загрузка...
 
§4. Разделение фрагментов ДНК по размерам и обнаружение фрагментов с определенной последовательностью нуклеотидов
Повернутись до змісту

§4. Разделение фрагментов ДНК по размерам и обнаружение фрагментов с определенной последовательностью нуклеотидов

Для первоначального разделения полученных в результате действия рестриктаз фрагментов ДНК используют метод, получивший название гель-электрофорез.

Метод основан на том, что молекулы ДНК в растворе солей определенной концентрации имеют на своей поверхности отрицательные заряды. При пропускании через раствор постоянного электрического тока хаотическое (броуновское) движение молекул меняется на направленное перемещение их к положительно заряженному электроду. Если такое воздействие осуществляется не в обычном водном растворе, а в желеобразной массе застывшего 1% раствора агарозы, молекулы ДНК различного размера движутся с различными скоростями - чем длиннее молекула, тем медленнее она движется, поскольку испытывает больше соударений с образовавшими гель частицами агарозы.

Агароза - это особым образом обработанный полисахарид агар-агар, получаемый из красных водорослей. Отличительной чертой этого вещества является его способность даже в небольших (менее одного процента) концентрациях при температурах ниже 40° С образовывать в водных растворах сплошную плотную массу, обычно называемую гель. Раствор агарозы готовят путем растворения ее в воде при температурах от 70° С до 100° С, а затем наливают еще не остывший раствор в специальную емкость с ровным и гладким дном. При остывании раствор желируется и получается определенной толщины пластинка. Раствор молекул ДНК вносят в заранее подготовленные в этой пластинке углубления (лунки), которые расположены у одного из концов пластинки, и всю пластинку помещают в специальной камере с электродами. Камеру заполняют водным раствором солей и подключают к генератору постоянного электрического тока таким образом, чтобы ток проходил через пластинку геля. Время воздействия электрического тока выбирают такое, чтобы все молекулы ДНК успели переместиться из лунки в толщу геля, но даже самые мелкие из них не прошли через весь гель.

При перемещении фрагментов ДНК различного размера из одного и того же места (лунки), одинаковые по размерам молекулы движутся с одинаковой скоростью. Поэтому через некоторое время в толще геля образуются скопления одинаковых по размерам молекул, но они будут располагаться в разных участках пластинки. После окончания электрофореза пластинку окрашивают способным связываться с ДНК красителем, что делает видимыми те участки, в которых расположились молекулы.

В тех случаях, когда просто требуется отобрать молекулы определенного размера, соответствующий участок пластинки вырезают и вымывают из него ДНК специальными растворами.

Размеры молекул ДНК можно выражать либо в специальных единицах молекулярной массы - дальтонах, либо, что делают гораздо чаще, в числе пар нуклеотидов или азотитстых оснований. В последнем случае принято после соответствующей цифры писать сокращение п.н. (синонимом является п.о.) или т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов (синоним - т.п.о.). Иногда в русскоязычных публикациях сохраняют английскую аббревиатуру, в этих случаях сокращению п.н. соответствует b (от англ. base - основание), а сокращению т.п.н. - kb (от англ. kilobase - тысяча оснований) Для того, чтобы получить конкретную цифру для фрагментов ДНК, размеры которых неизвестны, одновременно в этой же пластинке геля проводят электрофоретическое разделение молекул с уже известными размерами и сравнивают положение в геле изучаемых и эталонных молекул.

Но разделить ДНК на фрагменты - это только половина задачи. Хорошо бы еще и узнать, в каком из фрагментов находится интересующий исследователя ген. Ген - это определенная последовательность нуклеотидов в цепи ДНК, которая содержит информацию о той или иной молекуле белка или РНК. Если нуклеотидная последовательность для конкретного гена уже известна, существует возможность обнаружить ее в разделенных электрофорезом фрагментах. Эта возможность основана на том, что молекулы ДНК состоят из двух комплементарных цепей и при определенных условиях эти цепи могут быть отделены друг от друга. Например, если молекулы ДНК нагреть до температуры выше 70 °С, удерживающие две цепи водородные связи между азотистыми основаниями разрываются. Такая тепловая денатурация ДНК обратима - если температуру понизить, цепи объединяются вновь.

Зная об этом, и придумали метод гибридизации молекул ДНК, заключающийся в следующем. Полученные в результате действия рестриктаз и разделенные по размерам с помощью электрофореза фрагменты переносят на специальный нитроцеллюлозный фильтр, но таким образом, чтобы порядок их расположения в геле сохранялся и на фильтре. Это легко достигается наложением фильтра на гель и созданием условий для движения молекул в сторону фильтра. Затем фильтр в специальном растворе нагревают до температуры, при которой молекулы ДНК становятся однонитевыми, и вносят в раствор заранее подготовленные однонитевые фрагменты ДНК, последовательность нуклеотидов в которых соответствует конкретному гену. Но эти ДНК особые - их нуклеотиды содержат радиоактивные изотопы какого-либо входящего в нуклеотид химического элемента, чаще всего фосфора. После этого температуру понижают, и происходит ренатурация, т.е. восстановление двунитевых молекул. Часть таких молекул будет включать не исходные нерадиоактивные нити, а те, которые были специально внесены в раствор. Причем здесь проявит себя комплементарность - радиоактивные нити присоединятся к тем фрагментам ДНК, в которых и находится искомый ген. Далее фильтр тщательно отмывают от не связавшихся радиоактивных молекул, высушивают, и прикладывают к фотопластинке на несколько часов. После проявления фотопластинки на ней будут заметны темные пятна засвеченной радиоактивным излучением эмульсии. Сопоставив расположение пятен с расположением фрагментов ДНК в геле, легко установить, во фрагментах какого размера находится искомый ген. Именно эти фрагменты и используют в дальнейшей работе.

Вопросы к §4. 1. На каком свойстве молекул ДНК основан метод гель-электрофореза? 2. Подумайте, почему для электрофореза используют постоянный, а не переменный ток? 3. В каких единицах принято выражать размеры фрагментов ДНК? 4. Что необходимо сделать, чтобы определить размеры анализируемых фрагментов ДНК? 5. Каким способом можно узнать, в каком из фрагментов ДНК находится нужный ген?



загрузка...