загрузка...
 
Продукция цитокинов эритрокариоцитами костного мозга больных лимфомами при проведении химиотерапии
Повернутись до змісту

Продукция цитокинов эритрокариоцитами костного мозга больных лимфомами при проведении химиотерапии

В.В. Денисова, А.Д. Кулагин1,2, И.А. Лисуков1,2, И.В. Крючкова1, С.А. Сизикова1, С.В. Сенников1, В.А. Козлов1,2

1 Институт клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск;

Новосибирская государственная медицинская академия

 

В результате изучения иммунных и иммуноре- гуляторных функций эритроидных ядросодержащих клеток (ЭЯК) было показано, что эритрока- риоциты мыши способны к ауторегуляции, подавляют рост малигнизированных клеток и стимулируют естественную противоопухолевую активность клеток костного мозга (КМ) [11]. По крайней мере, часть этих функций эритрокариоциты осуществляют посредством продукции цитокинов. К настоящему времени показана способность ЭЯК различных гемопоэтических органов млекопитающих продуцировать ^-10, ^-2, ^-4, ^-6, ^-10, TGFP1, №N7, ТОТа, VEGF [7, 12]. Эти фундаментальные данные являются объективной основой для изучения роли секреторной функции эритро- кариоцитов в патогенезе опухолевых заболеваний, которые часто сопровождаются нарушением эритропоэза и, как следствие, анемией [5]. Так, анемии диагностируются в среднем у 30 % пациентов с лимфомами и ассоциируются с плохим прогнозом течения заболевания [10].

Несмотря на активную разработку методов иммунотерапии, химиотерапия пока является единственным методом лечения онкогематологи- ческих заболеваний, позволяющим достигать длительных ремиссий или даже выздоровления больных [2]. К сожалению, цитостатики действуют не избирательно и являются ятрогенным повреждающим фактором в отношении нормальных клеток при терапии опухолей [3]. Эритро- кариоциты в данном случае не являются исключением, т. к. постцитостатическая анемия — частое осложнение химиотерапии [3, 9]. Помимо нарушения пролиферации, цитостатики индуцируют функциональные дефекты нормальных клеток, сохраняющиеся в отдаленный период [7,

14]. Подобного действия цитостатиков нельзя исключить и в отношении эритрокариоцитов. Дефекты эритрокариоцитов, индуцированные цитостатиками, могут быть причиной нарушения их синтезирующей функции и, как следствие — дизгемопоэтических состояний [4].

И если значение иммунокомпетентных клеток при разных патологиях изучается активно, то роль иммунорегуляторных функций эритрокари- оцитов практически не исследована. В связи с этим и было предпринято изучение продукции цитокинов эритрокариоцитами КМ больных лим- фомами при проведении химиотерапии.

фирмы-производителя. Для исключения «эффекта матрикса» при обработке полученных результатов в качестве растворов для рекомбинантных цитокинов использовали идентичные среды с одинаковым содержанием сыворотки. Диапазон измерений — от 2 пкг/мл до 32000 пкг/мл. Концентрацию цитокинов рассчитывали при помощи программного обеспечения, поставляемого фирмой Bio-Rad (Bio-PLex Manadger 3.0), относительно стандартных калибровочных разведений. Статистическую обработку полученных результатов проводили непараметрическими методами (программа «Statistica 5.0»).

 

Материалы и методы

Цитокинсинтезирующую активность ЭЯК КМ оценивали у больных агрессивными крупноклеточными неходжкинскими В-диффузными, Т-анапластическими лимфомами (НХЛ) и лим- фомами Ходжкина (ЛХ). В исследование не включались больные с лейкемической трансформацией НХЛ. Все пациенты получали стандартную ПХТ: 1-я линия — CHOP при НХЛ, ABVD при ЛГМ, 2-я линия высокодозной ПХТ— DHAP или BAEM с аутологичной трансплантацией СКК (ауто-ТСКК). Анализ результатов исследований проводили в трех группах: 1-я группа — до лечения, 2-я группа — после 4-8 курсов ПХТ 1-й линии, 3-я группа — после 2-6 курсов ПХТ 2-й линии и/или ауто-ТСКК. Условиями для выборки двух последних групп являлась установленная после рестажирования ремиссия заболевания (для исключения цитокинпродуцирующей активности опухоли), а также восстановление показателей периферической крови (Hb > 100 г/л, нейтрофилы > 500/мкл и тромбоциты >50 тыс/мкл). Контрольную группу составили 16 практически здоровых добровольных доноров в возрасте от 18 до 40 лет. Все группы были сопоставимы по полу и возрасту. Все обследованные были информированы о целях и методах исследования, получено их добровольное согласие.

Аспираты КМ в объеме 15-20 мл получали при проведении трепанобиопсии в период диагностики заболевания и при проведении очередного рестажирования. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли в градиенте плотности фиколла-ве- рографина (1,077 г/см3). Позитивная селекция Гликофорин А (ГкА)-позитивных ЭЯК (ГкА+-ЭЯК) из популяции МНК КМ производилась методом непрямого пеннинга с использованием моноклональных антител к человеческому ГкА (Harlan SeraLab, UK Abcam Ltd., UK, или BD PharMingen, USA). Контроль чистоты выделенной популяции осуществляли стандартной окраской мазка клеточной взвеси по Романовскому-Гимза и окраской внутриклеточного гемоглобина. Процент эритро- идных (гемоглобин-содержащих) клеток составлял более 97%. После селекции ГкА+-ЭЯК культивировали в концентрации 1 млн/мл в течение 24 ч в среде RPMI 1640. Образцы кондиционной среды хранили при -20°С в аликвотах по 120 мкл до момента определения цитокинов.

Количественные значения IL-1P, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12(p70), IL-13, IL-17, TNFa, IFNy, G-GSF, GM-GSF, MCP-1, MIP-1P в кондиционных средах клеточных культур оценивали методом проточной иммунофлюоресценции на двухлучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, США). Перед исследованием кондиционные среды размораживали и фильтровали через одноразовые нитроцеллюлозные фильтры с порами 0,4 мкм в диаметре. Для исследования концентрации цитокинов в 50 мкл образца использовали коммерческую систему HUMAN 17-PLEX (N171A11171) и HUMAN CYTOKINE TH1/TH2 (N171A11081 (Bio-Rad, США) в соответствии с инструкцией

Результаты и обсуждение

Учитывая важную роль гемопоэзиндуцирующе- го микроокружения КМ в функционировании ге- мопоэтических ростков, предварительно была исследована способность общей популяции МНК КМ (из которой впоследствии и были выделены эрит- рокариоциты в результате селекции) нормальных доноров, а также пациентов с лимфомами, спонтанно продуцировать цитокины in vitro [3].

Следует отметить, что, в отличие от периферической крови, МНК КМ, выделяемые на градиенте плотности (1,077 г/см3), помимо лимфоцитов и моноцитов представлены ЭЯК, а также незначительным количеством созревающих клеток гранулоцитарного ростка (промиелоцитов) и бла- стных форм [1].

При изучении спонтанной продукции 9 цитокинов в панели HUMAN CYTOKINE TH1/TH2 мононуклеарными клетками КМ условно здоровых доноров методом проточной иммунофлуори- метрии было обнаружено, что в супернатантах МНК КМ после 24 ч культивирования содержатся определяемые концентрации только TNFa и IL-10 (табл. 1). Присутствие же секреторных форм IL-2, IL-4, IL-5, IL-12, IL-13, IFNyи GM-CSF в кондиционных средах МНК КМ обнаружено не было. Продуцируемые МНК доноров цитокины

Цитокин,

пкг/мл

Доноры

Больные до лечения

Больные после лечения

IL-2

НД

7,599 ± 5,63

НД

IL-4

НД

НД

НД

IL-10

9,822 ± 4,77

8,663 ± 4,87

33,41 ± 13,64

IL-5

НД

НД

НД

IL-12

НД

НД

НД

IL-13

НД

НД

НД

GM-CSF

НД

НД

НД

IFNy

НД

54,46 ± 36,76

62,09 ± 54,02

TNFa

10,794 ± 5,06

27,702 ± 11,39

83,71 ± 43,01

Таблица 1

Примечание. НД — не детектируются.


относятся к разным группам по отношению к воспалительному процессу: TNFa является мощным провоспалительным агентом, тогда как «антици- токиновый цитокин» ^-10 обладает противовоспалительными функциями. Таким образом, несмотря на скудность спектра продуцируемых ци- токинов МНК КМ при данных культуральных условиях, одновременная продукция детектируемых концентраций цитокинов, обладающих ре- ципрокными функциями, свидетельствует о наличии баланса в цитокиновой сети в этой клеточной фракции.

У больных лимфомами, помимо TNFa и ^-10, МНК КМ секретировали в культуральную среду ^-2 и №N7. Наличие в среде МНК больных лимфомами цитокинов №1-профиля ^-2 и №N7 может быть следствием активации противоопухолевого иммунитета. Среди разных пациентов, получивших химиотерапию, а также межнозологи- ческих различий в продукции цитокинов выявлено не было, в связи с чем пациенты после химиотерапии были объединены в общую группу «больные после лечения». В этой группе выявлялось недостоверное повышение продукции TNFa, ^-10 и №N7 МНК в сравнении с группой до лечения, а концентрации ^-2 находились в пределах ошибки метода.

Следует отметить, что ГкА+-клетки составляют до 50 % ядросодержащих клеток КМ [15]. Доля эритроидных клеток в МНК после выделения на градиенте плотности составляла в наших исследованиях в среднем 25 %. Часть эритроид- ных клеток разрушалась, вероятно, вследствие иммунного гемолиза [1]. Принимая во внимание то, что ЭЯК составляли значительную часть МНК, интересным явилось отсутствие большинства цитокинов, продуцируемых чистой популяцией ЭЯК в среде, кондиционированной общей популяцией МНК КМ. Тем не менее данные предшествующих исследований свидетельствуют о том, что обогащенная популяция ГкА+-ЭЯК здоровых доноров продуцирует при тех же культуральных условиях (24-часовая спонтанная продукция) более широкий спектр цитокинов: ^-10, ^-2,

^-4, ^-6, ^-10, TGFP, №N7,

TNFa [7]. Однако в составе общей популяции МНК эритрока- риоциты не проявляют своей способности продуцировать ^-2,

^-4 и №N7 Учитывая эти данные, в дальнейшем была исследована цитокинпро- дуцирующая активность фракции ГкА+-клеток, выделенной из состава МНК аналогичным методом, но с помощью более широкой панели изучаемых белков, для выявления более подробной картины цитокинпродуцирующей активности фракции эритрокариоцитов.

При использовании мультиплексной панели HUMAN 17-PLEX для определения цитокинов человека, включающей IL-1P, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, IFNy TNFa, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 и MIP-ip, нами было подтверждено наличие продукции, ранее показанной для IL-1P, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFNy, TNFa [4], и впервые выявлена способность ГкА+-ЭЯК клеток КМ человека продуцировать IL-8, IL-13, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 и MIP-1P (табл. 2). Учитывая то, что IL-5, IL-7 и IL-12 не детектировались или их определяемые концентрации находились на нижней границе чувствительности метода, было сделано заключение об отсутствии способности ЭЯК КМ секретировать данные белки в используемых культуральных условиях.

Таким образом, эритрокариоциты КМ человека в норме являются одним из источников широчайшего спектра биологически активных веществ: негативных и позитивных регуляторов, участвующих как в аутокринной регуляции эритропоэза, так и в паракринной регуляции гемоиммунопоэза и иммунных функций [8]. Так, продуцируя IL-1, G-CSF и GM-CSF, ЭЯК могут стимулировать пролиферацию ранних гемопоэтических предшественников и дифференцировку клеток миелоид- ного ростка. Посредством продукции МСР-1 и ^-8 эритрокариоциты способны регулировать хемотаксис нейтрофилов и моноцитов/макрофагов в КМ. ^-2, №N7 эритроидной природы являются потенциальными индукторами ТЫ-клеточного ответа, а ^-4, ^-6, ^-10, IL-13, TNFа могут активировать Th2-зависимый гуморальный иммунитет. Значительный уровень продукции ^-6 свидетельствует о возможном прямом влиянии ЭЯК на пролиферацию В-лимфоцитов и функцию плазматических клеток. Кроме того, способность к продукции ^-10, TGFpl и М1Р-1Р отражает наличие имму- носупрессорной, а №N7 и TNFа — противоопухолевой активности ЭЯК КМ. А учитывая, что ЭЯК экспрессируют рецепторы к некоторым ци- токинам, вероятен также механизм аутокринной регуляции эритропоэза. Учитывая эти результаты, а также данные литературы о роли ряда ци- токинов в развитии нарушений эритропоэза при развитии опухолей, следующим этапом исследования явилось изучение особенностей продукции цитокинов, секретируемых ЭЯК, у больных лим- фомами. Кроме того, химиотерапия опухолей является ятрогенным повреждающим фактором в отношении эритроидного ростка КМ [9]. Поэтому цитокинпродуцирующая активность ЭЯК была изучена и в группе больных, получивших ХТ. После статистической обработки результатов была показана достоверно более низкая продукция цитокинов ^-6, ^-8, ^-17, G-CSF, МСР-1 и М1Р- 1Р эритрокариоцитами КМ у больных лимфомами (см. табл. 2). После проведения программ химиотерапии и достижения ремиссии опухоли продукция вышеуказанных цитокинов оставалась сниженной. ЭЯК больных лимфомами, как и клетки доноров, не продуцировали ^-5 и ^-7 и ^-12.

Таким образом, обогащенная популяция эритро- идных ГкА+-клеток КМ у больных лимфомами также способна продуцировать широчайший спектр иммуногеморегуляторных цитокинов подобно нормальным эритрокариоцитам доноров. Однако, в целом, цитокинпродуцирующая способность данных клеток значительно снижена у больных как до, так и после химиотерапии, несмотря на достижение ремиссии основного заболевания. Принимая во внимание тот факт, что в составе МНК эритрока- риоциты не проявляют всей своей цитокинсинте- зирующей активности, можно предположить наличие негативного контроля со стороны костномозгового микроокружения [3]. Этот механизм может быть особо патогенетически значимым при патологии, сопровождающейся гиперактивацией иммуно- компетентного микроокружения, что характерно для опухолевого процесса [6]. Повреждение микроокружения КМ, а, возможно, и самих эритроидных предшественников, в процессе ПХТ, — важный механизм длительных постцитостатических дизгемопо- этических состояний [13]. Учитывая способность ЭЯК к ауторегуляции и наличие рецепторов к ци- токинам, можно предположить нарушение ауток- ринной регуляции эритропоэза в условиях недостаточности секреторной функции эритрокариоцитов при персистенции опухоли или проведении химиотерапии, что может быть причиной канцеринду- цированных, постцитостатических анемий. Способность к продукции цитокинов, препятствующих прогрессии опухоли, может являться естественным механизмом эритроопосредованного противоопухолевого надзора. В случае лимфопролиферативных заболеваний этот механизм представляется наиболее вероятным, учитывая конкурентные взаимоотношения эритроидного и лимфоидного ростков в норме, а также при лимфомогенезе.

Технология мультиплексного анализа уровня цитокинов с использованием анализатора Bio- Plex Protein Assay System (Bio-Rad, USA) позволила нам показать более широкий спектр цито- кинов, продуцируемых ГкА+-ЭЯК, в норме, и впервые выявить особенности секреторной функции эритрокариоцитов у больных лимфомами при химиотерапии, что предполагает огромный иммуногеморегуляторный потенциал эритрока- риоцитов КМ в норме и при патологии.

У пациентов с лимфомами до лечения, а также в период цитостатически индуцированной ремиссии выявлен выраженный дефект способности эритро- кариоцитов спонтанно продуцировать ряд цитоки- нов, заключающийся в недостаточной их секреции в сравнении с уровнем продукции у доноров.

Понимание особенностей продукции цитокинов всеми клеточными популяциями КМ при различных заболеваниях поможет создать более полную картину внутрикостномозговой цитокиновой сети, что может быть использовано для разработки более полноценных методов цитокинопрофилактики, цитокинотерапии и цитокинореабилитации больных после агрессивных методов лечения.

 

 

ЛИТЕРАТУРА

 

Кулагин А.Д., Лисуков И.А., Киселев С.В. и др. Взаимосвязь нарушений ге- мопоэза и иммунных дефектов у больных злокачественными лимфомами с тяжелой цитостатической предлеченностью // Гематол. трансфузиол. —

— № 6. — С. 6-10.

Новицкий В.В., Степовая Е.А., Гольдберг В.Е. и др. Эритроциты и злокачественные образования. — Томск: STT, 2000. — 288 с.

Павлов А.Д., Морщакова Е.Ф. Этиология и патогенез анемии при злокачественных новообразованиях // Вопр. гематол., онкол. иммунол. в педиатрии. — 2004. — Т. 3, № 1. — С. 50-55.

Сенников С.В., Козлов В.А. Цитокин-синтезирующая активность эритроидных

ядросодержащих клеток. В сб.: «Система цитокинов». — Новосибирск: Наука, 2004. — С. 63-79.

Ярилин А.А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и при патологии // Иммунология. — 1997. — № 5. — P. 7-14.

Groopman J.E., Itri L.M. Chemotherapy-induced anemia in adults: incidence and treatment // J. Natl. Cancer Inst. — 1999. — Vol. 91, № 19. — P. 1616-1634.

Moullet I., Salles G., Ketterer N. et al. Frequency and significance of anemia in non-Hodgkin's lymphoma patients // Ann. Oncol. — 1998. — Vol. 9, №10. — P. 1109-1115.

Seledtsov V.I., Taraban V.Y. et al. Tumor growth inhibitory and natural suppressor activities of murine bone marrow cells: a comparative study // Cell. Immunol. — 1997. — Vol. 182, № 1. — P. 12-19.

Majka M., Janowska-Wieczorek A., Ratajczak J. et al. Numerous growth factors, cytokines, and chemokines are secreted by human CD34(+) cells, myeloblasts, erythroblasts, and megakaryoblasts and regulate normal hematopoie- sis in an autocrine/paracrine manner // Blood. — 2001. — Vol. 97, № 10. — P. 3075-3085.

Soligo D.A., Lambertenghi Deliliers G., Servida F. et al. Haematopoietic abnormalities after autologous stem cell transplantation in lymphoma patients // Bone Marrow Transplant. — 1998. — Vol. 21, № 1. — P. 15-22.

Schwartz G.N., Warren M.K., Rothwell S.W. et al. Post-chemotherapy and cytokine pretreated marrow stromal cell layers suppress hematopoiesis from normal donor CD34+ cells // Bone Marrow Transplant. — 1998. — Vol. 22, № 5. — P. 457-468.

Yurchenco P.D., Furthmayr H. Expression of red cell membrane proteins in eryth- roid precursor cells // J. Supramol. Struct. — 1980. — Vol. 13, № 2. — P. 255-269.

 

Cytokine production by erythroid marrow nuclear cells in lymphoma patients after chemotherapy

V.V. Denisova, A.D. Kulagin1',I.A. Lisukov1'2,I.V. Kruchkova1, 5.A. Sizikova1,

S.V. Sennikov1, V.A. Kozlov1,2

Institute of Clinical Immunology SB RAMS, Novosibirsk, 2 Novosibirsk State Medical Academy

Erythroid nuclear cells (ENC) produce a number of cytokines which regulate normal hemopoiesis. Gly- cophorin A+ (GlA+) ENC isolated from bone marrow of normal individuals and lymphoma patients before and after chemotherapy were used to investigate the comparative features of cytokine production by the erythroid progenitors. Analysis was performed in groups: 1) normal individuals, 2) lymphoma patients (aggressive non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's lymphoma) before chemotherapy, 3) patients after hematological recovery from chemotherapy (CHOP-like, BEAM) or/and followed by autologous peripheral blood stem cells transplantation (PBSCT). ENC were isolated from bone marrow by panning procedure using specific antibodies to GlA. After cultivation, cytokine concentration in the cells' condition medium was measured by multiplex cytokine array assay (BioPlex, BioRad, USA) using a Human- plex panels. Spontaneous production of IL-1P, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IL-17, TNFa, IFNy, G-CSF, GM-CSF, MCP-1, MIP-ip, but not IL-5, IL-7, IL-12(p70) by bone marrow MNC and ENC in vitro was revealed. All lymphoma patients showed a significant decrease of IL-ip, IL-4, IL-10, IL-6, IL-8, IL-17, G-CSF, MCP-1, MIP-ip production by ENC compared to healthy donors (p < 0,05). Cytokine-synthesizing activity of lymphoma patients' marrow ENC did not reach normal level in complete remission. Abnormal cytokine-synthesizing activity of GlA+ bone marrow cells in lymphoma patients after chemotherapy may be related to possible intrinsic erythroid cells defect or inadequate regulation by haemopoietic microenvironment. (Cytokines and Inflammation. 2005. Vol. 4, № 4. P. 17-21.)

Key words: cytokines, erythroid nuclear cells, lymphoma, chemotherapy.

Государственное учреждение Научно-исследовательский институт клинической иммунологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14 Телефон (3832) 22-26-74, факс (3832) 22-70-28



загрузка...