загрузка...
 
§ 17. Методы получения трансгенных животных и перспективы их использования
Повернутись до змісту

§ 17. Методы получения трансгенных животных и перспективы их использования

Успехи в получении трансгенных растений, а также разработка методов введения чужеродной ДНК в изолированные клетки животных легли в основу применения генноинженерных приемов в селекции млекопитающих. Однако на данном направлении генетической инженерии пришлось столкнуться с определенными трудностями.

Прежде всего, это значительно более сложное строение организма высших животных по сравнению с высшими растениями, а значит и более сложное взаимодействие генов и их продуктов при реализации генетической информации. Поэтому предсказать все возможные изменения, которые могут возникнуть вследствие введения чужеродной генетической информации, для животных значительно сложнее, чем для растений. Во- вторых, невозможность использовать регенеративные свойства, присущие только отдельным тканям животного организма, для восстановления целостного организма из одной клетки. В-третьих, отсутствие у высших животных бесполого размножения, которое можно было бы использовать для поддержания линии генетически модифицированных организмов. В-четвертых, абсолютная раздельнополость высших животных, что не позволяет использовать самооплодотворение для таких же целей и приходится использовать близкородственные скрещивания. В-пятых, невозможность осуществления полного развития организма высших млекопитающих из зиготы в искусственных условиях (вне материнского организма). Тем не менее, начиная с середины 80-х годов прошлого века, развернулись работы по получению генетически модифицированных животных и за относительно короткий срок были достигнуты значительные успехи.

Модельным объектом для трансгеноза высших животных стали легко разводимые человеком лабораторные мыши. Основными методами введения генетической информации в их организм являются трансфекция бластомеров 8-клеточного эмбриона с помощью ретровирусных векторов, введение генетически модифицированных с помощью тех же векторов стволовых клеток в эмбрионы на более поздних стадиях развития и прямое введение ДНК в зиготу до слияния мужского и женского ядер. Последний метод, получивший название метода микроинъекций, несмотря на технические сложности и трудоемкость, получил наибольшее распространение.

Для его реализации у самок белых мышей стимулируют овуляцию путем введения сыворотки беременной лошади и через 48 часов - хорионического гонадотропина человека, в результате чего в яичниках мыщи образуется более 30 яйцеклеток вместо обычных 5-10. Затем осуществляют скрещивание таких самок с самцами и их быстрое умерщвление для вымывания оплодотворенных яйцеклеток из яйцеводов. Полученные таким образом клетки еще не являются полноценными зиготами, поскольку в них еще не произошла кариогамия (слияние ядер). С использованием микроманипулятора, под микроскопом поочередно фиксируют каждую клетку и с помощью инъекционной пипетки (тонкая стеклянная трубочка, соединенная с создающим давление механизмом) в ядро слившегося с яйцеклеткой сперматозоида (мужской пронуклеус) вводится суспензия молекул ДНК, содержащих необходимую генетическую информацию. Когда ядро яйцеклетки (женский пронуклеус) и ядро сперматозоида сливаются и получается полноценная зигота, она микрохирургическим путем имплантируется в матку так называемой суррогатной матери - самки, которая была перед этим скрещена с вазэктомированным самцом (в семенной жидкости таких самцов нет сперматозоидов), поскольку у мышей не разработаны методы другие методы (например, гормональные) для подготовки матки самки к имплантации. В матку одной самки вводят от 25 до 40 зигот, для того, чтобы хотя бы часть из них имплантировалась нормально и началось дальнейшее развитие эмбрионов. Через три недели рождается трансгенное потомство, которое оценивается в дальнейшем на наличие введенных генов и выраженность желаемого признака.

Метод трудоемок и требует специальной подготовки: квалифицированный специалист в течение рабочего дня подвергает микроинъекции несколько сотен яйцеклеток, при этом часть яйцеклеток повреждаются и становятся непригодными для имплантации. Кроме того, имеются определенные трудности и в ходе собственно имплантации, а также не каждая имплантированная зигота в дальнейшем развивается нормально (поэтому их имплантируют больше, чем в норме может развиться в матке мыши). К сожалению, и часть родившихся детенышей могут оказаться мало жизнеспособными и умирают на ранних стадиях постэмбрионального развития.

Для дальнейшего выращивания оставляют только тех выживших потомков, у которых произошло закрепление введенной генетической информации. Для их идентификации производят выделение ДНК из небольшого количества тканей животного (у мышей для этого используют фрагмент хвоста) и осуществляют ПЦР с необходимыми праймерами. Анализ продуктов ПЦР позволяет отобрать необходимых животных (для мышей из 1000 имплантированных зигот получается от 30 до 50 трансгенных потомков) и по достижению половой зрелости проводить получение чистых линий путем традиционного инбридинга. Получаемое в таких скрещиваниях потомство анализируется тем или иным способом на наличие необходимых генов в гомозиготном состоянии. На этом этапе также встречаются определенные трудности, связанные уже с выражением интегрированных генов, вследствие чего окончательный выход (получение чистой линии) оказывается еще менее эффективным. Однако, если чистая линия уже получена, то ее поддержание уже не составляет особых проблем, и возможно практическое использование трансгенных животных в научных или промышленных целях.

Еще один подход - это введение генетически модифицированных стволовых клеток в бластоцисту. Для этого клетки из бластоцисты (зародыша на стадии начала формирования второго зародышевого листка) изолируют и поддерживают какое-то время в культуре. Такие клетки (сокращенно называемые ЕБ-клетки) способны к пролиферации и обладают плюрипотентностью, т..е. способностью в дальнейшем развиваться в клетку любой ткани. Посредством трансфекции с использованием тех или иных векторов на основе вирусов млекопитающих в эти клетки вводится чужеродная генетическая информация, и дальнейшая задача состоит в том, чтобы отобрать те варианты клеток, в которых произошла встройка в определенный участок генома. Дело в том, что интеграция чужеродного фрагмента не должна нарушить ни процессы развития эмбриона, ни процессы постэмбрионального развития до половой зрелости. Уже известны некоторые сайты генома мыши, инсерции в которые оказывались удачными в этом отношении, поэтому в векторе, предназначенном для трансфекции ЕБ-клеток, маркерный и ген и необходимый трансген располагают между последовательностями, гомологичными последовательностям из таких сайтов. В качестве маркерного гена используют ген №ог, продукт которого придает клеткам млекопитающих устойчивость к 0-418 (генетицину), поэтому культивирование клеток на среде с этим соединением позволяет отобрать те из них, в которых произошла встройка векторной молекулы в геном (это так называемая позитивная селекция). Однако, иногда встройки могут происходить в различные участки генома, в том числе и важные для развития эмбриона и потомства, поэтому в составе вектора находятся еще два гена, наличие которых позволяет убрать клетки с ненужными вставками. Это два разных гена тимидинкиназы из генома вируса простого герпеса -

НБУ-1к1 и НБУ-1к2. Они располагаются в векторе слева и справа от нужных для направленной интеграции гомологичных фрагментов и если встраивание произошло случайно, не по этим гомологичным последовательностям, то в геноме клетки оказывается хотя бы один из генов тимидинкиназы. Его присутствие в геноме легко обнаружить при выращивании клеток на среде с ганцикловиром, поскольку он под воздействием этого фермента превращается в токсическое для клетки соединение. Таким образом, если после трансфекции ББ-клетки поместить на среду, одновременно содержащую и генетицин (0-418) для позитивной селекции и ганцикловир - для негативной, будут размножаться только те клетки, в которых произошла интеграция в нужный сайт хромосомы.

Еще один метод отбора клеток с правильно произошедшей интеграцией основан на ПЦР, но для этого используют другие векторы. В таких векторах рядом с трансгеном, между ним и одной из необходимых для гомологичной рекомбинации последовательностей, располагают короткую так называемую уникальную последовательность (ИБ), которая нигде больше в геноме животного не встречается (она может быть как природной, например из генома бактерий, так и синтетической). Для идентификации нужных клеток необходимы два праймера: один из них (Р1)

комплементарен этой уникальной последовательности, а второй (Р2)- последовательности из того сайта хромосомы, в который предполагается встройка. Если после амплификации ДНК из трансфецированных клеток выявляется фрагмент предусмотренного размера, то, значит, именно в этих клетках интеграция произошла в нужное место хромосомы.

Далее клетки такого клона с использованием микроманипулятора вводят в бластоцисту мыши, и затем имплантируют эту бластоцисту в матку суррогатной матери. После этого по описанной выше схеме получают чистые трансгенные линии.

Считается (и тому есть экспериментальные подтверждения), что такой метод потенциально применим не только к мышам, но и к любым млекопитающим.

Каково же практическое использование трансгенных животных? Больше всего в настоящее время используются трансгенные лабораторные мыши. Они нашли применение в научных исследованиях.

Один из примеров - это получение животных с дефектом по какому-либо конкретному гену, что необходимо для изучения функции этого гена. В настоящее время получено более 300 линий таких мышей, и это позволило идентифицировать многие гены млекопитающих. Для проведения так называемого «нокаута гена» конструируют специальные последовательности, в которых селективный маркерный ген, например, тот же ген Neor, размещают внутри последовательности предназначенного для «нокаута» гена с таким расчетом, чтобы протяженные участки гена справа и слева от маркера обеспечивали успешную рекомбинацию с геном дикого типа в клетках млекопитающих и замену его на дефектный.

Еще одно направление в создании трансгенных мышей - это создание моделей наследственных болезней человека, таких как артрит, мышечная дистрофия, нейродегенеративные нарушения, болезнь Альцгеймера, образование опухолей и других. На мышах также отрабатываются варианты получения необходимых для изучения механизмов тех или иных болезней белков, получить которые в других системах экспрессии (бактериях, дрожжах, растениях, клетках насекомых) не удается. Здесь предполагается создание системы секреции таких белков в молоко (вставки в последовательность гена Р-казеина козы «сработали» на мышах ), чтобы потом получить такой крупный или мелкий рогатый скот и иметь мощный источник необходимого белка.

С этой точки зрения наиболее подходящими животными являются коровы, в молоке которых около 35 г/литр белка, а годовые удои высокопродуктивных пород порядка 10 000 литров. Методику получения трансгенных коров начали отрабатывать сначала 90-х годов 20-го века и она заключается в следующем. Ооциты коров вымывают из яичников убитых на бойнях животных и in vitro создают им условия для созревания в яйцеклетки. Здесь же проводится их оплодотворение спермой быка, после чего клетки особым образом центрифугируют, чтобы уплотнить желток и сделать тем самым видимым мужской пронуклеус. Далее проводят микроинъекции необходимой генетической конструкции по стандартной методике и переносят зиготы в условия, обеспечивающие развитие зиготы в эмбрион. Полученные in vitro эмбрионы вводят в матку коровы, находящейся на стадии течки и они без хирургического вмешательства имплантируются в стенку матки. На определенной стадии развития эмбриона в матке отбирают небольшое количество клеток и посредством ПЦР удостоверяются в присутствии в геноме плода последовательности трансгена. Метод пока низко эффективен, но реален. Считается, что постепенно его этапы будут усовершенствованы и получение трансгенного крупного рогатого скота для медицинских и сельскохозяйственных целей станет обычным делом.

В медицинском аспекте предполагается экспрессия нужных генов клетках молочной железы и получение в дальнейшем из молока необходимых для терапии тех или иных болезней человека белков (например, белков системы свертывания крови для помощи гемофиликам), а в сельскохозяйственном - получение не содержащего лактозу молока путем экспрессии гена лактазы (некоторые люди плохо переносят потребление молочных продуктов именно из-за присутствия в них лактозы), получение молока обогащенного к- казеином посредством гиперэкспрессии собственно коровьего гена (необходимо для производства сыров), получение животных, устойчивых к различным инфекционным заболеваниям (стоимость ветеринарного обслуживания животных составляет около 20% стоимости продуктов животноводства). Реализация последней цели должна заключаться во введении в геном животных конкретных генов вариабельных доменов иммуноглобулинов, обеспечивающих образования паратопов, специфичных для наиболее важных эпитопов антигенов патогенных для данного вида вирусов и бактерий. Подобный подход в получении резистентных пород потенциально применим и к другим сельскохозяйственным животным.

Получение трансгенных овец и коз пока обсуждается в основном с точки зрения использования их молока для получения медицинских препаратов, поскольку генетические конструкции для экспрессии генов человека в клетках молочной железы этих животных получены и апробированы. В этих гибридных ДНК используются промоторы гена в-лактоглобулина, гена в-казеина и гена asi-казеина, а среди клонированных генов человека - ген активатора плазминогена, ген a-антитрипсина (при отсутствии этого белка развивается эмфизема, дефицит ингибитора сывороточных протеаз, поражение легких , цирроз печени), ген фактора IX системы свертывания крови (белок нужен для лечения гемофилии В), ген лактоферрина, ген урокиназы, ген интерлейкина-2 (ИЛ-2 находит применение при лечении меланомы, глиобластомы и рака почек), ген CFTR (cystic fibrosis transmembrane regulator, трансмембранный белок, нарушения в структуре которого приводят к муковисцидозу - образованию большого количества слизи в дыхательных путях и как следствие этого повышению заболеваемости таких людей респираторными болезнями в несколько раз и их высокой смертности из-за аллергической реакции на нуклеиновые кислоты возбудителей). Существенно, что трансгенные овцы и козы в большинстве случаев не имеют отклонений в лактации, а вскармливаемое таким молоком потомство - отклонений в развитии. Из перспектив сельскохозяйственного применения трансгенного мелкого рогатого скота упоминают только овец с повышенной скоростью роста шерсти. Этот вариант был получен путем введения кДНК гена инсулиноподобного фактора роста i овцы под промотором гена кератина мыши.

Получение трансгенных свиней также имеет место, причем ввиду близости физиологических и тканевых характеристик свиньи и человека, здесь также в основном преследуют медицинские цели. В частности, предполагается разработать и осуществить трансгеноз свиньи с целью использования органов таких животных для пересадок человеку. Одно из препятствий при межвидовой трансплантации - это так называемое гиперострое отторжение, проявляющееся почти сразу же после пересадки. Оно вызывается осаждением антител на поверхности клеток пересаженного органа и активации системы комплемента по классическому пути, что, естественно, моментально разрушает клетки. Выяснилось также, что основным антигеном, который вызывает образование антител у выбранных как модель обезьян, является углеводный компонент поверхностных белков клеток свиньи. Предполагается, с одной стороны, «подобраться» к генам свиньи, кодирующим поверхностные антигены и изменить их так, чтобы убрать или модифицировать этот углеводный компонент, а с другой стороны, ввести в геном свиньи гены человека, контролирующие образование ингибиторов системы комплемента, защищающих собственные клетки от его действия. Эти гены уже клонированы и экспрессированы в организме свиньи и одно из животных действительно имело клетки, не повреждающиеся комплементом человека в опытах in vitro. После пересадки тканей такой свиньи приматам оторжение все-таки наблюдалось, но не по схеме гиперострого отторжения. Вероятно, шло отторжение за счет активации макрофагов Т-хелперами первого типа как это обычно имеет место при внутривидовых пересадках органов.

Еще одним успешным в этом направлении трансгенозом свиньи считается получение животных, продуцирующих человеческий гемоглобин. В этом случае в геном свиньи ввели два гена a-цепи гемоглобина человека, один ген P-цепи гемоглобина и регуляторную область гена P-цепи под промотором свиного гена P-цепи гемоглобина. Перспективы применения таких свиней - приготовление из крови компонентов кровезаменителей.

В сельскохозяйственном аспекте путем введения гена бычьего гормона роста под промотором гена металлотионеина пытались получить породу быстрорастущих мясных свиней. Однако, хотя трансгенные животные быстрее росли, у них обнаруживались язвы желудка и кишечника, почечная и сердечная недостаточность, воспаления суставов и снижение защитных свойств слизистой оболочки дыхательных путей (повышенная заболеваемость пневмониями).

Параллельно с проблемами введения новой генетической информации в клетки млекопитающих решалась и проблема получения идентичных потомков, поскольку даже внутрисемейные скрещивания не гарантируют точного воспроизведения генотипа уже полученного трансгенного животного. Это направление получило наименование клонирование животных.

Решение проблемы успешного клонирования животных пока видят в поиске клеток эмбриона или взрослого организма, которые полностью сохраняли бы плюрипотентность, т. е способность экспрессировать все гены, необходимые для начальных этапов эмбрионального развития. Если такие клетки обнаруживаются (у коров это клетки эмбриона, у овец - клетки эпителия молочной железы), то далее осуществляют перенос ядра такой клетки в цитоплазму яйцеклетки, из которой предварительно свое гаплоидное ядро удаляют. В экспериментах с клетками молочной железы овцы введение ядер осуществляли с помощью слияния клеток с применением полиэтиленгликоля, на коровах

с помощью микроманипулятора. На следующем этапе добиваются дробления такой своеобразной зиготы in vitro и имплантируют в матку «суррогатной» матери.

Проводятся также исследования по созданию системы получения трансгенных птиц. Сложности заключаются в том, что у птиц при оплодотворении в яйцеклетку проникает, как правило, несколько сперматозоидов, но лишь один из них сливается с ядром. Поэтому осуществлять инъекции в мужской пронуклеус считается нецелесообразным, а проверка возможности введения ДНК в цитоплазму яйцеклетки показала, что в ядро такая ДНК не проникает. Были проверены возможности трансфецирования клеток зародыша кур и перепелов стандартными ретровирусными векторами млекопитающих и оказалось, что это возможно. Часть полученных таким образом цыплят и перепелят наследовали маркерный ген и не продуцировали вирусных частиц, но опасения, что присутствие ретровирусного генома может иметь нежелательные последствия при потреблении полученных от таких птиц продуктов, заставили дальше отказаться от такого подхода. К настоящему времени используют метод введения ДНК в бластомеры куриных эмбрионов с помощью липосом. Для этого из слегка насиженных яиц извлекают эмбрион, разделяют его на клетки и смешивают их с суспензией липосом, содержащих чужеродную ДНК. Добиваются слияния липосом с клетками, а затем вводят суспензию таких клеток в подзародышевую область свежеотложенных яиц, которые перед такой процедурой подвергают несильному (540-660 рад в течение часа) облучению. Облучение убивает часть клеток исходного зародыша и после введенеия трансфецированных бластомеров они с большей вероятностью войдут в состав развивающегося эмбриона. Если из такого яйца в дальнейшем вылупливается птенец, то в части его клеток можно обнаруживать присутствие введенного гена. Такие цыплята называются химерными и их в дальнейшем используют для скрещивания. Анализ потомства позволяет выявить особи, у которых трансген присутствует во всех клетках, и такая птица становится основателем чистой линии, получаемой уже стандартным инбридингом.

Потенциальное хозяйственное использование трансгенных птиц видят в следующем: получение пород кур, устойчивых к различного рода инфекциям (бактериозы и болезни, вызываемые одноклеточными животными, наносят серьезнейший ущерб промышленному птицеводству); пород с измененным составом желтка и мяса (меньше жира и холестерола); пород с измененным составом белка, причем предполагается поставить под промоторы генов овальбумина гены ряда используемых в медицинских целях белков, чтобы потом извлекать эти белки из яичного белка.

Еще одна группа позвоночных животных, которых уже коснулась своим крылом генетическая инженерия - это рыбы. Методически работа с яйцеклетками рыб является самой несложной и введения ДНК в икринки можно осуществлять микроинъекцией или электропорацией без особого труда. Тем более, что введение линеализированной ДНК просто в цитоплазму оплодотворенных яйцеклеток или бластомеров четырехклеточного зародыша оказывается вполне эффективным. Трансфецированные икринки просто оставляют в воде оптимальной для развития эмбриона температуры и выход трансгенного потомства может достигать 70%. Наличие введенного гена у мальков определяют посредством ПЦР.

Из успехов трансгеноза рыб упоминают работу с лососем, в которой была использована кДНК гена гормона роста лосося, поставленная под промотор и сайт полиаденилирования гена антифризного белка североамериканской бельдюги. Экземпляры потомства нерки с такими генами в возрасте одного года весили в 10 раз больше обычной нерки, выращенной в таких же условиях. Обсуждается возможность получения пород проходных и разводимых (форель, карп) рыб, устойчивых к болезням и стрессовым воздействиям при скученном содержании.

Вопросы к § 17. 1. В чем заключаются основные трудности получения трансгенных животных? 2. В чем суть метода микроинъекций? 3. Зачем нужны трансгенные мыши? 4. Как получить точную генетическую копию? 5. Пофантазируйте, какое изменение и в каких сельскохозяйственных животных следовало бы получить



загрузка...