр», Москва) в концентрации 1 мкг/мл. Интенсивность пролиферации оценивали радиометрически по включению 3Н-тимидина (1 мкКи/лунку), вносимого за 18 ч до окончания культивирования.

Методом проточной флюориметрии [3, 12] на двулучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-PLex Protein Assay System, Bio-Rad, США) с использованием коммерческих тест-систем и в соответствии с инструкцией фирмы-производителя оценивали продукцию ТЬ|1/ТЬ|2-цитокинов (TNFa, IFNy, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, GM-CSF, определяемый динамический диапазон 2-32000 пкг/мл) в 48-часовых супернатантах МНК в отсутствие (спонтанная продукция) и присутствии анти- CD3-антител (стимулированная продукция).

Определение экспрессии внутриклеточных цитокинов в МНК периферической крови проводили методом трехцветной проточной цитометрии (FACSCaLibur, Becton Dickinson). С целью селективной активации Т-клеток и индукции синтеза цитокинов МНК культивировали в 24-луночных планшетах в течение 4 ч в присутствии форболмиристатацетата (30 нг/мл, ICN) и иономицина (2 мкМ, ICN), а также брефелдина А (10 мкг/мл, ICN, блокатора транспорта протеинов из аппарата Гольджи). Затем клетки инкубировали с моноклональными антителами к поверхностным маркерам (CD4-PerCP, CD8-PerCP, Becton Dickinson). После пермеабилизации клеток c помощью 0,2%-ного раствора Твин-20 их инкубировали с моноклональными анти-^у-анти- телами, конъюгированными с FITC, и анти-К-4-антителами, мечеными фикоэритрином (Becton Dickinson). Образцы анализировали на проточном цитометре с использованием программы CeLLquest. Цитокин-экспрессирующие клетки, отнесенные к лимфоцитарному региону, оценивали по параметрам прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния.

Математическую обработку полученных результатов проводили методами описательной, параметрической и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы «Statistica 5.0». Таблицы содержат информацию в виде средних арифметических величин (М) и стандартных ошибок средних (SE). Сравнение вариационных рядов осуществляли с помощью непараметрического критерия Вилкоксона — Манна — Уитни (U). Корреляционный анализ проводили методом ранговой корреляции по Спирмену.

Результаты и обсуждение

Продукция Th1/Th2-цитокинов у больных с хирургическим сепсисом

Для оценки особенностей продукции №1/№2-цитокинов был проведен сравнительный анализ содержания TNFa, ^N7 Пі-2, ^-4, Пі-5, Пі-10, Пі-13 и GM-CSF в 48-часовых супернатантах МНК здоровых доноров и больных с хирургическим сепсисом. Согласно данным литературы, продукция №N7 и ^-2 характерна для ^1-клеток, а ^-4, ^-5, ^-10, ^-13 — для ^2-клеток. TNFa и GM-CSF могут продуцироваться как теми, так и другими клетками, однако уровень продукции GM-CSF выше в популяции №1 [13, 27]. В табл. 1 приведены средние значения концентрации цито- кинов, диапазоны минимальных и максимальных величин, а также частота встречаемости больных со сниженным, сохранным и повышенным уровнем анти-CD3-стимулированной продукции ис
следуемых цитокинов (т.е. соответственно ниже, в пределах или выше границ нормативного диапазона здоровых доноров). В группе доноров спонтанная продукция большинства анализируемых цитокинов (за исключением TNFa и №N7) была минимальной и регистрировалась в «следовых» концентрациях. Спонтанная продукция №N7 не превышала 245 пг/мл. В то же время выявлялся относительно высокий уровень спонтанной продукции TNFa. Стимуляция МНК aнти-CD3-антителами сопровождалась существенным усилением продукции цитокинов. При этом наиболее высокий уровень продукции был выявлен для №N7 и TNFa.

По сравнению с донорами у больных сепсисом отмечалось достоверное увеличение спонтанной и индуцированной продукции ^-10. Кроме того, у больных регистрировалась тенденция к возрастанию среднего уровня анти-CD3-стимулирован- ной продукции как Th1/иммуностимуляторных цитокинов (^-2, TNFa и GM-CSF), так и №2-ци- токинов (^-4, ^-5 и ^-13) за счет существенного увеличения случаев выявления максимальных значений продукции исследуемых цитокинов.

Так, при анализе индивидуальных показателей в группе больных сепсисом обращала внимание поляризация уровня цитокинов в области низких либо высоких значений. Например, по уровню ^-2, TNFa и GM-CSF отмечалось либо снижение, либо повышение их продукции. И только у 18,8 % больных показатели ^-2 и TNFa находились в границах диапазона нормативных значений. Относительно №N7 — у 43,7 % больных отмечалось снижение продукции, в остальных случаях — сохранный (50,0 %) или повышенный (6,3 %) уровень. Что касается №2-цитокинов, продукция ^-4 была либо минимальной, либо повышенной (в 56,3 и 43,7 % случаев, соответственно). Уровень ^-5, ^-13 и ^-10 в половине случаев оставался в пределах номы, а в половине — повышен. Эти факты явно свидетельствовали о разнонаправленном характере изменения цитокинов при сепсисе и гетерогенности обследованных пациентов.

Особенности продукции цитокинов у больных с различным уровнем пролиферативного ответа Т-клеток

Важно отметить, что обследованные больные существенно различались по уровню пролиферативной активности Т-клеток. Учитывая этот факт, выявленная разнородность показателей цитокинов могла отражать различное функциональное состояние Т-лимфоцитов у больных со сниженной и сохранной пролиферативной активностью Т-клеток. Поэтому на следующем этапе анализ продукции цитокинов был проведен отдельно в подгруппах пациентов с сохранной и сниженной пролиферацией Т-клеток, которых мы условно обозначили как «реактивных» и «анергичных» больных, соответственно. Критерием отнесения в группу «анергичных» больных слу
жило более чем двукратное снижение пролиферации в культурах анти-CD3-стимулирвоанных МНК больных по сравнению со средним нормативным уровнем здоровых доноров (34730 ± 1950 имп./мин, n = 50). Таким образом, индивидуальные значения aнти-CD3-индуцированного пролиферативного ответа в группе «анергичных» пациентов варьировали в диапазоне 830-16636 имп./мин, составляя в среднем 13008 ± 1821 имп./мин (n= 11), в подгруппе «реактивных» больных — от 23599 до 70401 имп./мин (40125 ± 3883 имп./мин, n = 13).

Подпись: 			Больные	
Цитокины	Стимул	Доноры
(n=8)	«анергичные»
(n=8)	«реактивные»
(n=8)	Pu (1-2)
			1	2	
IL-2	0	2,0 ± 0,5	< 2,0	11 ± 8	
	aH^-CD3	11,5 ± 2,8	2,1 ± 0,9**	43 ± 13	0,01
IFNy	0	85 ± 31	42 ± 15	172 ± 99,9	
	aH^-CD3	828 ± 251	74 ± 7**	1471 ± 479	0,007
TNFa	0	561 ± 264	126 ± 92*	1266 ± 680	0,02
	aH^-CD3	1204 ± 217	227 ± 68*	3092 ± 616*	0,003
GM-CSF	0	< 2,0	< 2,0	< 2,0	
	aH^-CD3	13 ± 4,0	1,7 ± 0,32**	84 ± 30**	0,003
IL-4	0	1,6 ± 0,7	< 2,0	9 ± 6,0	
	aH^-CD3	4,0 ±1,0	< 2,0*	24 ± 8,0**	0,007
IL-5	0	< 2,0	< 2,0	< 2,0	
	aH^-CD3	15 ± 6,6	12 ± 7,6	213 ± 115*	0,01
IL-13	0	< 2,0	< 2,0	< 2,0	
	aH^-CD3	16 ± 4,0	12 ± 3,0	149 ± 65**	0,008
IL-10	0	2,9 ± 0,95	12 ± 7,0	105 ± 43*	0,02
	aH^-CD3	32 ± 7,9	61 ± 11*	204 ± 48*	0,04
Примечание. * — ри <0,05; ** — ри <0,01; достоверность различий по сравнению с груп¬пой доноров (и-критерий Вилкоксона — Манна—Уитни).
Из данных табл. 2 видно, что у «анергичных» больных стимулированная продукция IL-2, IFNy, TNFa, GM-CSF и IL-4 была значимо снижена, в то время как уровень IL-10 был повышен почти в 2 раза. Угнетение продукции IL-2 на фоне пролиферативной ареактивности является классическим признаком Т-клеточной анергии [33]. Поэтому выявленное сочетанное снижение пролиферации и продукции IL-2 означало, что TM-клетки в исследуемой группе больных сепсисом подвержены анергии. В литературе описаны различные модели индукции анергии, при которых пролиферация Т-клеток и продукция IL-2 блокируются, в то время как уровень IL-4 не изменяется, либо усиливается [11, 32]. В наших исследованиях наряду с угнетением продукции IL-2 также выявлялось значимое снижение IL-4. Этот факт явно указывал на то, что анергии у пациентов с дефектом анти-СD3-индуцированного пролиферативного ответа подвержены как Th1, так и Th2.

Важно отметить, что состояние анергии, в зависимости от условий индукции, может иметь различные проявления. Так, в некоторых моделях TM-анергии продукция IFNy не меняется или снижается незначительно [32]. В то же время у обследованных нами больных анергия Th1 проявлялась не только дефектом продукции IL-2, но и угнетением других цитокинов с иммуностимулирующей активностью — IFNy, TNFa и GM-CSF, что, по-видимому, отражает глубину Т-клеточ- ных нарушений при септическом процессе [16]. В противоположность универсальному снижению Th1/иммуностимулирующих цитокинов, изменение №2-цитокинов не было столь однонаправленным. Несмотря на снижение IL-4, стимулированная продукция IL-5 и IL-13 оставалась в пределах нормативного диапазона. На этом фоне несколько неожиданным было увеличение продукции IL-10. Известно, что продуцентами IL-10 среди Т-клеток являются не только Th2, но и оха- растеризованные в последние годы анергичные CD4 Т-клетки с регуляторной активностью, т. н. регуляторные Т-клетки I типа (Tr1) [17, 22]. С этой точки зрения увеличение уровня IL-10 может отражать активность Tri-клеток, опосредующих свое действие через продукцию IL-10, и не быть связано непосредственно с функционированием №2-клеток.

Действительно, проведен- Таблица 2 ный корреляционный анализ между уровнями IL-10 и №2-цитокинами (IL-5 и IL-13) не выявил значимой взаимосвязи между анализируемыми параметрами (r = 0,32; p = 0,48 и r = 0,29; p = 0,53, соответственно).

Таким образом, у больных сепсисом дефект анти-CD3-индуцирован- ного пролиферативного ответа Т-клеток ассоциирован со снижением как №1/иммуностимулятор- ных цитокинов, так и №2-продуцируемого IL-4. При этом индукция анергии сопряжена с увеличением уровня IL-10, что, по-видимому, отражает накопление регуляторных Т-клеток с супрессорной активностью.

В группе больных с сохранным уровнем анти- CD3-индуцированного пролиферативного ответа
продукция ТМ/^2-цитокинов имела совершенно иной характер. Так, по сравнению с донорами концентрация TNFa и GM-CSF в стимулированных культурах МНК «реактивных» больных была значимо выше, в то время как умеренное возрастание IL-2 и №N7 было статистически недостоверным. Одновременно отмечалось существенное усиление продукции всех №2-цитокинов (1Ъ-4, IL-5, ^-13 и 1Ъ-10). Значительный прирост №2- цитокинов может быть обусловлен либо стимуляцией ТМ-клеток, способных продуцировать цитокины как первого, так и второго типа, либо активацией обеих популяций Т-хелперных клеток, либо переключением ТМ^1Ъ2. В исследованиях при тяжелой травме А.К. De et а1. показали, что у больных с сохранной пролиферативной реактивностью имеется усиление продукции как

и ^-10, так и ^N7 расцениваемое как активация ТМ и Th2 [14]. С другой стороны, в литературе имеются данные о доминировании №2 при травме [26]. При анализе полученных нами данных обращало на себя внимание то, что увеличение ТЫ- и №2-цитокинов было неравнозначным. Так, если средние значения №N7 у реактивных больных превышали таковые у доноров в 1,8 раза, то уровень продукции ^-4 и ^-13 — в 9 раз, ^-5 — в 14 раз, что указывало на явное смещение баланса в сторону №2-цитокинов.

Подпись: Тип и соотношение клеток	Доноры (n = 25)	Больные
		«анергичные»
(n = 6)	«реактивные»
(n = 6)
Th1 (CD4+ IFNy+)	23,4 ± 1,9	14,8 ± 4,1*	19,0 ± 5,0
Th2 (CD4+ IL-4+)	3,2 ± 0,3 5	0,93 ± 0,3*	2,6 ± 0,5
Th0 (CD4+ IFNY+ IL-4+)	2,1 ± 0,3	2,1 ± 0,3	1,6 ± 0,6
Соотношение Th1/Th2	8,5 ± 0,98	22,3 ±9,3**	8,3 ± 1,8
Ts1 (CD8+ IFNy+)	52,7 ± 4,2	27,2 ± 5,8*	42,8 ± 9,4*
Ts2 (CD8+ IL-4+)	1,99 ± 0,3	5,4 ± 1,7*	3,7 ± 0,6*
Ts0 (CD8+ IFNy+ IL-4+)	1,9 ± 0,3	4,3 ± 1,6	2,4 ± 0,7
Соотношение Ts1/Ts2	45,9 ± 11	6,4 ± 1,5**	13,8 ± 4,1*
Чтобы более точно оценить состояние цитоки- нового баланса, были сравнены индексы соотношения некоторых ТМ/^2-цитокинов в исследуемой группе с таковыми у здоровых доноров. По сравнению со здоровыми донорами у пациентов из группы «реактивных» больных отмечалось достоверное снижение индексов ^-2/^-4 (1,6 ± 0,27 vs

± 1,6; ри < 0,05), ^-2/^-5 (0,6 ± 0,16 vs 2,6 ± 1,6; ри < 0,05) и №N7/^-4 (85 ± 23 vs 403 ± 1,6; ри < 0,05), что позволяло предполагать наличие у них ТЫ^^2 переключения. Для сравнения, у «анергичных» пациентов соотношения ^-2/^-4 и ^-2/

IL-5 значимо не изменялись, однако индекс №N7/^-4 был также достоверно снижен (98 ±3 vs 403 ± 1,6; ри < 0,05), что не исключает изменения баланса Т-клеток I и II типа и у больных со сниженной пролиферативной активностью.

Внутриклеточная экспрессия цитокинов CD4 и CD8 Т-лимфоци- тами у больных сепсисом

Следует отметить, что использование культур МНК, стимулированных через Т-клеточный рецептор анти-CD3-антителами, для анализа продукции ТЫ/^2-цитокинов не позволяет в строгом смысле утверждать, что секреция цитокинов в этих условиях опосредована исключительно популяцией T-хелперных клеток. Как известно, сходный спектр цитокинов способны продуцировать и CD8 Т-лимфоциты. При этом, по аналогии с Th1/Th2 CD8, Т-клетки также характеризуются дихотомией, и, в зависимости от профиля продуцируемых цитокинов среди них выделяют ци- тотоксические/супрессорные CD8 Т-клетки I и II типа (Ts1/Ts2) [27, 31]. Чтобы исследовать субпо- пуляционную принадлежность клеток, причастных к дефекту ТЫ/^2-цитокинов у «анергичных» больных и доминированию №2/иммуносуп- рессорных цитокинов в группе «реактивных» пациентов, на следующем этапе было проведено исследование содержания Th0-, Th1- и №2-клеток путем определения CD4, лимфоцитов с внутриклеточной экспрессией IL-4+IFNy IFN7 или IL-4, соответственно. Аналогичным образом (по наличию внутриклеточного IFNy IL-4 или их комбинации) были идентифицированы субпопуляции CD8 Т-клеток, включающие Ts1, Ts2 или их предшественники (Ts0).

Как видно из данных табл. 3, у здоровых доноров приблизительно четвертая часть CD4 Т-кле- ток и половина CD8 Т-клеток экспрессировала внутриклеточный IFN7, в то время как количество IL-4-позитивных клеток в популяции CD4- и CD8-лимфоцитов составило всего 3 и 2 %, соответственно. Таким образом, количество Т-клеток с внутриклеточной экспрессией IFN7 существенно преобладало над численностью Т-лимфоцитов, экспрессирующих внутриклеточный IL-4, что полностью согласуется с данными об уровне спонтанной продукции соответствующих цитокинов в культуре in vitro (см. табл. 1). Причем преобладание IFNY-позитивных клеток над IL-4-содержа- щими лимфоцитами в популяции CD8-цитоток- сических/супрессорных клеток было более выражено, чем в популяции CD4 T-хелперных клеток (соотношение Ts1/Ts2 и Th1/Th2 составляло ±11 и 8,5 ± 0,98, соответственно).

В группе «анергичных» больных регистрировалось одновременное снижение как IFNy-, так и IL-4-содержащих СD4 Т-клеток. В совокупности с полученными данными о снижении продукции IFNy и IL-4 этот факт однозначно свидетельствовал о том, что у больных с дефектом пролиферативного ответа Т-лимфоцитов на анти-CD3-сти- муляцию анергии подвержены обе субпопуляции Т-хелперных клеток (Th1 и Th2). Характерно, что соотношение Th1/Th2 в этой группе больных не только не снижалось, а наоборот, возрастало за счет более выраженного дефицита Th2. Таким образом, подверженные анергии Т-клетки не имели признаков смещения баланса в сторону Th2.

Изменения в популяции CD8+ Т-клеток имели несколько иной характер. Снижение IFNy-позитивных клеток было сопряжено с увеличением IL-4-содержащих лимфоцитов и выраженным уменьшением соотношения Ts1/Ts2-клеток, что указывало на Ts1^Ts2 переключение. Возможно, этим феноменом объясняется и выявленное у «анергичных» больных снижение уровня продукции и индекса соотношения IFNy/IL-4.

В группе «реактивных» больных относительное содержание IFNy- и IL-4-содержащих CD4 Т-кле- ток и их соотношение оставалось сохранным. В то же время в популяции CD8 Т-клеток наблюдалось достоверное снижение соотношения Ts1/Ts2 за счет уменьшения IFNy+ и увеличения IL-4+CD8 Т-клеток. Количество Ts0 при этом значимо не менялось. В совокупности с данными о повышенной продукции IL-4, IL-5, IL-13 и IL-10 полученные результаты свидетельствуют о преобладании активности Ts2-клеток в подгруппе «реактивных» больных сепсисом.

Таким образом, у больных с дефектом пролиферативной активности Т-клеток снижение продукции IL-2, IFNy и IL-4 обусловлено анергией Th1 и Th2, в то время как усиление продукции №2/иммуносупрессорных цитокинов у больных с сохранной пролиферацией — Ts1^Ts2 переключением.

Нарушение функций Т-клеток у больных сепсисом в виде снижения продукции IL-2 впервые было описано в 1984 г. J. Wood [38]. Впоследствии дефект продукции IL-2 и пролиферативной активности Т-клеток при системном воспалительном ответе инфекционного и неинфекционного ге- неза был выявлен многими авторами, однако, как отмечалось, не у всех больных и не на все активирующие стимулы [6, 28]. Неоднозначно интерпретировались и механизмы угнетения функциональной активности Т-клеток. Так, рядом авторов было продемонстрировано, что при тяжелой травме и сепсисе наблюдается снижение уровня Th1- и увеличение №2-цитокинов, причем нормализация цитокинового баланса у больных сепсисом ассоциируется с благоприятным прогнозом [19, 23, 26, 39]. Данные изменения интерпретируются как результат Th1^Th2 переключения. В то же время J. Muret et al. выявили у больных сепсисом одновременное снижение КонА-стимули- рованной продукции IL-2, IL-5 и IL-10 и расценили это как состояние анергии Th1 и Th2 [28]. Аналогичное заключение было сделано при исследовании больных с тяжелой травмой. Дефект пролиферативного ответа Т-клеток у этой категории больных также ассоциировался с подавлением продукции IL-2 и IL-4, что позволило авторам сделать предположение об анергии Т-клеток в качестве ведущей причины Т-клеточных нарушений [14]. Состояние анергии Т-клеток было также выявлено C.D. Heidecke et al. у больных с абдоминальным сепсисом, однако снижение продукции TM-цитокинов было изолированным и не сопровождалось изменением уровня №2-цитокинов [18]. Важно отметить, что в подавляющем большинстве этих работ удельный вклад CD4 и CD8 Т-клеток в нарушение цитокинового баланса зачастую оставался не изученным. Изменение профиля цитокинов традиционно связывалось исключительно с Th1/Th2-клетками, хотя хорошо известно, что СD8 Т-лимфоциты также включают оп- позитные по спектру цитокинов субпопуляции (Ts1/Ts2) и могут существенно влиять на баланс цитокинов.

В настоящей работе мы впервые провели одновременное исследование продукции ТМ/^2-ци- токинов (TNFa, IFNy, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, GM-CSF) и относительного содержания Th1/Th2- и Ts1/Ts2-клеток у больных с хирургическим сепсисом, в том числе в подгруппах пациентов со сниженным и сохранным уровнем анти-CD3-индуци- рованного пролиферативного ответа Т-клеток. Полученные данные позволили сделать ряд важных заключений и частично объяснить имеющиеся в литературе противоречия по поводу механизмов Т-клеточных дисфункций у больных сепсисом. В частности, нами установлено, что выраженные изменения продукции Th1- и №2-цитокинов имеются у всех больных с хирургическим сепсисом. Однако у больных со сниженным и сохранным уровнем пролиферации Т-клеток эти изменения носят принципиально различный характер.

Больные со сниженным анти-CD3-индуциро- ванным пролиферативным ответом характеризуются низким уровнем продукции ТЫ/иммуно- стимуляторных цитокинов (IL-2, IFNy, TNFa и GM-CSF) и №2-ассоциированного IL-4, что свидетельствует об анергии Т-клеток, продуцирующих цитокины I и II типа. Ранее нами было показано, что угнетение пролиферации Т-клеток у больных сепсисом сопряжено со снижением продукции IL-2, не коррелирует с повышенным апоп-
тозом и ассоциировано с блоком клеточного цикла, что позволило предположить важную роль анергии в развитии Т-клеточного дефекта при сепсисе [5, 6]. Кроме того, выявление блока клеточного цикла именно в популяции CD4, но не CD8 Т- клеток указывало на то, что анергии при сепсисе подвержены преимущественно СD4 Т-лимфоциты [5]. Поэтому выявленное снижение уровня ^-2, ^N7 и ^-4 мы расценили как анергию №1 и №2. Прямым подтверждением тому послужили результаты исследования количества ^-4- и ^^-экспрес- сирующих клеток, согласно которым у больных исследуемой группы отмечалось одновременные снижение относительного содержания CD4 Т-клеток, экспрессирующих как ^-4, так и №N7.

Развитие анергии при сепсисе представляется теоретически вполне обоснованным. Неполноценность костимуляторного сигнала как причина анергии может быть обусловлено, например, многократной рестимуляцией клеток антигеном или представлением антигена «непрофессиональными» антигенпрезентирующими клетками [32]. Дефект костимуляторных молекул на моноцитах/макрофагах может быть индуцирован повышенным апоптозом [1, 20]. Так, апоптотические клетки продуцируют иммуносупрессорные факторы [37] и после фагоцитоза макрофагами способны ингибировать экспрессию и продукцию костимуляторных молекул антигенпрезентиру- ющими клетками [15]. Наконец, состояние анергии может быть индуцировано активацией Т- клеток измененными пептидами, образующимися в результате деградации собственных белков в процессе апоптоза [19, 30]. При этом, в зависимости от особенностей индукции (тип пре- зентирующих клеток, дозы антигена, экспериментальные условия), анергия может развиваться в различных субпопуляциях Т-клеток и характеризоваться фенотипическим и функциональным разнообразием [11, 16, 32, 35].

Особенностью выявленной нами у больных сепсисом анергии является, прежде всего, то, что она носит распространенный характер, т.е. анергии подвержены как №1-, так и №2-клетки. При этом ^^анергия проявляется снижением не только ^-2, но и других цитокинов — №N7, TNFa, GM- CSF, что свидетельствует о большей выраженности Т-клеточного дефекта [16]. Это имеет принципиальное значение, поскольку TNFa и GM-CSF играют важную роль в дифференцировке и созревании дендритных клеток, инициирующих запуск специфического иммунного ответа, а также в поддержании жизнеспособности и функциональной активности нейтрофилов, опосредующих реакции врожденного иммунитета [24, 34].

В то же время анергия №2 проявляется исключительно в снижении ^-4 при сохранной продукции других №2-цитокинов — ^-5 и ^-13. Более того, несмотря на сниженную продукцию ^-4, уровень ^-10 у больных с анергией оказался повышенным. Характерно, что продукция ^-10 не коррелировала с другими №2-цитокинами (^-5, ^-13) и, т. о., вряд ли была связана с функционированием №2 или Ts2. Поэтому данную ситуацию мы расценили как еще одну особенность анергии при сепсисе, связанную с накоплением в циркуляции регуляторных CD4 Т-клеток с супрессорной активностью ^г1). Действительно, индукция анергии, по данным ряда авторов, сопровождается приобретением анергичными клетками супрессорной активности [11, 25, 36]. Причем генерация ^1 не является чисто витральным феноменом. Накопление ^^клеток и их причастность к иммунной недостаточности описаны при ряде хронических инфекций бактериальной и вирусной природы [8, 10, 21]. Не исключено, что именно присутствие ^-10-продуцирующих регуляторных клеток определяет своеобразие №1-анергии, детерминируя снижение не только ^-2, но и других Th1/иммуностимуляторных цитокинов (№N7, TNFa, GM-CSF).

В отличие от CD4 Т-клеток, интерпретация изменений в субпопуляции CD8 Т-лимфоцитов у больных со сниженным пролиферативным ответом остается достаточно проблематичной. Выявленное снижение количества IFNY-позитивных клеток в популяции CD8 лимфоцитов ассоциировалось с увеличением содержания ^-4-экс- перссирующих лимфоцитов и, вследствие этого, со снижением соотношения CD8+IFNY+/ CD8+IL-4+, что указывало на возможность переключения Ts1^Ts2. Учитывая также данные о снижении уровня продукции и индекса соотношения IFNY/IL-4, а также более ранние результаты об отсутствии блока клеточного цикла в популяции CD8 Т-клеток у «анергичных» больных [5], возможность переключения Ts1^Ts2 представляется вполне вероятной. Однако тогда остается не ясным, почему доминирование Ts2 клеток не приводит к усилению продукции ^-4 или ^-5/^-13. Таким образом, вопрос о том, что же происходит в популяции CD8 Т-клеток — Ts1^Ts2 переключение или индукция анергии, остается открытым. Возможно, определенный вклад в изменение функциональной активности Т-клеток, включая и популяцию CD8 Т-лим- фоцитов, вносят регуляторные Т-клетки. Увеличение количества естественных регуляторных Т-клеток с фенотипом CD4+CD25+ у больных с анергией было продемонстрировано нами в предшествующих исследованиях [5]. Из настоящей работы следует, что это, по-видимому, не единственный тип регуляторных Т-клеток с супрессорной активностью, который имеет отношение к патогенезу иммунной недостаточности при сепсисе.


Пациенты с сохранной пролиферацией отличались повышенной продукцией TNFa, GM-CSF и всей группы №2-цитокинов (ГЬ-4, IL-5, ^-13 и IL-10). Причем возрастание продукции цитокинов ассоциировалось со смещением баланса в сторону Th2, о чем свидетельствовало снижение индексов соотношения ТЫ/^2-цитокинов (^-2/^-4, IL-2/IL-5 и №N7/^-4). При этом анализ внутриклеточной экспрессии №N7 и ^-4 показал, что увеличение продукции цитокинов не связано с активацией предшественников ТМ/^2 или Ts1/Ts2, поскольку увеличения Th0 и Ts0 не наблюдалось, а обусловлено Т51^Тб2 переключением.

Таким образом, даже при сохранном пролиферативном ответе Т-клеток у больных с хирургическим сепсисом имеется смещение баланса в сторону Th2/Ts2/иммуносупрессорных цитоки- нов. Невозможно полностью исключить роль в этом CD4 Т-клеток, поскольку отсутствие достоверных изменений в количестве и соотношении №N7- и ^-4-экспрессирующих CD4 Т-клеток еще не означает отсутствия изменений в уровне продукции цитокинов. Однако можно с уверенностью утверждать, что в смещении цитокинового баланса значительную роль играют CD8 Т-клетки. Полученные результаты согласуется с данными S. Zedler [39], который показал, что именно за счет ^-4-продуцирующих CD8 Т-клеток происходит смещение баланса в сторону доминирования ^-4 при ожоговой травме [39].

Какой из выявленных дефектов (ТМ/^2-анер- гия или Т51^Тб2) является более тяжелым нарушением при сепсисе? Согласно полученным нами данным при сепсисе [1, 5] и данным А.К. De et а1. при травме [14], развитие анергии у больных со сниженным пролиферативным ответом Т-клеток ассоциировано с большей тяжестью системного воспалительного ответа, в частности, с развитием СПОН и более высоким уровнем летальности. Проспективные наблюдения в подгруппах «анер- гичных» и «реактивных» больных в настоящем исследовании выявили сходные тенденции. Так, при всех прочих сопоставимых параметрах (возраст, пол, локализация очага инфекции, сроки обследования, качество и объем интенсивной и антибактериальной терапии) частота выявления тяжелого сепсиса/СПОН у «анергичных» больных была выше, чем у «реактивных» пациентов (72,7 vs 38,5 %). Кроме того, уровень 28-суточной летальности в группе «анергичных» больных практически в 2 раза превысил таковой в оппо- зитной подгруппе (27,3 vs 15,4 %).

Авторы выражают признательность Региональному общественному фонду содействия отечественной медицине за поддержку в проведении исследований.

 

 

ЛИТЕРАТУРА

 

Норкин М.Н., Леплина О.Ю., Тихонова М.А. и др. Роль апоптоза и анергии Т-клеток в патогенезе гнойно-септических заболеваний // Мед. иммунол. —

— Т. 2, № 1. — С. 35-42.

Останин А.А., Леплина О.Ю., Тихонова М.А. и др. Цитокин-опосредованные механизмы развития системной иммуносупрессии у больных с гнойно-хирургической патологией // Цитокины и воспаление. — 2002. — Т. 1, № 1. — С. 38-45.

Останин А.А., Леплина О.Ю., Шевела Е.Я. и др. Оценка цитокинового профиля у больных с тяжелым сепсисом методом проточной флюориметрии (Bio- PLex анализа) // Цитокины и воспаление. — 2004. — Т. 3, № 1. — С. 20-27.

Пинегин Б.В., Андронова Т.М., Юдина Т.И. Иммунодиагностика и иммунотерапия хирургических инфекций // Int. J. ImmunorehabiLitation. — 1998. — № 10. — С. 86-99.

Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Тихонова М.А. и др. Феномен Т-клеточной анергии при хирургическом сепсисе // Мед. иммунол. — 2003. — Т. 5, № 5-6. — С. 529-538.

Черных Е.Р., Норкин М.Н., Леплина О.Ю. и др. Апоптоз и анергия периферических Т-лимфоцитов при гнойно-септической патологии // Мед. имму- нол. — 1999. — Т. 1, № 5. — С. 45-51.

AyaLa A., DeoL Z.K., Lehman D.L. et aL. Polymicrobial sepsis but not Low-dose endotoxin infusion causes decreased spLenocyte IL-2/IFN-g reLease whiLe increasing IL-4/IL-10 production // J. Surg. Res. — 1994. — VoL. 56. — P. 579-585.

BLuestone J.A., Abbas A.K. NaturaL versus adaptive reguLatory T ceLLs // Nat. Rev. ImmunoL. — 2003. — VoL. 3. — P. 253-257.

Bone R.C., BaLk R.A., Cerra F.B. et aL. ACCP/SCCM consensus conference. Definitions for sepsis and organ faiLure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis // Chest. — 1992. — VoL. 101. — P. 1644-1655.

Boussiotis V.A., Tsai E.Y., Yunis E.J. et aL. IL-10-producing T ceLLs suppress immune responses in anergic tubercuLosis patients // J. CLin. Invest. — 2000. — VoL. 105. — P. 1317-1325.

Buer J., Lanoue A., Franzke A. et aL. InterLeukin 10 secretion and impaired effector function of major histocompatibiLity compLex cLass Il-restricted T ceLLs anergized in vivo // J. Exp. Med. — 1998. — VoL. 187. — P. 177-183.

Carson R., VignaLi D. SimuLtaneous quantitation of fifteen cytokines using a muLtipLexed fLow cytometric assay // J. ImmunoL. Meth. — 1999. — VoL. 227. — P. 41-52.

Curfs J.H.A.J., Meis J.F.G.M., Hoogkamp-Korstanje J.A.A. A primer on cytokines: sources, receptors, effects and inducers // CLin. MicrobioL. Rev. — 1997. — VoL. 10, № 4. — P. 742-780.

De A.K., Kodys K.M., Pellegrini J. et al. Induction of global anergy rather than inhibitory Th2 lymphokines mediates post-trauma T-cell immunodepression // Clin. Immunol. — 2000. — Vol. 96. — P. 52-66.

Fadok V.A., Bratton D.L., Rose D.M. et al. A receptor for phosphatidylserine- specific clearance of apoptotic cells // Nature. — 2000. — Vol. 405. — P. 85-90.

Groux H., Bigler M., de Vries J.E., Roncarolo M.G. Interleukin-10 induces a longterm antigen-specific anergic state in human CD4 T cells // J. Exp. Med. —

— Vol. 184. — P. 19-29.

Groux H., O'Garra A., Bigler M. et al. Generation of a novel regulatory CD4 T-cell population, which inhibits antigen-specific T-cell responses // Nature. —

— Vol. 389. — P. 737-742.

Heidecke C.D., Hensler T., Weighardt H. et al. Selective defects of T lymphocyte function in patients with lethal intraabdominal infection // Am. J. Surg. — 1999. — Vol. 178. — P. 288-292.

Hotchkiss R.S., Karl I.E. The pathophysiology and treatment of sepsis // N. Engl. J. Med. — 2003. — Vol. 348, № 2. — P. 138-150.

Hotchkiss R.S., Tinsley K.W., Swanson P.E. Sepsis-induced apoptosis causes progressive profound depletion of B and CD4+ T Lymphocytes in humans // J. Immunol. — 2001. — Vol. 166. — P. 6952-6963.

Iwashiro M., Messer R.J., Peterson K.E. et al. Immunosuppression by CD4 regulatory T cells induced by chronic retroviral infection // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2001. — Vol. 98. — P. 9226-9231.

Jonuleit H., Schmitt E., Schuler G., Knop J., Enk A.H. Induction of interleukin 10-producing, nonproliferating CD4 T cells with regulatory properties by repetitive stimulation with allogeneic immature human dendritic cells // J. Exp. Med. — 2000. — Vol. 192. — P. 1213-1222.

Lederer J.A., Rodrick M.L, Mannick J.A. The effects of injury on the adaptive immune response // Shock. — 1999. — Vol. 11. — P. 153-159.

Lee A., Whyte M.K.B., Haslett C. Inhibition of apoptosis and prolongation of neutrophil functional longevity by inflammatory mediators // J. Leukoc. Biol. — 1993. — Vol. 54. — P. 283-288.

5. Lombardi G., Sidhu S., Batchelor R., Lechler R. Anergic T cells as suppressor cells in vitro // Science. — 1994. — Vol. 264. — P. 1587-1592.

Mack V.E., McCarter M.D., Naama H.A., Calvano S.E., Daly J.M. Dominance of T helper 2 type cytokines after severe injury // Arch. Surg. — 1996. — Vol. 131, № 12. — P. 1303-1308.

Mosmann T.R., Sad S. The expanding universe of T-cell subsets: Th1, Th2 and more // Immunol. Today. — 1996. — Vol. 17, № 3. — P. 138-146.


Muret J., Marie C., Fitting C., Payen D., Cavaillon J-M. Ex vivo T-lymphocyte derived cytokine production in SIRS patients is influenced by experimental procedures // Shock — 2000. — Vol. 13. — P. 169-174.

Oberholzer A., Oberholzer C., Moldawer L.L. Sepsis syndromes: understanding the role of innate and acquired immunity // Shock. — 2001. — Vol. 16. — P. 83-96.

Pellegrini J.D., De A.K., Kodys K. et al. Relationships between T lymphocyte ap- optosis and anergy following trauma // J. Surg. Res. — 2000. — Vol. 88. — P. 200-206.

31.Salgame P., Abrams J.S., Clayberger C. et al. Differing lymphokine profiles of functional subsets of human CD4 and CD8 T cell clones // Science. — 1991. — Vol. 254. — P. 279-282.

Schwartz R.H. Models of T cell anergy: is there a common molecular mechanism? // J. Exp. Med. — 1996. — Vol. 184. — P. 1-8.

Schwartz R.H. T cell anergy // Annu. Rev. Immunol. — 2003. — Vol. 21. — P. 305-334.

34.Steinman R.M., Hawiger D., Nussenzweig M.C. Tolerogenic dendritic cells // Annu. Rev. Immunol. — 2003. — Vol. 21. — P. 685-711.

5. Taams L.S., van Eden W., Wauben M.H.M. Dose-dependent induction of distinct anergic phenotypes: multiple levels of T-cell anergy // J. Immunol. — 1999. — Vol. 162. — P. 1974-1981.

Taams L.S., Wauben M.H.M. Anergic T cells as active regulators of the immune response // Hum. Immunol. — 2000. — Vol. 61. — P. 633-639.

Voll R.E., Herrmann M., Roth E.A. et al. Immunosuppressive effects of apop- totic cells // Nature. — 1997. — Vol. 390. — P. 350-351.

Wood J., Rodrick M., O'Mahony J. et al. Inadequate interleukin 2 production. A fundamental immunological deficiency in patients with major burns // Ann. Surg. — 1984. — Vol. 200. — P. 311-320.

Zedler S., Bone R.C., Baue A.E., Donnersmarck G.H., Faist E. T-cell reactivity and its predictive role in immunosupression after burns // Crit. Care Med. — 1999. — Vol. 27, № 1. — P. 66-73.

 

 

 



загрузка...