загрузка...
 
ЗАВИСИМОСТЬ СКОРОСТИ РЕАКЦИИ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ ФЕРМЕНТА
Повернутись до змісту

ЗАВИСИМОСТЬ СКОРОСТИ РЕАКЦИИ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ ФЕРМЕНТА

Эксперименты in vitro позволяют изучать ферментативную реакцию в стандартных условиях, варьируя тот или иной параметр при соблюдении постоянства остальных. В частности, можно варьировать количество фермента, обеспечив постоянную (но достаточно высокую) концентрацию субстрата. Такие опыты показывают, что скорость превращений субстрата прямо пропорциональна концентрации фермента (его количеству в инкубационной смеси стандартного объема). Это проявляется линейностью графика зависимости V от [Е] в довольно большом диапазоне концентраций фермента (рис. 4-10).

При очень высоких значениях [Е] нередко наблюдается отклонение от линейности. Не вдаваясь в причины этого, следует отметить главное: для получения воспроизводимых результатов измерять скорость реакции следует только при таких концентрациях фермента, которые не выходят за рамки линейной зависимости. Поэтому, начиная работу с каким- либо ферментом (или биопробой, содержащей фермент, - например, с сывороткой крови), всегда предварительно следует экспериментально установить тот диапазон, в пределах которого скорость реакции пропорциональна концентрации данного фермента. Это позволяет в дальнейшем измерять скорость реакции только при одной, произвольно взятой концентрации фермента (желательно - в средней части линейного диапазона). Разделив измеренную при этом скорость на количество (концентрацию) фермента, получают параметр, именуемый активностью фермента. По сути, это — тангенс угла наклона линейного участка к абсциссе (тангенс угла а на рис. 4-10): он однозначно характеризует положение всего линейного участка на таком графике.

Рис. 4-10. Зависимость скорости ферментативной реакции (и) от концентрации фермента {[Е!) при достаточно высокой концентрации субстрата.

Итак, активность фермента - это скорость ферментативной реакции в расчете па единицу количества фермента (в стандартном объеме инкубационной смеси)

Измерять активность фермента можно в разных единицах, в зависимости от того, в каких единицах представлены убыль субстрата, время и количество фермента. Очень часто количество фермента выражают в миллиграммах белка. Тогда единица активности может выглядеть, например, так: мкм0ль/(мин-мг). Это означает: мкмоли субстрата, превращаемого за

минуту в расчете на 1 мг белкового препарата, содержащего данный фермент. По мере фракционирования биопробы с целью удаления «посторонних» белков регистрируемые величины такой удельной активности фермента будут возрастать. Это позволяет судить об эффективности каждой из процедур, очистки изучаемого фермента.

Оптимальной единицей является молекулярная активность фермента. Она означает количество молекул субстрата, превращаемых одной молекулой фермента за 1 мин при 30 °С в условиях, наиболее благоприятных для данного фермента (включая оптимальную концентрацию субстрата). Естественно, в таких единицах можно выражать активность лишь тех ферментов, для которых известна молекулярная масса. Зато становится возможным не только сравнивать активность одного и того же фермента из разных источников, но и сопоставлять каталитическую эффективность совершенно разных ферментов. Так, молекулярная активность (прежнее обозначение - число оборотов) каталазы эритроцитов человека составляет 1 200 000. Это значит, что одна молекула этого фермента за 1 мин при 30 °С расщепляет 1,2 млн молекул пероксида водорода (до воды и молекулярного кислорода). Среди других наиболее активных ферментов можно назвать уже упоминавшуюся ацетилхолинэстера- зу (1 500 000), а также карбоангидразу, которая катализирует обратимую реакцию превращения углекислого газа и воды в угольную кислоту (ее молекулярная активность достигает 60 000 000 !).

Многие десятилетия понятие «активность фермента» использовали как синоним термина «количество фермента» (или его концентрация) в исследуемом биологическом объекте. Действительно, если активность какого-то фермента в расчете на 1 мл исследуемой сыворотки крови у одного человека вдвое ниже, чем у другого, то из линейности графика на рис. 4-10 следует, что у первого из них сыворотка содержит вдвое меньше фермента, чем у второго. Строго говоря, трактовка не вполне корректна, ибо активность — это показатель не количества фермента, а его эффективности (которая может меняться). Хотя и до сих пор нередко (даже в учебниках) пишут «активность повышена», имея в виду повышение концентрации фермента (например, в сыворотке крови).

Чтобы обеспечить однозначность терминов, было решено ввести понятие «количество фермента» и измерять его скоростью катализируемой реакции, измеренной при 30°С и прочих оптимальных значениях pH и других параметров среды. Международная система единиц (СИ) рекомендует в качестве такой единицы катал (кат).

Катал — это то количество фермента, которое преобразует 1 моль субстрата за 1 секунду.

Для биологических объектов эта единица измерения чрезмерно велика Поэтому используют в миллиард раз меньшую мерку - нано- катал. Однако, обычно применяют более удобную единицу - юнит (в зарубежной литературе

ипк, что в английском и означает «единица»).

Юнит - это то количество фермента, которое преобразует 1 мкмоль субстрата за

мин.

Таким образом, если в расчете на 1 мл исследуемой сыворотки крови некая ферментативная реакция протекает со скоростью 1,

или 5 мкмоль/мин, то это означает, что в 1 мл этой сыворотки содержится 1, 2 или 5 юнит данного фермента, а его концентрация составляет соответственно 1, 2 и 5 юнит/мл.

Легко подсчитать соотношение разных единиц:

юнит = 16,67 нанокатал;

нанокатал = 0,06 юнит.

Очевидно: чем больше молярная масса фермента (при сходстве чисел оборотов), тем больше весовых единиц его (например, миллиграммов) приходится на 1 юнит (или 1 кат).

Итак, измерение скорости ферментативной реакции позволяет количественно оценить содержание соответствующего фермента в анализируемом биологическом материале. Такие измерения невозможно произвести в живом объекте, - они осуществимы только в опытах in vitro. При этом регистрируется функционально полноценный фермент, но не его генетически дефектные формы, не обладающие полноценной ферментативной активностью. Они могут быть определены иммунологическими методами. которые, однако, обычно не позволяют оценить функциональную активность фермента (да и других белков тоже).



загрузка...