загрузка...
 
Цитотоксическая активность натуральных киллерных клеток селезенки крыс при стрессе и ее коррекция короткими иммуномодулирующими пептидами
Повернутись до змісту

Цитотоксическая активность натуральных киллерных клеток селезенки крыс при стрессе и ее коррекция короткими иммуномодулирующими пептидами

А.В. Гумен, С.Н. Шанин, И.А. Козинец, В.В. Малинин, Е.Г. Рыбакина

Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН;

ГУ «НИИ экспериментальной медицины РАМН», Санкт-Петербург

Исследовали функциональную активность NK-клеток селезенки нормальных, нестрессированных и подвергнутых электроболевому раздражению задних конечностей крыс «№151аг», а также возможность коррекции изменений функции NK-клеток короткими синтетическими пептидами. Стимуляция или подавление цитотоксической активности NK-клеток селезенки зависели от режимов стрессирования животных. Пептиды вилон, эпиталон и кортаген обладали модулирующим действием на цитотоксическую активность NK-клеток селезенки крыс, нарушенную в результате элек- троболевых воздействий. Вилон и эпиталон снижали цитотоксичность NK-клеток, повышенную после двукратного электроболевого воздействия, и усиливали ее в случае подавления, вызванного жестким однократным электрораздражением; при этом эпиталон в большинстве использованных концентраций оказывал нормализующее действие на измененную функциональную активность спленоцитов, восстанавливая ее до базального уровня. Кортаген не влиял на цитотоксичность спленоцитов нестрессированных животных, но вел себя как наиболее мощный стимулятор подавленной при стрессе цитотоксической активности NK-клеток. Результаты служат фундаментальной предпосылкой для разработки способа использования пептидных иммуномодуляторов с целью коррекции стресс-индуцированных дисфункций иммунной системы. (Цитокины и воспаление. 2006. Т. 5, № 2. С. 37-41.)

Ключевые слова: стресс, короткие пептиды, натуральные киллерные клетки.

 

В механизмах развития дисфункций иммунной системы при стрессе определяющую роль играют эндогенные биорегуляторы, в том числе регуляторные пептиды. В настоящее время в качестве одного из перспективных подходов к коррекции нарушенных функций иммунной системы рассматривается исследование и последующее использование препаратов, модулирующих активность защитных функций организма, в частности, функциональную активность иммунокомпетент- ных клеток, в том числе моноцитов, лимфоцитов, натуральных киллерных клеток. Эта стратегия в большой мере основывается на использовании иммуномодулирующих препаратов пептидной природы, разрабатываемых на основе цитокинов, адгезионных молекул, регуляторных пептидов.

Высокой биологической активностью обладают не только природные, но и синтетические пептиды — структурные аналоги эндогенных пептидов или их фрагментов. Дипептид вилон, синтезиро-

ванный на основании данных аминокислотного анализа комплексных препаратов тимуса, обладает выраженными свойствами иммуномодулятора [1, 2, 5]. Созданный на основе анализа пептида эпифиза эпиталамина, тетрапептид эпиталон, нормализует некоторые нарушенные нейроэндокринные и иммунные показатели у животных [8, 9]. Несомненными перспективами использования для коррекции нарушенных функций мозга и, по-видимому, функциональной активности клеток иммунной системы обладает тетрапептид корта- ген — синтетический аналог пептидных биорегуляторов из коры головного мозга [4].

Принципиально значимым результатом исследования биологической активности этих пептидов явилось установление модулирующего действия вилона и эпиталона на комитогенную активность цитокина интерлейкина 10 (^-10) — одного из ключевых регуляторов защитных функций организма, играющего важную роль в развитии стрес- сорной реакции [3], а также на внутриклеточную трансдукцию его сигнала [5].

Настоящее исследование проведено на примере анализа изменений функциональной активности NK-клеток селезенки крыс при стрессорных воздействиях различной длительности и интенсивности, а также возможности их коррекции с помощью коротких синтетических пептидов — вилона, эпиталона и кортагена.

Материалы и методы

Эксперименты выполнены на 22 крысах-самцах «Wistar» массой 160-200 г. До введения в эксперимент животных в течение 5 дней приучали к экспериментальной обстановке. В качестве модели экспериментального стресса использовано электроболевое раздражение задних конечностей крыс в 2 режимах.

Экспериментальные группы животных:

Интактные животные;

Контрольные животные, подвергнутые ложному электро- болевому раздражению (помещенные в контейнеры с подведением электродов при выключенном приборе) в том же временном режиме, что и соответствующая группа опытных животных;

Животные, подвергнутые электроболевому раздражению задних конечностей в области голеностопного сустава постоянным током в 1,5 мА, продолжительность импульса —

сек, 4 импульса в мин, в случайном порядке, дважды, по 30 мин (в 10 и 16 часов);

Животные, подвергнутые электроболевому раздражению задних конечностей в том же режиме электрораздражения однократно, в течение 60 мин (в 10 часов).

Селезенки извлекали через 20 часов после завершения

аппликации двухэтапного стресса и через 2 часа после прекращения одноразового электроболевого раздражения; из них выделяли спленоциты. Отмытые спленоциты разводили в среде RPMI-1640 с добавлением 10 % инактивированной фетальной сыворотки («Биолот», Санкт-Петербург). В качестве мишеней для NK-клеток селезенки крыс использовали клетки миелолейкоза человека К-562 (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург), которые поддерживали in vitro в среде RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки, 2 мМ глютамина, 1,2 мМ HEPES (pH 7,3), 1,2 % глюкозы и

08 мг/мл гентамицина (Sigma). Клетки-мишени метили 3Н- уридином (В/О «Изотоп», Россия). Смесь инкубировали в СО2- инкубаторе при 37 °С, 100 % влажности и 5 % СО2 в течение

часов. Затем клетки ресуспендировали в среде RPMI-1640 с 10 % фетальной сывороткой из расчета 2 х 105 клеток/мл с добавлением 20 мкг/мл РНКазы (Sigma). Для оценки цито- токсической активности NK-клеток селезенки в каждую лунку круглодонных планшетов (Sarstedt, USA) вносили суспензии клеток-эффекторов и клеток-мишеней в соотношении эффектор:мишень = 50:1.

Препараты исследуемых пептидов вносили в суспензии клеток в концентрациях 1,0 х 103, 0,5 х 103, 0,25 х 103,

125 х 103 и 0,0625 х 103 нг/мл. Планшеты инкубировали в течение 20 часов в СО2-инкубаторе при 37 °С с 5 % СО2 и 100 % влажности. Реакцию между NK-клетками селезенки и клетками-мишенями учитывали количественно при использовании жидкостного сцинтилляционного ?-счетчика (Beckman, USA) по уровню меченого уридина в нелизированных клетках-мишенях в течение 1 мин (имп./мин). Цитотоксическую активность NK-клеток селезенки в% рассчитывали по формуле:

Специфическая цитотоксичность =

(1 - среднее число импульсов (имп./мин) в тест-ячейке)

=    х 100.

среднее число импульсов (имп./мин) в контроле

В работе применялись короткие синтетические пептиды: Lys-Glu (вилон), ALa-GLu-Asp-GLy (эпиталон) и ALa-GLu-Asp-Pro (кортаген), созданные в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Результаты исследования обработаны статистически с применением критерия t-Стьюдента. Данные представлены в виде средних значений ± ошибка среднего.

Результаты и обсуждение

Установлено, что спленоциты интактных и контрольных животных, не подвергнутых электроболевому раздражению конечностей, оказывают ци- тотоксическое действие на клетки опухолевой линии К-562 (рис. 1). Специфическая активность спленоцитов интактных животных при оптимальном для условий опыта соотношении эффектор: мишень = 50:1, составляла 30 ± 5 %, контрольных животных — 32 ± 4 %. Внесение вилона в суспензию клеток усиливало цитотоксическое действие МК-клеток селезенки нестрессированных (интактных и контрольных) крыс до 45 ± 7 % — 58 ± 7 % во всем диапазоне использованных концентраций (0,0625 х 103 — 1,0 х 103 нг/мл) (см. рис. 1). Такое же выраженное усиление цитотоксической активности МК-клеток селезенки (до 58 ± 7 %) наблюдалось и при добавлении в инкубационную среду эпиталона во всех исследованных концентрациях. Кортаген, напротив, не вызывал достоверного увеличения цитотоксической активности МК-клеток селезенки, а в концентрации 0,0625 х 103 нг/мл даже подавлял ее (см. рис. 1).

Через 2 часа после окончания повторного 30-минутного электроболевого раздражения задних конечностей крыс цитотоксическая активность МК-клеток селезенки не изменялась, через 20 часов она существенно возрастала до 57 ± 7 % по сравнению с уровнем цитотоксичности спле- ноцитов интактных и контрольных животных (рис. 2). При добавлении в инкубационную среду вилона снижалась цитотоксическая активность МК-клеток, достоверная при концентрациях пептида от 0,125 х 103 до 1,0 х 103 нг/мл. Эпиталон во всех использованных концентрациях подавлял цитотоксичность спленоцитов, стимулированную повторным 30-минутным элек- троболевым раздражением животных. При концентрациях эпиталона 0,5 х 103, 0,25 х 103 и

0625 х103 нг/мл цитотоксическая активность МК-клеток возвращалась к значениям, не отличающимся от значений базальной активности спле- ноцитов интактных и контрольных крыс (см. рис. 2). Кортаген в условиях эксперимента только в концентрациях 0,125 х 103 и 0,5 х 103 нг/мл вызывал снижение цитотоксичности NK-клеток ДО 38-39 ± 5 %.

Подпись: Рис. 1. Изменение цитотоксической активности МК-клеток селезенки нестрессированных крыс под действием вилона, эпиталона и кортагенаПодпись: * — p < 0,05 по сравнению с цитотоксической активностью М1К-клеток интактных и контрольных животных.Подпись: 70тПодпись: 0,5 0,25 0,125
Концентрация пептидов (х 103 нг/мл)
Подпись: 0,0625Подпись: Активность МК-клеток селезенки животных: Н — интактных [ЕЕ| — контрольных 53 — стрессированных ? — после внесения в суспензию клеток вилона — эпиталона ? — кортагенаВ отличие от двукратной (по 30 мин каждая) аппликации электроболево- го стресса, однократное длительное (в течение 1 часа) электрораздражение задних конечностей крыс через 2 часа после прекращения процедуры стрессирования приводило к существенному снижению цитотоксической активности NK-клеток селезенки (с 39 ± 3 % у интактных и 37 ± 5 % у контрольных животных до 5 ± 1 % — у стрессированных) (рис. 3). Внесение вилона в суспензию спленоцитов во всех использованных концентрациях, кроме концентрации 0,125 х 10° нг/мл, вызывало повышение цитотоксической активности NK-клеток, сниженной в результате электроболевого воздействия. Эпиталон во всем диапазоне использованных концентраций также усиливал цитотоксичность NK-клеток по сравнению с активностью клеток стрессированных животных, восстанавливая ее (во всех концентрациях, кроме 0,5 х 103 нг/мл) до значений базальной активности клеток у интактных и контрольных животных, то есть более высоких, чем в случае применения вилона (см. рис. 3). Однако наиболее выраженной способностью к восстановлению нарушенной в результате электроболевого воздействия цитотоксической активности NK-клеток селезенки обладал кортаген, повышавший ее до значений базального уровня у интактных и контрольных животных, а при трех использованных концентрациях (1,0 х 103, 0,25 х 103 и 0,125 х 103 нг/мл) — выше этих уровней.

Таким образом, пептиды вилон и эпиталон при внесении их в суспензию спленоцитов нестрессированных крыс в концентрациях 1 х 103, 0,5 х 103,

25 х 103, 0,125 х 103 и 0,0625 х 103 нг/мл вызывают повышение цитотоксичес- кой активности NK-клеток селезенки. Кортаген не вызывает усиления цитотоксической активности NK-клеток интактных и контрольных животных, а при концентрации 0,0625 х 103 нг/мл даже подавляет ее. Концентрации пептидов были выбраны, исходя из данных экспериментов, в которых были исследованы их иммуномодулирующие свойства в условиях in vitro [2, 9]. Оптимальное для условий опыта соотношение эффектор: мишень = 50:1 выбрано в результате скрирез различные промежутки времени. Режимы электроболевого раздражения задних конечностей крыс, известного в литературе как «footshock» [6, 7], были специально отработаны с целью стимуляции и угнетения цитотоксической активности NK-клеток селезенки.

При использовании этих экспериментальных моделей было установлено, что обусловленные стрессом изменения функциональной активности спленоцитов зависят от временного режима элек- троболевого воздействия: кратковременное двукратное (по 30 мин каждое) электроболевое раздражение при условии забора материала через 20 часов приводит к стимуляции цитотоксической активности NK-клеток селезенки, а длительное однократное воздействие с удалением селезенки через 2 часа после его окончания, вызывает подавление цитотоксичности спленоцитов.

Пептиды вилон, эпиталон и кортаген обладают модулирующим действием на цитотоксическую активность NK-клеток селезенки крыс, нарушенную в результате электроболевых воздействий в различном режиме. Вилон и эпиталон снижают цитотоксичность NK-клеток, повышенную после двукратного электроболевого воздействия, и усиливают ее в случае подавления, вызванного жестким однократным электрораздражением. Однако отличительной особенностью действия эпиталона является то, что он в большинстве использованных концентраций восстанавливает до базального уровня цитотоксическую активность NK-клеток селезенки, повышенную после двукратного элект- роболевого воздействия и сниженную после жесткого однократного электрораздражения, оказывая нормализующее действие на измененную функциональную активность спленоцитов.

Из трех исследованных пептидов кортаген, не оказывающий стимулирующего влияния на цитотоксическую активность спленоцитов нестрессиро- ванных животных, обладает наиболее выраженным эффектом действия в отношении подавленной цитотоксичности МК-клеток селезенки животных, подвергнутых жесткому однократному электороболевому стрессу, проявляя себя как наиболее мощный стимулятор измененной цитотоксической активности МК-клеток селезенки.

В настоящее время наибольшую значимость в качестве потенциальных лекарственных средств приобретают те пептиды, которые не вмешиваются в нормально протекающие физиологические процессы, но оказывают корригирующее действие в условиях измененных функций иммунной системы. В проведенном исследовании таким пептидом является кортаген.

Сравнивая действие вилона, эпиталона и корта- гена в норме и при стрессе, необходимо подчеркнуть, что эпиталон и кортаген оказывают своеобразное нормализующее действие на проявление цитотоксической активности МК-клеток селезенки, нарушенной в результате стрессорного воздействия, повышая сниженную и понижая повышенную цитотоксичность спленоцитов, проявляя, таким образом, стресс-протективные эффекты.

Полученные данные находятся в соответствии с результатами предыдущих исследований, в которых стресс-протективное действие эпиталона было установлено на моделях реакции бласттранс- формации тимоцитов и трансдукции сигнала ци- токина ^-10 по сфингомиелиновому пути в мембранах клеток коры головного мозга мышей, подвергнутых действию как иммуностимулирующего, так и иммуносупрессирующего стрессов [9]. Полученные ранее данные об иммунопротективном действии при стрессе таких цитокинов, как ^-10, а также дефенсинов [10, 11] согласуются с результатами исследования, в котором было показано потенцирующее действие вилона и эпиталона на ко- митогенные и сигнальные эффекты ^-10 [5].

Таким образом, результаты исследования являются фундаментальной предпосылкой для разработки способа использования натуральных и синтетических пептидных иммуномодуляторов с целью коррекции стресс-индуцированных дисфункций иммунной системы.

Работа поддержана грантом РФФИ № 03-04-49236.


ЛИТЕРАТУРА

Киселева Е.П., Огурцов Р.П., Попова О.Я. и др. Сравнительная характеристика двух пептидных иммуномодуляторов // Иммунология. — 1999. — № 2. — С. 23-26.

Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., Малинин В.В. Пептидные тимомиметики. — СПб.: Наука, 2000. — 158 с.

Рыбакина Е.Г., Корнева Е.А. Трансдукция сигнала интерлейкина-1 в процессах взаимодействия нервной и иммунной систем организма // Вест. РАМН. — 2005. — № 7. — С. 3-8.

Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., Чалисова Н.И., Окулов Б.В. Влияние пептидов головного мозга на клетки нерной ткани in vitro // Цитология. — 1997. — Т. 39, № 7. — С. 571-575.

Хавинсон В.Х., Рыбакина Е.Г., Малинин В.В. и др. Влияние коротких пептидов на реакцию бласттрансформации тимоцитов и процесс сигнальной трансдукции по сфингомиелиновому пути // Бюлл. экспер. биол. мед. —

Т. 133, № 5. — С. 574-577.

BruijnzeeL A.W., Stam R., Wiegant V.M. LY354740 attenuates the expression of long-term behavioral sensitization induced by a single session of foot shocks // Eur. J. Pharmacol. — 2001. — Vol. 426, № 1-2. — P. 77-80.

Endo Y., Shiraki K. Behaviour and body temperature in rats following chronic foot shock or psychological stress exposure // Physiol. Behav. — 2000. — Vol. 71, № 3-4. — P. 263 — 268.

Khavinson V.Kh., Goncharova N.P., Lapin B. Synthetic tetrapeptide epitalon restores disturbed neuroendocrine regulation in senescent monkeys // Neu- roendocrinol. Let. — 2001. — Vol. 22, № 4. — P. 251-254.

Khavinson V.Kh., Korneva E.A., Malinin V.V. et al. Effect of epitalon on inter- leukin-lb signal transduction and the reaction of thymocyte blast transformation under stress // Neuroendocrinol. Let. — 2002. — Vol. 23, № 5-6. — P. 411-416.

Korneva E.A., Rybakina E.G., Orlov D.S. et al. Interleukin-1 and defensines in thermoregulation, stress and immunity // Ann. N. Y. Acad. Sci. — 1997. — Vol. 813. — P. 465-473.

Rybakina  E.G., Shanin S.N., Kozinets I.A., et al. Cellular mechanisms of cold stress-related immunosuppression and the action of interleukin-1 // Int. J. Tissue React. — 1997. — Vol. 19. — P.135-140.



загрузка...