загрузка...
 
Введение
Повернутись до змісту

Введение

Цитокины — это регуляторные белки, которые образуют универсальную сеть медиаторов, характерную как для иммунной системы, так и для клеток других органов и тканей. Под контролем этого класса регуляторных белков протекают все клеточные события: пролиферация, дифференцировка, апоптоз, специализированная функциональная активность клеток. Эффекты каждого цитокина на клетки характеризуются плейотропностью, спектр эффектов разных медиаторов перекрывается и, в основном, конечное функциональное состояние клетки зависит от влияния нескольких цитокинов, действующих синергично. Таким образом, система цитокинов представляет собой универсальную, полиморфную регуляторную сеть медиаторов, предназначенных для контроля процессов пролиферации, дифференцировки, апоптоза и функциональной активности клеточных элементов в кроветворной, иммунной и других гомеостатических системах организма.

С момента описания первых цитокинов прошло немного времени. Однако их исследование привело к выделению обширного раздела знаний — цитокинологии, являющейся неотъемлемой частью различных областей знания и, в первую очередь, иммунологии, давшей мощнейший толчок к изучению этих медиаторов. Цитокинология пронизывает все клинические дисциплины, начиная от этиологии и патогенеза заболеваний и заканчивая профилактикой и лечением различных патологических состояний. Следовательно, научным исследователям и клиницистам необходимо ориентироваться в разнообразии регуляторных молекул и иметь ясное представление о роли каждого из цитокинов в изучаемых процессах.

Методы определения цитокинов за 20 лет их интенсивного изучения прошли очень быструю эволюцию и сегодня представляют целую область научного знания. Перед исследователями в цитокинологии в начале работы стоит вопрос о выборе метода. И здесь исследователь должен точно знать, какую информацию ему нужно получить для достижения поставленной цели. В настоящее время разработаны сотни различных методов оценки системы цитокинов, которые дают разноплановую информацию об этой системе. Оценивать цитокины в различных биологических средах можно по специфической биологической активности. Можно определять их количественно с помощью целого ряда методов иммуноанализа, использующих поли- и моноклональные антитела. Кроме изучения секреторных форм цитокинов можно изучать их внутриклеточное содержание и продукцию в тканях методами проточной цитофлюориметрии, вестерн- блотинга и иммуногистохимии in situ. Очень важную информацию можно получать, изучая эксп


рессию мРНК цитокинов, стабильность мРНК, наличие изоформ мРНК цитокинов, естественных антисмысловых нуклеотидных последовательностей. Изучение аллельных вариантов генов цитокинов может дать важную информацию о     генетически запрограммированной высокой или низкой продукции того или иного медиатора. У каждого метода есть свои недостатки и свои достоинства, своя разрешающая способность и точность определения. Незнание и непонимание исследователем этих нюансов может привести его к ложным выводам.

Определение биологической активности цитокинов

История обнаружения и первых шагов в изучении цитокинов была тесно связана с культивированием иммунокомпетентных клеток и клеточных линий. Тогда были показаны регуляторные эффекты (биологическая активность) ряда растворимых факторов белковой природы на пролиферативную активность лимфоцитов, на синтез иммуноглобулинов, на развитие иммунных реакций в моделях in vitro. Одна из первых методик определения биологической активности медиаторов — определение фактора миграции человеческих лимфоцитов и фактора ее ингиби- ции [1]. По мере изучения биологических эффектов цитокинов появлялись и различные методы оценки их биологической активности. Так, IL-1 определяли по оценке пролиферации мышиных тимоцитов in vitro, IL-2 — по способности стимулировать пролиферативную активность лимфобластов, IL-3 — по росту гемопоэтических колоний in vitro, IL-4 — по комитогенному эффекту, по усилению экспрессии Ia-белков, по индукции образования IgG1 и IgE и т.д. [4]. Список этих методов можно продолжать, он постоянно пополняется по мере обнаружения новых биологических активностей растворимых факторов. Главный их недостаток — нестандартность методик, невозможность их унификации. Дальнейшее развитие приемов определения биологической активности цитокинов привело к созданию большого числа клеточных линий, чувствительных к тому или иному цитокину, или мультичув- ствительных линий. Сейчас большинство этих цитокинчувствительных клеток можно обнаружить в списках коммерчески распространяемых клеточных линий. Например, для тестирования IL-1a и в используют клеточную линию D10S [18], для IL-2 и IL-15 — клеточную линию CTLL-2 [9], для IL-3, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, GM-CSF — клеточную линию TF-1 [13, 16], для IL-6 — клеточную линию B9 [5], для IL-7 — клеточную линию 2Е8 [11], для TNFa и TNF0 — клеточную линию

L929 [8], для №N7 — клеточную линию WiDr [19], для ^-18 — клеточную линию KG-1 [14].

Однако, подобный подход в изучении имму- ноактивных белков, наряду с хорошо известными преимуществами, такими как измерение реальной биологической активности зрелых и активных белков, высокой воспроизводимостью при стандартизированных условиях, имеет и свои недостатки. К ним можно отнести, в первую очередь, чувствительность клеточных линий не к одному цитокину, а к нескольким родственным цитокинам, биологические эффекты которых перекрываются. Кроме того, нельзя исключить возможность индукции продукции других цитокинов клетками-мишенями, которые могут искажать тестируемый параметр (как правило, это пролиферация, цитотоксичность, хемотаксис). Мы знаем еще не все цито- кины и не все их эффекты, поэтому оцениваем не сам цитокин, а суммарную специфическую биологическую активность. Таким образом, оценка биологической активности как суммарной активности разных медиаторов (недостаточная специфичность), является одним из недостатков этого метода. Кроме того, используя цитокинчувствительные линии, невозможно выявить неактивированные молекулы и связанные белки. Значит, подобные методики не отражают реальной продукции для ряда цито- кинов. Еще один немаловажный недостаток использования клеточных линий — необходимость лаборатории для культуры клеток. Кроме того, все процедуры по наращиванию клеток, инкубированию их с исследуемыми белками и средами требуют больших временных затрат. Также нужно отметить, что клеточные линии при длительном их применении требуют обновления или повторной сертификации, так как в результате культивирования они могут мутировать и модифицироваться, что может приводить к изменению их чувствительности к медиаторам и снижению точности определения биологической активности. Тем не менее, этот метод идеален для тестирования специфической биологической активности рекомбинантных медиаторов.

Количественное определение цитокинов с помощью антител

Продуцируемые иммунокомпетентными и другими типами клеток цитокины выделяются в межклеточное пространство для осуществления паракринных и аутокринных сигнальных взаимодействий. По концентрации этих белков в сыворотке крови или в кондиционной среде можно судить о характере патологического процесса и об
избытке или недостатке определенных функций клеток у больного.

Методы определения цитокинов с помощью специфических антител являются сегодня самыми распространенными системами детекции этих белков. Данные методы прошли через целую серию модификаций с использованием разных меток (радиоизотопных, флюоресцентных, элект- рохемилюминесцентных, ферментных и т.д.). Если радиоизотопные методы имеют ряд недостатков, связанных с использованием радиоактивной метки и ограниченной по времени возможностью использования меченых реагентов (период полураспада), то иммуноферментные методы нашли самое широкое распространение. Они основаны на визуализации нерастворимых продуктов ферментативной реакции, поглощающих свет с известной длиной волны, в количествах, эквивалентных концентрации определяемого вещества. Для связывания измеряемых веществ используются антитела, нанесенные на твердую полимерную основу, а для визуализации — антитела, конъюгированные с ферментами, как правило, щелочной фосфатазой или пе- роксидазой хрена [2, 3].

Достоинства метода очевидны: это высокая точность определения при стандартизованных условиях хранения реактивов и выполнения процедур, количественный анализ, воспроизводимость. К недостаткам можно отнести ограниченный диапазон определяемых концентраций, в результате чего все концентрации, превышающие определенный порог, считаются равными ему. Необходимо отметить, что затраты времени на выполнение метода варьируют в зависимости от рекомендаций производителя. Однако в любом случае речь идет о нескольких часах, необходимых для инкубаций и отмывок реагентов. Кроме того, определяются латентные и связанные формы цитокинов, которые по своей концентрации могут значительно превышать свободные формы, в основном, ответственные за биологическую активность медиатора. Поэтому данный метод желательно использовать вместе с методами оценки биологической активности медиатора.


Другая модификация метода иммуноанализа, которая нашла широкое применение — электро- хемилюминесцентный метод (ЭХЛ) определения белков антителами, меченными рутением и биотином. Этот метод имеет следующие преимущества по сравнению с радиоизотопными и имму- ноферментными: простота выполнения, небольшое время выполнения методики, отсутствие процедур отмывок, малый объем пробы, большой диапазон определяемых концентраций ци- токинов в сыворотке и в кондиционной среде, высокая чувствительность метода и его воспроизводимость [17, 7, 21]. Рассматриваемый метод приемлем для использования как в научных исследованиях, так и в клинических.

Следующий метод оценки цитокинов в биологических средах разработан на основе технологии проточной флюориметрии. Он позволяет одновременно оценивать в образце до сотни белков. В настоящее время созданы коммерческие наборы для определения до 17 цитокинов [12]. Тем не менее, преимущества этого метода определяют и его недостатки. Во-первых, это трудоемкость подбора оптимальных условий для определения нескольких белков, во-вторых, продукция цито- кинов носит каскадный характер с пиками продукции в разное время. Поэтому определение большого количества белков одномоментно не всегда информативно.

Общим требованием методов иммуноанализа, использующих т.н. «сэндвич», является тщательный подбор пары антител, позволяющий определять либо свободную, либо связанную форму анализируемого белка, что накладывает на этот метод ограничения, и что всегда нужно учитывать при интерпретации полученных данных. Этими методами определяется суммарная продукция цитокинов разными клетками, в то же время об антигенспецифической продукции цитокинов им- мунокомпетентными клетками судить можно только предположительно.

В настоящее время разработана система ELISpot (Enzyme-Liked ImmunoSpot), которая в значительной степени устраняет эти недостатки. Метод позволяет полуколичественно оценивать продукцию цитокинов на уровне отдельных клеток [6]. Высокая разрешающая способность этого метода позволяет оценивать антиген-стимулированную продукцию цитокинов, что очень важно для оценки специфического иммунного ответа.

Следующий, широко используемый в научных целях, метод — это внутриклеточное определение цитокинов методом проточной цитофлюори- метрии [20]. Преимущества его очевидны. Мы можем фенотипически охарактеризовать популяцию клеток-продуцентов цитокина и/или определить спектр продуцируемых цитокинов отдельными клетками, при этом имеется возможность относительной количественной характеристики этой продукции. Вместе с тем, описываемый метод достаточно сложен и требует дорогостоящего оборудования.

Следующая серия методов, которая используется в основном в научных целях — это иммуно- гистохимические методы с использованием меченых моноклональных антител. Преимущества очевидны — определение продукции цитокинов непосредственно в тканях (in situ), где происходят различные иммунологические реакции. Однако рассматриваемые методы очень трудоемки и не дают точных количественных данных.

Определение экспрессии генов цитокинов на уровне мРНК

Экспрессия генов цитокинов, как и других белков, осуществляется в несколько этапов: транскрипция, процессинг мРНК, трансляция, процессинг белка и секреция белка. Каждый этап экспрессии генов ци- токинов может регулироваться, поэтому в ряде случаев важно знать не только уровень продукции медиатора, но и характеристики других этапов экспрессии гена. Например, на каком этапе происходит ингибирование экспрессии гена медиатора, какова стабильность специфической мРНК, имеются ли изоформы мРНК, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга и т.д.

Оценку содержания мРНК можно проводить разными способами. Распространенным подходом является гибридизация специфических зондов с пробами РНК, однако чувствительность методики может ограничиваться типом используемых зондов и меток и количеством анализируемой РНК. В качестве специфических зондов используют различные векторы, включающие всю последовательность гена (без интронов) или его часть, или олигонуклеотид- ные зонды к уникальным участкам мРНК, а также комплементарные РНК-зонды. При этом специфичность метода значительно возрастает, и уровень мРНК можно оценить количественно.

Гибридизация in situ относится к наиболее прямым и чувствительным подходам к оценке наличия мРНК цитокинов в тканях и отдельных клетках. Важное место при этом занимает доказательство специфичности полученных сигналов. Кроме того, метод сложен в выполнении и обладает недостаточно высокой воспроизводимостью.


Один из самых современных методов определения экспрессии генов на уровне мРНК — метод обратного реверсирования и полимеразной цепной реакции (RT-PCR). Он обладает рядом преимуществ: во-первых, высокой чувствительностью, позволяющей определить единичные молекулы мРНК в отдельных клетках за счет получения множества копий с кДНК; во-вторых, высокой специфичностью и возможностью анализа целого спектра мРНК за счет использования в реакции амплификации специфических комплементарных олиго- нуклеотидных праймеров к различным участкам кДНК известных цитокинов; в-третьих, высокой воспроизводимостью и быстротой получения результатов, что особенно важно в условиях клинической лаборатории и при проведении научного исследования; в-четвертых, после проведения реакции амплификации количество ДНК достаточно для проведения рестрикционного анализа, секвени- рования, клонирования и т.д., что позволяет изучать механизмы регуляции экспрессии генов цитокинов [22]. Нужно отметить, что только с появлением технологии RT-PCR стало возможным более подробно изучать альтернативный сплайсинг генов цитоки- нов. Дело в том, что разрешающая способность и чувствительность методов, основанных на использовании моноклональных антител, не позволяла изучать этот механизм формирования полиморфной структуры системы цитокинов.

В настоящее время существуют десятки модификаций метода RT-PCR для полуколичественной и количественной оценки специфической мРНК. Это конкурентная RT-PCR, real-time технология и др. Сочетание технологий гибридизации и RT-PCR позволило создать технологию Array-анализа, когда в одном эксперименте можно оценить экспрессию сотен и тысяч генов. Эти технологии используются в основном в научных исследованиях.

Методы оценки аллельного полиморфизма генов цитокинов

Гены цитокинов имеют аллельные варианты, характеризующиеся большей или меньшей активностью белка либо различным уровнем его экспрессии. Исследования связи аллельного варианта с уровнем экспрессии гена либо с участием аллеля в развитии патологического процесса раскрывают фундаментальные основы функционирования генетической системы цитокиновой сети. Методы исследования генетического полиморфизма также достаточно разнообразны. Они делятся на методы анализа известных вариантов и методы поиска новых вариантов. Наиболее распространены подходы, основанные на технологии PCR, и методы Array-анализа. Достаточно разнообразны PCR-методы: это сайт-специфическая амплификация, SSCP-анализ, рестрикционный анализ, высокоэффективный капиллярный электрофорез, секвенирование и т.д. Каждый из них имеет свои особенности применения и разрешающую способность, но все весьма трудоемки и занимают много времени при исследовании больших популяционных выборок. В этой связи все шире применяются автоматизированные лаборатории генетического анализа, и несомненным лидером, имеющим большую перспективу, является метод Array-анализа, сочетающий высокую чувствительность, широкий диапазон применения и практически полную автоматизацию [15].



загрузка...