Разделение процессов межклеточной коммуникации на основании особенностей распространения и восприятия передаваемого сигнала было впервые проведено Л. Агнати и соавторами (L. Agnati et al., 1986). Согласно высказанной ими концепции, выделяют следующие способы передачи сигнала (рис. 99):
Проводниковая передача сигнала (wiring transmission) - способ межклеточной коммуникации, опосредованный детерминированной цепочкой клеток. При этом наблюдается передача сигнала от одной клетки к другой с коэффициентом 1:1, т. е. на один источник сигнала (пресинапти- ческую клетку) приходится один приемник этого сигнала (постсинапти- ческая клетка). Представлена классической синаптической передачей, например в случаях простых рефлекторных дуг соматических рефлексов, хотя наличие в них вставочных нейронов несколько и не соответствует декларированному коэффициенту 1:1.
Объемная передача сигнала (volume transmission) - способ межклеточной коммуникации, основанный на распространении сигнала в пределах межклеточного пространства во всех направлениях. При этом расстояние, на которое такой сигнал распространяется, значительно превышает размеры синаптической щели. Во внеклеточном пространстве сигнал распространяется по пути, обеспечивающему наибольшую скорость диффузии сигнальной молекулы. Передача сигнала происходит с коэффициентом 1 : n, где n >> 1. Таким образом, количество приемников сигнала значительно превышает количество источников исходного сигнала.
Многие нейромедиаторы и нейромодуляторы способны выступать в качестве сигнальных молекул объемной передачи сигнала (рис. 100), однако со всей очевидностью эта роль наиболее характерна для газообразных нейромодуляторов (см. далее). Разумеется, что клетки-мишени объемной передачи сигнала обладают специфическими молекулами, способными воспринимать и распознавать исходный сигнал.
В современной нейробиологии уже не вызывает сомнений, что в мозге, помимо синаптической передачи, существует и другая, гормон-подоб- ная передача сигнала. Основу такого паракринного (F. Murad, 1994) влияния составляет генерализованное действие того или иного вещества. При этом в ответную реакцию вовлекается целая совокупность клеток, расположенных на некотором расстоянии от клетки, источника сигнала.
Наряду с газообразными нейромодуляторами, многие нейропептиды, а также и белковые факторы роста относятся к паракринно действующим началам.
Помимо межклеточного пространства существует и другой путь, по которому сигналы могут распространяться от клетки к клетке по всем направлениям. Это внутриклеточное пространство расположенных рядом нейронов, соединенных посредством щелевого контакта. В отличие от первого (внеклеточного) пути, он представляет собой хорошо регулируемый путь, позволяющий координировать работу функционально однородных нейронов. Так, известно о том, что синтезируемый амакриновыми клетками сетчатки глицин может поступать в связанные с ними биполярные клетки через щелевой контакт.
Несмотря на чрезвычайную сложность клеточной организации мозга, все разнообразие нейронных сетей можно свести к двум базовым схемам:
Иерархические системы - к ним относятся многочисленные проводящие пути спинного и головного мозга, контролирующие двигательную активность и чувствительность и состоящие из последовательно соединенных при помощи толстых, миелинизированных волокон различных клеток. Важной особенностью этой схемы является то, что повреждения, нанесенные на любом ее уровне, вызывают нарушение работы всей системы.
Иерархические системы состоят из клеток двух типов:
проекционные (релейные) нейроны: будучи связанными посредством химического синапса, передают сигналы на большие расстояния в пределах организма.
Для них характерны крупные тела с многочисленными отростками вокруг (дендриты) и одним длинным отростком (аксон) для контакта с другими составляющими системы. Как правило, синапсы, образованные этими клетками, относятся к возбуждающим синапсам, часто использующим глутамат в качестве нейромедиатора;
вставочные (местные) нейроны: они участвуют в образовании многочисленных синапсов с проекционными нейронами или друг с другом.
Тела этих клеток значительно мельче, аксоны мало выражены. Разнообразие синапсов (аксо-соматические, аксо-дендритные, аксо-сомальные и т. п.) позволяет реализовать различные виды межнейронных взаимодействий, прежде всего торможение - прямое, возвратное, латеральное и др.
Таким образом, большинство синапсов, образованных вставочными нейронами, - тормозные, предпочтительно использующие ГАМК и/или глицин в качестве нейромедиатора.
Несмотря на разнообразие синаптических связей, в подсистеме вставочных нейронов используется ограниченное количество нейромедиаторов. В результате, фармакологически воздействуя на них, можно существенно изменить общую возбудимость нервной системы, что и наблюдается, например, при действии стрихнина.
Диффузные (неспецифические) системы - к ним относятся нейронные сети ретикулярной формации мозга. При этом тела клеток входят в состав относительно немногочисленных (в мозге человека насчитывается около 40 ядер) компактных скоплений. Отростки нейронов ретикулярной формации тонкие, немиелинизированные, часто ветвятся и меняют направление, следуя как в восходящем, так и в нисходящем направлении. На нейронах ретикулярной формации конвергируют различные афферентные сигналы, в то же время ветви одного нейрона могут иннервировать несколько функционально различных частей ЦНС.
В качестве нейромедиаторов диффузные системы используют различные моноамины - норадреналин, серотонин и, главное, дофамин.
На протяжении аксонов моноаминергических нейронов существуют многочисленные расширения (аксоны en passant), содержащие большое количество синаптических пузырьков, обеспечивающих диффузное выделение нейромедиатора. Важным следствием подобной организации является то, что клеточные мишени действия медиатора определяются местоположением их рецепторов, а не источника их синтеза.
В связи с этим диффузные системы не могут и не являются передатчиками специфической топографической информации. Они опосредуют генерализованные восходящие тонические влияния (возбуждающие и тормозные), направленные на регуляцию активности коры больших полушарий, вовлечены в регуляцию процессов сна и бодрствования, эмоциональных состояний.
В развитие концепции объемной передачи сигнала было предложено разделить всю совокупность сигналов, воспринимаемых клетками нервной системы, на два класса (Ь. Б. Agnati е! а1., 1994):
Специфические сигналы - для их распознавания в клетке должны существовать специальные структуры, взаимодействующие с ними за счет высокоаффинного связывания, т. е. рецепторы. В эту группу входят нейромедиаторы и нейромодуляторы, высвобождаемые ограниченным количеством групп нервных клеток.
Общедоступные сигналы - генерируются и распознаются (декодируются) всеми нервными клетками, например, электрические сигналы.
Заметим, что такие общебиологические факторы, как температура, вне- и внутриклеточная концентрация Н+ (pH), способны оказывать модулирующее влияние на процессы генерации сигнала и на процессы его восприятия и распознавания.
Более того, указанные физические и физико-химические начала с легкостью могут быть отнесены к группе общедоступных сигналов в самом широком понимании, поскольку практически любая клетка способна реагировать на изменение температуры или pH.
Монооксид азота (N0) - первое газообразное вещество, для которого было показано участие в процессах межклеточной коммуникации. Поскольку монооксид азота - это газ, который легко растворяется как в воде, так и в жирах, он не может накапливаться и храниться в синаптических пузырьках. Косвенным следствием этого является тот факт, что N0 не высвобождается посредством Са2+-зависимого экзоцитоза везикул, а просто диффундирует из цитозоля, где он синтезируется, во внеклеточное пространство. При этом выделение газа не привязано к какой-либо части нервной клетки.
В качестве паракринного передатчика сигнала монооксид азота впервые был охарактеризован в 1980 г. Р. Фернчгот и Дж. Завадский (R. F. Furchgott, J. V. Zawadski, 1980) впервые показали, что т. н. эндотелиальный фактор, расслабляющий сосуды (endothelium-derived relaxing factor, EDRF), есть NO. Взаимодействие АХ с поверхностными рецепторами клеток эндотелия приводит к синтезу в них монооксида азота, диффундирующего к прилежащим гладкомышечным клеткам стенки сосуда, вызывая их расслабление, т. е. расширение кровеносного сосуда. Представления о роли NO как нейромодулятора сформировались только в конце 80-х гг. ХХ в. (J. Garthwaite et al., 1989), когда были получены доказательства его действия в нервной ткани.
Локализация NO-ергических нейронов в ЦНС. Существует целый ряд трудностей, наличие которых в течение длительного времени осложняло картирование NO-продуцирующих нейронов. Прежде всего, NO не хранится в синаптических пузырьках, он синтезируется «по мере надобности» в ответ на поступающие извне сигналы, его концентрация крайне мала, время жизни также невелико, что затрудняет уже прямое детектирование in vivo. В большинстве случаев в качестве маркера возможной продукции NO клетками выступает NADPH-диафораза, один из ко-факторов синтеза монооксида азота. Клонирование нейронной формы NO-синтазы (фермента, ответственного за выработку NO) позволило получить специфичные антитела к ней, а также использовать методику гибридизации РНК in situ. Кроме того, эффективным способом картирования NO-ергических нейронов является использование флуоресцентных красителей, способных специфически связываться с молекулой монооксида азота.
Рис. 101. Распределение нейронов с NO-синтазной активностью в мозге крысы
В ЦНС удается выявить все три формы NO-синтазы (см. далее). Нит- рергические клетки широко представлены среди нейронов обонятельной луковицы, гипоталамуса (супраоптическое ядро), а также в составе коры больших полушарий, гиппокампа, базальных ядер (хвостатое ядро и скорлупа), пластины четверохолмия среднего мозга, мозжечка и ядер ствола (рис. 101).
Имеются свидетельства о продукции NO клетками глии, а также его ко-локализации с ГАМК и нейропептидом Y.
Метаболизм NO. Монооксид азота образуется в результате двустадийного окисления гуанидинового атома азота в молекуле незаменимой аминокислоты L-аргинина. Промежуточным продуктом реакции является N-ю-гидрокси-Ь-аргинин, распадающийся с образованием одной молекулы цитруллина и монооксида азота (рис. 102).
Продукция NO в мозге не особенно интенсивна - пмоль/мин/мг общего белка. Протекание реакции синтеза обеспечивает фермент NO- синтаза (NOS).
Существует три основные изоформы данного фермента: нейронная (nNOS), эндотелиальная (eNOS) и индуцибильная (iNOS). При этом активность первых двух форм регулируется внутриклеточными ионами кальция. При повышении их концентрации происходит образование комплекса кальция с кальмодулином, который, взаимодействуя с NO- синтазой, переводит ее в активное состояние. Для нормального протекания реакции требуется также ряд кофакторов - NADPH и кислород. Снижение уровня кальция в клетке приводит к терминации синтеза монооксида азота в нейронах и эндотелии.
Индуцибильная форма NOS встречается в клетках периферической крови, выполняющих защитную функцию (макрофаги). Благодаря своим свободнорадикальным свойствам NO в данном случае выступает в роли цитотокси- ческого агента.
NH+f COO NHf COO NH+ 'C°°'
L-аргининN-ю-гидрокси-Ь-аргинин L-цитруллин
Рис.102.Биосинтез монооксида азота
В мозге повышение внутриклеточной концентрации кальция происходит вследствие предварительной активации КМОА-рецепторов. Напротив, в клетках эндотелия реализуется механизм, связанный со стимуляцией фосфолипазы С и активацией 1Р3ЮАО-пути. Выделяемый клеткой N0 связывается со своими мишенями, а его избыток быстро инактивируется при взаимодействии с кислородом или супероксид-анионом - время жизни свободного N0 исчисляется несколькими секундами. Монооксид азота способен образовывать комплексы с белками крови, в частности с гемоглобином, и это еще один путь его инактивации. Заметим, что для газообразных нейромодуляторов не существует специальной системы обратного захвата или распада.
Из N0 может образовываться пероксинитрит - крайне реакционное соединение, способное индуцировать свободно-радикальные реакции и обладающее выраженными нейротоксическими свойствами.
Механизм внутриклеточной передачи сигнала. Монооксид азота легко проникает через мембраны любых клеток. Таким образом, он не связывается ни с какими рецепторами на поверхности клетки, а взаимодействует непосредственно с внутриклеточными белками. Основной мишенью действия N0 в клетке является растворимая гуанилатциклаза, катализирующая образование цГМФ из ГТФ. Связывание монооксида азота с гемом гуанилатциклазы приводит к изменениям конформации последней, что и лежит в основе ее активации. Образующийся цГМФ, в свою очередь, стимулирует цГМФ-зависимую протеинкиназу, способную фос- форилировать многочисленные белки, в том числе белки ионных каналов.
В частности, в клетках гладких мышц фосфорилирование посредством цГМФ-зависимой протеинкиназы модулирует активность К+- и Оа2+-каналов, а также кальциевых насосов, что приводит к уменьшению внутриклеточной концентрации кальция и опосредует расслабление мышцы.
Активность многих гем-содержащих ферментов, например циклоок- сигеназы I и II, липооксигеназы, модулируется при их взаимодействии с N0. Кроме того, регулирующим влияниям со стороны монооксида азота подвержены ферменты, содержащие Бе-З-кластеры: цис-аконитаза, комплексы I и II электронтранспортной цепи митохондрий. Монооксид азота также способен нитрировать и/или нитрозилировать тиоловые компоненты белков, в том числе из состава различных внутриклеточных протеинов (аденилатциклаза, протеинкиназа С, белки SNAP) и рецепторов (КМБА-рецепторы1).
Биологические эффекты монооксида азота. Благодаря своим особенностям N0 является активным участником несинаптических взаимодействий, опосредуя передачу сигнала на большие, по сравнению с шириной синаптической щели, расстояния.
В пределах ЦНС монооксид азота участвует в регуляции мозгового кровообращения, высвобождении нейромедиаторов и нейромодуляторов, процессах нейрогенеза и синаптической пластичности. Особенно стоит отметить роль N0 в развитии долговременной потенциации (ДВП) в нейронах коры больших полушарий и гиппокампа, а также долговременной депрессии (ДВД) в нейронах мозжечка. При этом монооксид азота выступает в роли ретроградного передатчика сигнала - выделяясь из пост- синаптической клетки, он диффундирует по межклеточному пространству, в том числе и к пресинаптической терминали, поддерживая ДВП (ДВД) за счет влияния на процессы высвобождения нейромедиатора.
Помимо ЫО-зависимой формы ДВП существуют некоторые долговременные изменения синаптической передачи, которые не подвержены регуляторному влиянию монооксида азота (ЫО-независимая ДВП).
Известно и о нейропротекторных свойствах монооксида азота. Так, нейроны, содержащие N0-синтазу, устойчивее к нейротоксическому действию глутамата.
С другой стороны, гиперпродукция N0, например, при развитии кислородного голодания (ишемии) мозга, может вызывать повреждение расположенных рядом с источником его синтеза клеток.
Роль других эндогенных газообразных веществ в регуляции процессов межклеточной коммуникации менее значима, нежели N0.
Монооксид углерода. Образование СО катализируется гемоксидазой (Н0), активирующейся при фосфорилировании протеинкиназой С. При этом монооксид углерода является побочным продуктом реакции распада гема до биливердина. Известно о существовании двух изоформ гем- оксидазы:
эндотелиальная (Н0^: индуцибильный фермент, ответственный за распад гема. Его экспрессия возрастает в ответ на аккумуляцию гема и при действии окислительного стресса;
нейронная (НО2): конститутивный фермент, встречается в мозге.
Как и N0, монооксид углерода легко проникает через клеточные мембраны, связывается с железом гема в гуанилатциклазе, активируя ее и стимулируя продукцию цГМФ. Считается, что распределение НО2 примерно соответствует таковому для NO-синтазы с максимальным присутствием в нейронах гиппокампа (пирамидные и гранулярные клетки). Кроме того, она присутствует в первичных сенсорных нейронах обонятельного эпителия.
II Многие одоранты реализуют свое действие посредством СО-зависимого повышения уровня цГМФ.
Монооксид углерода выступает в качестве ретроградного передатчика при развитии ДВП. Он также модулирует работу глутаматергических систем мозга, участвует в регуляции хемосенсоров каротидных телец, вызывает вазодилятацию.
Сульфид водорода. Эндогенный H2S образуется из аминокислоты цистеина под действием пиридоксаль-5’-фосфат-зависимых ферментов: цистатион в-синтазы (CBS) и цистатион у-лиазы (CSE).
В настоящее время нельзя с уверенностью сказать, в какой форме сульфид водорода активен в тканях: Н2Э, HS- или S2-. Поэтому термин «сульфид водорода» одинаково применим ко всем формам. В физиологических растворах одна треть сульфида водорода существует в недиссоциированной форме (Н^), а другие две трети приходятся на долю HS-.
Относительно высокая экспрессия CBS наблюдается в нейронах гиппокампа и мозжечка по сравнению с клетками коры больших полушарий и ствола мозга. В то же время лишь ничтожные количества мРНК, кодирующей CSE (сам ген локализован у человека в 21 хромосоме), детектируются в ткани головного и спинного мозга, а сам фермент даже не обнаруживается при N?thern-блот анализе.
Поступление цистеина в клетку опосредовано функционированием глутамат-цистеинового транспортера. Высокие внеклеточные концентрации глутамата блокируют его работу, а следовательно, снижают продукцию клеткой сульфида водорода. В норме продукция H2S в гомогенатах мозга составляет около 20 нмоль/мин/G-белок. В результате эндогенная концентрация H2S в мозге достигает уровня в 50-160 мкМ. В отличие от NO и CO, сульфид водорода не увеличивает уровень цГМФ, а напрямую взаимодействует с участками белков, содержащих дисульфидные связи, в частности, в NMDA-рецепторах, или свободные тиоловые группы.
Известно, что высокие концентрации H2S ( >320 мкМ) угнетают синаптическую передачу в гиппокампе. В то же время в физиологических концентрациях дисульфид водорода облегчает ДВП в гиппокампальных нейронах за счет усиления ответов, опосредованных активацией NMDA- рецепторов.
В ЦНС тканевый ацидоз является одним из следствий ишемии мозга или развития различных воспалительных процессов (P. Lipton, 1999), а то, что даже малые сдвиги уровня pH способны вызвать выраженные изменения возбудимости нервных клеток, не вызывает сомнений (C. J. Schwiening, 2003).
II В ходе тканевого ацидоза значение внеклеточного pH может снижаться бо- || лее чем на две единицы по сравнению с исходным уровнем.
Помимо этого, сообщалось о модулирующем влиянии уровня pH на электрофизиологические характеристики Са2+-токов, а следовательно, и функционирование кальциевых каналов (M. Morad, 1988), натриевых каналов (S. Kellenberger, L. Schild, 2002), ГАМК-управляемых хлорных каналов (M. Pasternack et al., 1996) и др. Совершенно очевидно, что эти данные свидетельствуют о вовлеченности синаптических механизмов (пре- и постсинаптических составляющих) в ответную реакцию организма на сдвиги внеклеточного pH. В частности, падение pH выраженно подавляет дофамин- и пептидергическую передачу в нервной системе беспозвоночных (рис. 103).
Изменение величины pH, а особенно закисление внеклеточной среды, приводит к активации открытых в начале 80-х гг. XX в. (O. A. Krishtal, V. I. Pidoplichko, 1980) кислоточувствительных ионных каналов (acid- sensing ion channels, ASIC), широко представленных в сенсорных нейронах спинно-мозговых ганглиев, нейронах ЦНС и клетках глии (олиго- дендроциты). Падение pH приводит к открытию этих неселективных катионных каналов (Na > Ca > K ), изменяет возбудимость нейронной мембраны, что и опосредует реакцию соответствующей клетки.
Физиологическая роль ASIC остается до конца не выясненной, хотя не вызывает сомнений их вовлеченность в процессы, связанные с болевой чувствительностью (E. W. McCleskey, M. S. Gold, 1999). Возможно, сдвиги pH внутренней среды организма играют регуляторную роль, неодинаково модулируя работу функционально различных нейронных сетей и, как следствие, контролируемых ими форм поведенческой активности (A. V. Sidorov, 2003, 2006).
По-видимому, протон - это самый «простой» лиганд, вовлеченный в процессы межклеточной коммуникации, выступающий, по меньшей мере, в качестве нейромодулятора.
1 В данный раздел включены результаты, полученные автором при выполнении работ по проектам, поддержанным БРФФИ (Б02М-045, Б02М-055).
б
НейронКРеБІ(постсинаптическая клетка)
40 мВ
pH =8,8
(пресинаптическая клетка)
Рис. 103. Влияние pH на пептидергическую (БМ^-амид) моносинаптическую передачу в нервной системе моллюска Lymnaea stagnalis^. а - между нейронами УБ4 и ЯРаБ2; б - между нейронами УБ4 и ЯРеБІ.
Деполяризационное направление ПСП (а) объясняется диффузией С1 - из микроэлектрода и, как следствие, изменением потенциала инверсии для хлора
Абиотические внешние факторы, например температура, также способны радикально изменить протекание процессов межклеточной коммуникации, прежде всего синаптической передачи. Очевидно, что любой из этапов химической передачи сигнала подвержен модулирующему влиянию температуры.
В то же время различные нейромедиаторные системы демонстрируют неодинаковую температурную зависимость эффективности синаптической передачи (рис. 104).
Проницаемость щелевых контактов также подвержена действию температурного фактора (см. гл. 6).
A*
26-28 oC
ii____________L
VD4
б
ТПСП есть
14-16оС
RPeDl
Рис. 104. Влияние температуры на пептидергическую (а) и дофаминергическую (б) моносинаптическую передачу в нервной
системе моллюска Lymnaea stagnalis (по A. V. Sidorov, 2002). Деполяризующий импульс тока в пресинаптический нейрон отмечен чертой
Таким образом, генерализованные влияния факторов объемной передачи сигнала реализуются посредством одномоментного вовлечения в ответную реакцию множества компонентов нейронных сетей.
14-16оС
RPeDl