загрузка...
 
Использование дрожжей Pichia pastoris в качестве продуцента рекомбинантного у-интерферона быка
Повернутись до змісту

Использование дрожжей Pichia pastoris в качестве продуцента рекомбинантного у-интерферона быка

Я.В. Николаев, Л.В. Парфенова, М.В. Падкина, М.Н. Смирнов

Лаборатория биохимической генетики Биологического НИИ СПбГУ

IFNy обладает широким спектром действия в организме. Он обеспечивает устойчивость клеток к заражению вирусами, совместно с другими цитокинами ингибирует рост трансформированных клеток, является одним из факторов, активирующих макрофаги, оказывает иммуномодулирующее действие. Такое
свойство IFNy, как активация Т-хелперов и макрофагов, дает возможность использования его в терапии инфекций, вызванных микробами, грибами, простейшими и вирусами. IFNy, с одной стороны, активирует специфический клеточный иммунитет, а с другой — стимулирует естественные киллеры и цитотоксичность макрофагов, повышая неспецифическую резистентность организма к перечисленным выше патогенам. Множество биологических активностей IFNy открывает перспективы использования его в качестве терапевтического средства. Проблему получения биологически активного препарата этого белка нельзя было решить традиционным способом — выделением из крови — ввиду ограниченности ресурсов донорской крови, а также опасности распространения вирусов. В настоящее время наиболее перспективным подходом для получения биологически активных препаратов в значительных количествах является применение микроорганизмов в качестве продуцентов белков. Использование для гетерологичной экспрессии дрожжей Pichia pastoris представляет особый интерес. Это позволяет существенно повысить выход рекомбинантных белков и получать, наряду с внутриклеточными, аутентичные секреторные формы этих белков. Известно, что гликопротеины, секретируемые дрожжами Pichia pastoris, не содержат маннозных остатков, связанных а1—3-связями и являющихся сильными антигенными детерминантами, что делает возможным клиническое применение рекомбинантных белков. Ген IFNy быка был клонирован в составе вектора pPIC9 под контролем промотора гена ал- когольоксидазы. В результате трансформации линейной формой плазмиды получен стабильный штамм дрожжей, секрети- рующий белок в культуральную жидкость при индукции метанолом. При анализе полученных клонов методом полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров было показано наличие гена IFNy в хромосомной ДНК дрожжей. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии доде- цилсульфата натрия показал, что полученный дрожжевой штамм секретирует, помимо собственных белков, белок с молекулярной массой, соответствующей гамма-интерферону. По результатам иммуноферментного анализа, секретируемый белок был идентифицирован как IFNy. Уровень продукции рекомбинантного белка составил 10—15 мг на 1 л среды.

Таким образом, нами была разработана схема получения рекомбинантного IFNy быка. Гомогенный секретируемый IFNy можно использовать в качестве лекарственного препарата для лечения инфекционных заболеваний различной этиологии.



загрузка...