C помощью иммуноферментного метода определяли уровень растворимых форм ^-форм) мембранных антигенов ICAM-1 ^54), ICAM-3 ^50), CD18, CD38, а также димерные формы растворимых ICAM-1 и CD38 антигенов в сыворотке крови больных урогенитальным хламидиозом (УГХ). Показано, что достоверное повышение при УГХ содержания растворимых молекул адгезии CD50 и CD54, а также их растворимого лиганда — CD18 антигена (Р2-субъединицы интегринов) сопровождалось признаками дисбаланса в их содержании. Обнаружено увеличение сывороточной концентрации sCD38 антигена у больных УГХ, однако статистически значимым оказалось изменение только димерной фракции данного белка. Полученные результаты позволяют говорить о возможном влиянии растворимых антигенов адгезии ICAM-1, ICAM-3, CD18 и растворимого CD38 антигена на иммунопатогенетические механизмы развития хламидийной инфекции.
Ключевые слова: урогенитальный хламидиоз, растворимая форма 1САМ-1, растворимая форма 1САМ-3, растворимая форма Сй18, растворимая форма CD38
В последние годы среди множества воспалительных заболеваний урогенитального тракта все большее распространение получает хламидийная инфекция. Возбудители хламидиоза — облигатные внутриклеточные паразиты — не относятся к патогенам, представляющим особую опасность, но на фоне ухудшения экологической ситуации снижение иммунитета приводит к латентным и персистирующим формам инфекций, вызывая поражение различных систем и органов. В частности, они являются причиной негонококковых урогенитальных инфекций, приводящих к внутриутробному инфицированию плода, невынашиванию беременности, бесплодию, что в целом имеет неблагоприятные последствия для репродуктивного здоровья населения.
Иммунологические изменения, выявленные различными авторами при урогенитальном хла- мидиозе (УГХ), характеризуются вариабельностью и неоднозначностью. Так, по результатам многих исследований, анализ факторов иммунологической защиты при хронической хламидийной инфекции свидетельствует об угнетении всех звеньев иммунитета [3]. Нарушения в системе иммунореактивности, затрагивающие клеточный иммунитет, проявляются в уменьшении общего количества Т-лимфоцитов (CD3+), CD4+ Т- лимфоцитов и HLA-DR+-лимфоцитов, а также в снижении иммунорегуляторного индекса (соотношения CD4+/CD8+ клеток), что способствует длительной персистенции возбудителя в организме [4].
В основе иммунного ответа лежат межклеточные и межмолекулярные взаимодействия, важную роль в реализации которых играют мембранные белки клеток иммунной системы. Известно, что мембранные белки могут иметь растворимые аналоги (так называемые s-формы), образующиеся за счет шеддинга или альтернативного сплайсинга матричной РНК. Растворимые формы мембранных антигенов представляют собой новый класс иммунорегуляторных молекул, которые участвуют в передаче сигнала клетке или, наоборот, выполняют функции ограничителей иммунных реакций. В настоящее время насчитывается более 260 дифференцировочных антигенов системы гемопоэза, однако информация о количественном содержании растворимых форм мембранных антигенов в сыво-
ротке крови и их функциональной роли в норме и при патологии, в том числе и при бактериальных воспалительных инфекциях, получена лишь для немногих из них. Тем не менее исследования, проведенные в различных лабораториях, выявили, что ряд дифференцировочных антигенов гемопоэтических клеток могут обнаруживаться в значительных количествах в сыворотке крови и выполнять роль диагностических и прогностических маркеров при ряде заболева- ниий. Изменение концентрации s-форм диффе- ренцировочных антигенов в биологических жидкостях может вызывать множественные эффекты, отражающие патогенетические механизмы, с одной стороны, и вносящие свой вклад в нарушение гомеостаза при различных заболеваниях, с другой стороны [5].
Целью настоящего исследования явилась оценка при урогенитальном хламидиозе сывороточных уровней растворимых форм мембранных антигенов, принадлежащих к функциональной группе молекул межклеточной адгезии.
В работе использованы образцы сыворотки крови 32 больных урогенитальным хламидиозом, положительные в реакции прямой иммунофлуоресценции. Образцы были получены из Сормовского кожно-венерологического диспансера Нижнего Новгорода. Контрольную группу составили образцы сыворотки крови 80 здоровых доноров, сопоставимых по возрасту и полу с больными УГХ.
Краткая характеристика антигенов адгезии, сывороточная концентрация которых оценивались в настоящей работе, представлена в таблице.
Содержание в сыворотке крови антигенов sCD50, sCD54 и его димера (sCD54-димер), sCD18, sCD38 антигена и его димерной фракции (sCD38-димер) определяли с помощью твердофазного иммуноферментного метода с применением моноклональных антител (МКА) серии ИКО (ИК0-60, ИКО-184, ИК0-108, ИК0-20 соответственно) [2] и поликлональных антител, направленных против поверхностных антигенов мононуклеарных клеток периферической крови человека.
На первом этапе при определении антигенов sCD50, sCD38, sCD18, sCD54 поликлональные козьи антитела, очищенные сульфатом аммония и риванолом, в объеме 100 мкл сорбировали в лунках планшетов для иммуноферментного анализа в течение 16-18 ч при 25 °С. При определении олигомерных форм антигенов sCD38, sCD54 в лунки планшетов аналогично вносили по 100 мкл рабочего раствора моноклональных антител ИК0-20 или ИКО-184 соответственно с последующей инкубацией планшетов в тех же условиях. Несвязавшиеся антитела пятикратно отмывали фосфатно-солевым раствором (ФСР-Т), содержащим 0,9 % NaCL, 0,1 % Na2HPO4 и 0,1 % твина-80.
Затем в лунки планшетов вносили исследуемые образцы сыворотки крови с последующей инкубацией планшетов в течение 16-18 ч при 25 °С во влажной камере. После этого планшеты отмывали ФСР-Т, как указано выше. При определении уровня антигена sCD38 и его димера перед внесением исследуемой сыворотки во все лунки добавляли по 100 мкл блокирующего раствора (3 %-ный раствор ферментативного пептона) и инкубировали планшеты 2 ч во влажной камере при комнатной температуре. Затем планшеты промывали 5 раз раствором ФСР-Т.
После инкубации планшетов с образцами исследуемой сыворотки в лунки добавляли по 100 мкл рабочего раствора моноклональных антител, конъюгированных с перокси- дазой хрена, и инкубировали 1 ч при 37 °C . После отмывания несвязавшегося конъюгата реакцию проявляли раствором 0,1 %-ного ортофенилендиамина в 0,05 М цитратном буферном растворе, рН 5,0, содержащем 0,01 % перекиси водорода. Реакцию останавливали 5 %-ным раствором H2SO4 Учет результатов проводили спектрофотометрически при длине волны 492 нм с использованием фотометра АИФ-М/340. Сывороточные уровни растворимых антигенов оценивали, переводя единицы оптической плотности в условные единицы (ЕД/мл), используя раститровку положительной контрольной сыворотки. Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стъюдента.
Оценка сывороточных уровней молекул адгезии показала существенное их изменение при УГХ. Если в норме содержание антигена sCD50 (ICAM-3) соответствовало 374,5 ± 63,9 Ед/мл, то у больных средний уровень sCD50 антигена превысил нормальные значения в 2,2 раза (р < 0,05) и составил 824,4 ± 247,7 Ед/мл. Повышение уровня другого антигена адгезии — sCD54 (ICAM-1) — оказалось намного более выраженным (в 8,8 раза) в сравнении с нормой (р < 0,05). Определение сывороточной концентрации димерной формы sCD54 антигена также показало ее увеличение более чем в 8 раз при хламидиозе в сравнении с нормой (р < 0,01). Исследование у больных УГХ сывороточного содержания растворимого антигена CD18 обнаружило его статистически достоверное повышение в 2,0 раза.
Таким образом, хламидийная инфекция сопровождалась значительным увеличением сывороточных концентраций как растворимых молекул адгезии ICAM-1 и ICAM-3, так и растворимой изоформы CD18 антигена, являющегося 02-субъединицей их основного мембранного лиганда — LFA-1 антигена (рис. 1).
Известно, что синтез растворимых форм молекул ICAM происходит за счет слу-щивания мембранной формы и требует предварительного синтеза протеаз [1]. Считается, что молекуле ICAM-3 принадлежит роль главного лиганда для LFA-1 при инициации иммунного ответа, например, при взаимодействии покоящихся Т-лимфоцитов и антигенпрезентирующих В-клеток. После первичного инициирующего контакта начинает доминировать связывание LFA-1 с CD54 вследствие более высокой аффинности CD54. При этом значимость ICAM-3 снижается, в то время как ICAM-1 имеет важное значение для взаимодействия уже примированных лимфоцитов [15].
Функциональное значение растворимых CD50 и CD54 антигенов заключается в ограничении процессов адгезии. Увеличение концентрации sCD50 в биологических жидкостях может приводить к блокаде взаимодействия мембранной формы ICAM-3 с молекулами CD209 (лигандом CD50 антигена при инициации иммунного ответа) и LFA-1. Следствием этого может явиться снижение уровня активации Т-клеток.
Непропорциональное увеличение у больных хламидиозом сывороточной концентрации CD54 (более чем в 8 раз) при двукратном повышении содержания sCD18 антигена может привести к выраженному дисбалансу в содержании растворимых форм этих двух белков. Можно предположить, что молекулам sCD54, находящимся в избытке по отношению к sCD18 (в отличие от sICAM-3, увеличение концентрации которого не отличалось от изменения концентрации sCD18), вероятно, принадлежит при хламидиозе важная роль в ограничении адгезивных процессов между клетками. Конкурируя за лиганд LFA-1, находящийся на мембране антигенпрезентирующих клеток и клеток-мишеней, растворимые молекулы CD54 могут блокировать как первоначальное взаимодействие между клетками иммунной системы, опосредованное связыванием LFA-1 с CD50, так и дальнейшие межклеточные взаимодействия, опосредованные молекулами CD54 и LFA-1.
Известно, что экспрессия CD54 является индуцированной и резко повышается на активированных лимфоцитах. Предполагается, что интенсивный сход молекул ICAM-1 с мембраны активированных клеток способствует сдерживанию чрезмерной активации иммунной системы [1]. Также следствием таких процессов в целом может стать ограничение иммунных реакций, направленных на эффективную элиминацию хламидий, что в свою очередь может явиться одним из факторов персистенции и хрониза- ции инфекции.
По данным литературы, несмотря на то что ICAM-1 и ICAM-3 имеют одинаковый рецептор связывания, сывороточные уровни этих антигенов не коррелируют друг с другом ни у больных, ни у здоровых людей [14]. Однако в нашем исследовании с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена было выявлено существование такой корреляции с высокой степенью достоверности в сывороточных уровнях всех трех молекул адгезии, сравниваемых попарно, как у здоровых доноров (р < 0,001), так и при урогенитальном хламидиозе (р < 0,01).
Как показано исследованиями по перекрестному связыванию мембранных белков, ICAM-1 может существовать в виде димера в своем естественном состоянии на клеточной поверхности, причем димеры ICAM-1 преобладают над
между группами доноров и больных мономерами. Димеризация осуществляется через трансмембранный домен. Предполагается, что димер 1САМ-1 может одновременно связываться с двумя молекулами LFA-1, при этом связывание димерного 1САМ-1 с LFA-1 так же эффективно, как и связывание мономерного CD54 с лигандом. Растворимый 1САМ-1 также может быть димеризован в белковые глобулы, подобно кольцу через домен 1 и С-конец молекул. Взаимопревращения среди топомеров 1САМ-1 и дальнейшая олигомеризация имеет важное значение для участия молекулы в межклеточной адгезии [11]. Выявленное нами восьмикратное повышение уровня sICAM-1-димера при хламидиозе свидетельствует о том, что в торможении процессов межклеточной адгезии важную роль, вероятно, играет димерная фракция растворимого антигена. Косвенным подтверждением этого предположения могут служить результаты, полученные при индивидуальном анализе данных о содержании суммарного и димерного sCD54 антигена в сыворотке крови больных. Так, частота встречаемости образцов сыворотки с содержанием тестируемых антигенов выше М+с (где М — среднее, а — стандартное отклонение) практически не различалась и составила 29 % для суммарного sCD54 антигена и 33 % для sCD54-димера.
Исследование уровня другой молекулы адгезии — sCD38 — обнаружило трехкратное увеличение его у больных, однако различия между группами не были статистически достоверны вследствие значительного разброса данных (рис. 2).
Поскольку экспрессия CD38 антигена является индуцибельной и повышается при активации [8], то, вероятно, повышенный в несколько раз уровень растворимой формы CD38 антигена при хламидиозе формируется за счет шеддинга с поверхности активированных клеток мембранного предшественника.
При проникновении активированных Т-лим- фоцитов через сосудистую стенку важную роль играет взаимодействие мембранных форм CD31 и CD38 антигенов [10]. Поскольку растворимая форма CD38 антигена сохраняет способность взаимодействовать с мембранным лигандом, то она может блокировать места связывания мембранных Т-клеточных молекул CD38 с СD31 антигеном и тем самым препятствовать поступлению активированных Т-лимфоцитов в очаг воспаления. Таким способом может реализоваться ограничивающее иммунный ответ действие сывороточного CD38 антигена у больных хламидиозом.
Ранее была обнаружена димерная форма sCD38 с молекулярной массой около 78кДа [13]. С помощью разработанного нами метода, основанного на применении одних и тех же моноклональных антител ИКО-20 в двухсайтовом имму- ноферментном анализе (см. «Материалы и методы»), мы оценили уровень sCD38-димера в сыворотке крови больных хламидиозом. Сравнение с контролем концентрации sCD38-димера в сыворотке больных УГХ показало выраженное повышение (почти в 8 раз) данного показателя, который соответствовал 1129,0 ± 300,2 Ед/мл (Р < 0,001) (см. рис. 2). Индивидуальный анализ данных показал наличие положительной корреляционной зависимости суммарного и димерного CD38 антигена (р < 0,001), при этом 41 % больных имел значительно повышенный уровень (>М+ с) sCD38-димера, в то время как превышающие норму реакции значения концентрации sCD38 антигена регистрировались лишь у 23 % пациентов. Столь значительное изменение уровня димерного sCD38 антигена у больных в отличие от общего sCD38 антигена позволяет говорить об особой роли димерной фракции данного белка в молекулярных механизмах иммунного ответа при хламидиозе.
Таким образом, при УГХ нами выявлено повышение сывороточного уровня растворимых форм таких молекул адгезии, как CD18, CD50, CD54 и CD38, а также димерных форм растворимых антигенов CD54 и CD38. Одновременная оценка уровней нескольких растворимых молекул адгезии позволила обнаружить признаки дисбаланса в их содержании, что с нашей точки зрения может влиять на патогенетические механизмы развития хламидийной инфекции. В частности, значительное повышение уровня sCD54 антигена, не уравновешиваемое сравнительно небольшим подъемом сывороточного уровня его растворимого лиганда (sCD18 антиген), может вызывать блокаду межклеточных взаимодействий и приводить к ограничению специфического иммунного ответа на хламидии и хронизации инфекции