загрузка...
 
§ 7. Особенности методического арсенала современной генетической инженерии.
Повернутись до змісту

§ 7. Особенности методического арсенала современной генетической инженерии.

Полимеразная цепная реакция

Теперь, когда вы уже знаете об основных принципах клонирования генов, следует остановиться на том, как развивались и совершенствовались методы, позволяющие использовать эти принципы.

Несмотря на то, что при описании генно-инженерных манипуляций с генетическим материалом почти всегда говорят так, будто речь идет об одной молекуле (например, «...плазмида была рестрицирована с помощью фермента ВатН1...» или «... фрагмент ДНК человека был интегрирован в плазмиду рВЯ322.»), под эти всегда подразумевается проведение химических реакций, в которых участвуют как минимум десятки или сотни тысяч молекул. Основополагающим фактором, обеспечивающим успех таких реакций, является уровень чистоты участвующих в реакциях соединений. Поэтому можно без преувеличения сказать, что современная молекулярная биология и генетическая инженерия - это, по сути, тонкая препаративная биохимия.

С одной стороны, применяемые в генетической инженерии ферменты - это белки со сложной пространственной структурой и высокой чувствительностью к условиям среды. Источником ферментов являются клетки живых организмов, состоящие из огромного множества различных молекул, в том числе и белковых. А для успешной работы они должны быть не только гомогенными и максимально очищенными препаратами, но и сохранять свою каталитическую активность при хранении и использовании. Поэтому для их выделения и очистки используются сложные, длительно протекающие и дорогостоящие химические методы. В середине 70-х годов 20 века первые генные инженеры испытывали в связи с этим значительные трудности, однако за несколько лет возникла и развилась специальная индустрия, предназначенная для обслуживания генноинженерных работ. В настоящее время специализированные фирмы производят не только полный набор необходимых ферментных препаратов, но и все остальные химические реактивы, используемые в генно-инженерных и молекулярно-биологических исследованиях. Кроме того, была разработана и производится специальная химическая посуда для проведения реакций в микрообъемах (из-за высокой цены реактивов все реакции стараются проводить с использованием минимальных количеств растворов) и дозаторы (микропипетки), позволяющие набирать растворы в объемах порядка 0,1 микролитра (микролитр - одна миллионная часть литра). Важно, что эта посуда сделана из химически инертных пластиков и используется, как правило, единожды - это позволяет избегать возможных загрязнений и тем самым максимально стандартизировать условия химических реакций.

С другой стороны, для успешного клонирования генетического материала необходимо иметь чистые препараты нуклеиновых кислот, выделенные из клеток конкретного вида организмов. Получать такие препараты приходится уже собственно генным инженерам, но в настоящее время для выделения нуклеиновых кислот из клеток животных, грибов, растений или бактерий производятся специальные наборы реактивов и приборы. При этом надо подчеркнуть, что техническое оснащение процессов выделения ДНК или РНК имеет не меньшее значение, чем химическое. На определенных этапах для этих процедур требуются гомогенизаторы тканей, устройства для механического или ультразвукового разрушения клеток, центрифуги с охлаждением, ультратермостаты, приборы для электрофореза и спектрофотометры.

Следует помнить, что нуклеиновые кислоты присутствуют в клетках в очень небольшом количестве, по сравнению, например, с белками или липидами, поэтому получать пригодные для генно-инженерных работ концентрации ДНК или РНК было не просто. Сейчас я с удовлетворением пишу в этом предложении слово «было», поскольку в последнем десятилетии 20-го века в методический арсенал молекулярной биологии и генетической инженерии вошел метод, который позволяет при очень малом количестве исходной ДНК получать нужные фрагменты (фактически, гены) в тех количествах, которые необходимы. Речь идет о так называемой полимеразной цепной реакции или сокращенно ПЦР.

Возможность осуществления полимеразной цепной реакции основана на нескольких важных предпосылках. Как известно, ДНК большинства организмов состоит из двух комплементарных друг другу нуклеотидных цепей. Именно благодаря этому в клетках происходит удвоение этих молекул или репликация. Одним из основных ферментов, участвующих в процессе репликации является полимераза, которая катализирует образование ковалентных связей между нуклеотидами, благодаря чему и получается нуклеотидная цепь. Как удалось установить, этот фермент может выполнять свою функцию не только в клетке, но и in vitro, что и послужило основой для разработки метода ПЦР. Еще одной важной деталью в функционировании полимеразы является то, что она может «строить» новую цепь только начиная от двунитевого участка молекулы ДНК. Кроме того, известно, что водородные связи между азотистыми основаниями нуклеотидов двух цепей исчезают при температурах выше 90 °С и спонтанно, без катализа, образуются при температурах 50- 60 °С.

И еще одна важная деталь - увеличить количество нужного фрагмента ДНК (или, как говорят в молекулярной биологии, амплифицировать фрагмент) возможно только тогда, когда известно расположение 10-15 нуклеотидов в его начале и стольких же в конце. Знать это необходимо для того, чтобы искусственно, химическим путем, синтезировать короткие однонитевые цепочки ДНК, которые называют олигонуклеотидами или праймерами для ПЦР. Праймеров для амплификации одного фрагмента необходимо два и они практически всегда будут разными. Чтобы стало понятнее, о чем идет речь, рассмотрим условный пример. Допустим, в начале и конце фрагмента имеются следующие последовательности:

5'-А-А-Г-Ц-Т-Т-Ц-Ц-А-Г Ц-Ц-Ц-Г-Г-Г-А-Т-А-Ц-А-Ц-3'

З'-Т-Т-Ц-Г-А-А-Г-Г-Т-Ц Г-Г-Г-Ц-Ц-Ц-Т-А-Т-Г-Т-Г-5'

(Здесь и далее точками в наших схематичных изображениях молекул обозначены любые другие нуклеотиды, которые располагаются в этих же цепях).

Тогда праймер для начала будет 5’А-А-Г-Ц-Т-Т-Ц-Ц-А-Г3’, а праймер для конца фрагмента будет 3Т-Г-Г-Ц-Ц-Ц-Т-А-Т-Г-Т-Г5’. Необходимость использования двух праймеров связана с тем, что полимеразы всегда присоединяют новые нуклеотиды только к 3’-концу цепи. Здесь есть резон подчеркнуть, что именно это свойство полимераз и позволяет при проведении ПЦР направленно проводить многократное копирование только нужного фрагмента.

Как же это происходит? Для начала надо иметь хотя бы одну двунитевую молекулу той ДНК, фрагмент которой необходимо амплифицировать. Очень важно также, чтобы в исходном препарате была ДНК только изучаемого организма, поскольку для полимеразы безразлично, какая ДНК служит матрицей для образования новой цепи. Это обязательно учитывают при выделении ДНК для проведения ПЦР и стремятся в максимальной степени избежать загрязнения, условно говоря, “чужой” ДНК.

При подготовке смеси для ПЦР объединяют микрообъемы растворов, содержащих:

исходную ДНК, 2) первый праймер, 3) второй праймер, 4) смесь всех четырех необходимых для построения ДНК нуклеотидов, 5) ДНК-полимеразу бактерий Thermus aquaticus (сокращенно Taq-полимераза) или бактерий Pyrococcus furiosus (полимераза Pfu). ДНК-полимеразы именно этих микроорганизмов выбраны отнюдь не случайно - эти бактерии относятся к так называемым термофилам и обитают в воде горячих источников, поэтому все их белки, в том числе и полимеразы, хорошо противостоят тепловой денатурации. Нагревание до 95 °С не изменяет пространственную структуру этих молекул, а 75 °С - оптимальная температура для проявления их полимеразной активности. Для сравнения - применявшаяся в первых экспериментах по разработке метода ПЦР ДНК- полимераза I бактерий Escherichia coli при 75 °С полностью и необратимо утрачивает свои свойства.

Полученную смесь подвергают нагреванию до 95 °С, в результате чего водородные связи между азотистыми основаниями нуклеотидов исчезают, и двунитевая ДНК превращается в однонитевую. Затем температуру медленно понижают до 55 °С, при которой вновь образуются водородные связи, что приводит к присоединению праймеров к тем участкам однонитевых молекул ДНК, к которым они комплементарны (на жаргоне молекулярных биологов эту часть реакции называют «отжиг праймеров»). Получаются вот такие молекулы:

5'-А-А-Г-Ц-Т-Т-Ц-Ц-А-Г-3'

I I I I I I I I I I 3'.... Т-Т-Ц-Г-А-А-Г-Г-Т-Ц Г-Г-Г-Ц-Ц-Ц-Т-А-Т-Г-Т-Г 5'

и

5'   А-А-Г-Ц-Т-Т-Ц-Ц-А-Г    Ц-Ц-Ц-Г-Г-Г-А-Т-А-Ц-А-Ц   3'

I I I I I I I I I I 3'-Г-Г-Г-Ц-Ц-Ц-Т-А-Т-Г-Т-Г-5'

Затем температуру повышают до 75 °С, и, поскольку эта температура является оптимальной для присутствующей в этом же растворе полимеразы, происходит присоединение нуклеотидов к 3’-концу праймеров (напомню, что полимеразы всегда начинают работать только от двунитевого участка молекулы). А это означает, что первая из наших молекул становится двунитевой вправо от места присоединения праймера, а вторая - влево.

Когда синтез новых цепей закончен (на это уходит обычно около 3 минут) переходят ко второму этапу (учтите, что вместо слова «этап» в научной литературе при описании ПЦР часто используют слова «раунд» или «цикл»). Для этого смесь снова на короткое время нагревают до 95 °С. При этом все присутствующие в смеси двунитевые молекулы


вновь распадаются на однонитевые, и тогда появляются молекулы, у которых один конец будет представлен одним из праймеров, а именно:

5'-А-А-Г-Ц-Т-Т-Ц-Ц-А-Г Ц-Ц-Ц-Г-Г-Г-А-Т-А-Ц-А-Ц   3'

и

3'   Т-Т-Ц-Г-А-А-Г-Г-Т-Ц    Г-Г-Г-Ц-Ц-Ц-Т-А-Т-Г-Т-Г-5'

Смесь охлаждают до 55 °С, и праймеры (поскольку они изначально добавлены в избытке) вновь присоединяются к комплементарным им участкам, но уже и на этих новых нитях-матрицах:

5'-А-А-Г-Ц-Т-Т-Ц-Ц-А-Г Ц-Ц-Ц-Г-Г-Г-А-Т-А-Ц-А-Ц   3'

І І І І І І І І І І І I

3'-Г-Г-Г-Ц-Ц-Ц-Т-А-Т-Г-Т-Г-5'

и

5'А-А-Г-Ц-Т-Т-Ц-Ц-А-Г-3'

І І І І І І І І І І 3'    Т-Т-Ц-Г-А-А-Г-Г-Т-Ц    Г-Г-Г-Ц-Ц-Ц-Т-А-Т-Г-Т-Г-5'

Смесь нагревают до 75 °С. Так как и нуклеотиды для синтеза новых цепей добавлены в избытке, а ДНК полимераза сохраняет свою активность, повторяются все события, уже описанные для первого этапа. В результате этого в конце второго этапа появляются не только молекулы, характерные для первого этапа, но и молекулы

5'-А-А-Г-Ц-Т-Т-Ц-Ц-А-Г Ц-Ц-Ц-Г-Г-Г-А-Т-А-Ц-А-Ц   3'

І І І І І І І І І І  І І І І І І І І І І І І

3'-Т-Т-Ц-Г-А-А-Г-Г-Т-Ц Г-Г-Г-Ц-Ц-Ц-Т-А-Т-Г-Т-Г-5'

и

5' А-А-Г-Ц-Т-Т-Ц-Ц-А-Г Ц-Ц-Ц-Г-Г-Г-А-Т-А-Ц-А-Ц-3'

І І І І І І І І І І  І І І І І І І І І І І І

3'   Т-Т-Ц-Г-А-А-Г-Г-Т-Ц    Г-Г-Г-Ц-Ц-Ц-Т-А-Т-Г-Т-Г 5'

Это важнейший момент в понимании того, в чем суть полимеразной цепной реакции.

Ведь на третьем этапе (раунде, цикле) при воздействии температуры 95С появятся первые

однонитевые молекулы

5'-А-А-Г-Ц-Т-Т-Ц-Ц-А-Г Ц-Ц-Ц-Г-Г-Г-А-Т-А-Ц-А-Ц-3'

и

3'-Т-Т-Ц-Г-А-А-Г-Г-Т-Ц Г-Г-Г-Ц-Ц-Ц-Т-А-Т-Г-Т-Г-5',

являющиеся матрицами для синтеза того фрагмента ДНК, который мы и хотим

размножить (амплифицировать). В конце третьего этапа этот фрагмент появляется уже как

двунитевой, а это значит, что на четвертом этапе нужных однонитевых матриц станет

больше. И далее, с каждым последующим этапом число нужных нам двунитевых молекул

будет нарастать в геометрической прогрессии, за счет чего через 30 этапов их будет в 106

раз больше, чем остальных двунитевых молекул ДНК, присутствующих в смеси. Такое

28

лавинообразное нарастание численности и стало основанием для того, чтобы назвать эту реакцию цепной по аналогии с цепной ядерной реакцией в физике.

Как уже отмечалось выше, эта методика стала широко распространенной именно после направленного поиска продуцентов термостабильных ДНК-полимераз и получения препаратов этих полимераз, пригодных для проведения реакций in vitro. До появления полимераз Taq и Pfu необходимо было после каждого этапа заново добавлять полимеразу, что мешало поддерживать температурный режим, увеличивало объем реакционной смеси, определяло время проведения реакции порядка 10 часов. В настоящее время ПЦР, включающую 30-35 этапов (циклов), с использованием специального прибора, позволяющего автоматически по заданной программе нагревать и охлаждать микропробирки с единожды приготовленной смесью для ПЦР (такие приборы называют амплификаторы или термоциклеры), можно провести за 2 с половиной часа.

В целях генетической инженерии амплифицированные фрагменты можно использовать для клонирования. Для этого часть полученной после ПЦР суспензии молекул используют для проведения электрофореза и убеждаются, что в смеси в значительном количестве присутствуют молекулы заданной длины. Затем либо вымывают эти молекулы из геля, либо берут оставшуюся часть раствора с продуктами ПЦР и проводят смешивание и лигирование с заранее подготовленной ДНК плазмиды-вектора.

Помимо генетической инженерии метод ПЦР находит широкое практическое применение в других сферах научной и практической деятельности. В медицине, ветеринарии, в защите сельскохозяйственных растений от болезней с помощью ПЦР можно обнаруживать вирусы, бактерии или другие содержащие ДНК объекты, даже если они присутствуют в исследуемых образцах в таких количествах, которые не детектируются никакими другими методами. Сочетание метода обратной транскрипции (о нем вы уже знаете из предыдущего параграфа) и ПЦР позволяет обнаруживать в исследуемом материале и ничтожно малые количества определенных РНК. В этом случае сначала получают соответствующую искомой РНК кДНК, а затем амплифицируют ее до нужных количеств. Благодаря этому при постановке или подтверждении диагноза можно выявлять не только ДНК-содержащие, но и РНК-содержащие вирусы, вызывающие болезни людей, животных или растений. В криминалистике метод ПЦР позволяет в сочетании с другими методами установить принадлежность исследуемого материала не только конкретному виду организмов, но и конкретному индивидууму.

В научно-исследовательской работе клонирование генов с предварительным использованием ПЦР также получило очень широкое распространение. При исследовании конкретных организмов ПЦР позволяет быстро клонировать и секвенировать (определять последовательность нуклеотидов) определенные гены и межгенные участки ДНК, что, в свою очередь, дает возможность определять видовую и внутривидовую принадлежность, устанавливать происхождение и эволюционные взаимоотношения для конкретных видов. Благодаря этому современная биологическая систематика все больше и больше превращается в так называемую геносистематику, чему способствует создание общемировых баз данных, доступных для исследователей разных стран через систему Интернет. Кроме того, ПЦР-амплификация, клонирование генов и последующая их экспрессия в клетках микроорганизмов позволяет изучать ранее недоступные для исследования из-за их малого количества белковые молекулы, например, некоторые рецепторы для гормонов или действующие внутри клеток регуляторные белки. И это еще далеко не все возможности, которые открывает ПЦР для современной биологии и медицины.

Вопросы к § 7. 1. Почему степень чистоты химических веществ и тщательное соблюдение условий проведения реакций имеют важное значение для генетической инженерии? 2. Что такое ДНК-полимераза и зачем она нужна генным инженерам? 3. Чем ДНК-полимераза Taq лучше ДНК-полимеразы Escherichia coli для осуществления ПЦР? 4. Что такое праймеры для ПЦР и почему их нужно два? 5. Зачем нужно неоднократно нагревать и охлаждать смесь, в которой проводится ПЦР? 6. На месте преступления обнаружены микроскопические фрагменты кожи преступника. В преступлении подозреваются три человека. Один из них страдает серповидноклеточной анемией, при которой в молекуле гемоглобина шестой аминокислотный остаток - это не остаток валина, а остаток глутаминовой кислоты. Составьте план-схему исследования с применением метода ПЦР, по результатам которого будет обвинен или оправдан один из подозреваемых.



загрузка...