загрузка...
 
Сывороточный уровень растворимых молекул межклеточной адгезии при урогенитальном хламидиозе
Повернутись до змісту

Сывороточный уровень растворимых молекул межклеточной адгезии при урогенитальном хламидиозе

Н.И. Егорова, Г.Ю. Курников, А.А. Бабаев, В.В. Новиков

Нижегородский государственный университет,

Нижегородский научно-исследовательский кожно-венерологический институт,

Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии

C помощью иммуноферментного метода определяли уровень растворимых форм ^-форм) мембранных антигенов ICAM-1 ^54), ICAM-3 ^50), CD18, CD38, а также димерные формы растворимых ICAM-1 и CD38 антигенов в сыворотке крови больных урогенитальным хламидиозом (УГХ). Показано, что достоверное повышение при УГХ содержания растворимых молекул адгезии CD50 и CD54, а также их растворимого лиганда — CD18 антигена (Р2-субъединицы интегринов) сопровождалось признаками дисбаланса в их содержании. Обнаружено увеличение сывороточной концентрации sCD38 антигена у больных УГХ, однако статистически значимым оказалось изменение только димерной фракции данного белка. Полученные результаты позволяют говорить о возможном влиянии растворимых антигенов адгезии ICAM-1, ICAM-3, CD18 и растворимого CD38 антигена на иммунопатогенетические механизмы развития хламидийной инфекции.

Ключевые слова: урогенитальный хламидиоз, растворимая форма 1САМ-1, растворимая форма 1САМ-3, растворимая форма Сй18, растворимая форма CD38

В последние годы среди множества воспалительных заболеваний урогенитального тракта все большее распространение получает хламидийная инфекция. Возбудители хламидиоза — облигатные внутриклеточные паразиты — не относятся к патогенам, представляющим особую опасность, но на фоне ухудшения экологической ситуации снижение иммунитета приводит к латентным и персистирующим формам инфекций, вызывая поражение различных систем и органов. В частности, они являются причиной негонококковых урогенитальных инфекций, приводящих к внутриутробному инфицированию плода, невынашиванию беременности, бесплодию, что в целом имеет неблагоприятные последствия для репродуктивного здоровья населения.

Иммунологические изменения, выявленные различными авторами при урогенитальном хла- мидиозе (УГХ), характеризуются вариабельностью и неоднозначностью. Так, по результатам многих исследований, анализ факторов иммунологической защиты при хронической хламидийной инфекции свидетельствует об угнетении всех звеньев иммунитета [3]. Нарушения в системе иммунореактивности, затрагивающие клеточный иммунитет, проявляются в уменьшении общего количества Т-лимфоцитов (CD3+), CD4+ Т- лимфоцитов и HLA-DR+-лимфоцитов, а также в снижении иммунорегуляторного индекса (соотношения CD4+/CD8+ клеток), что способствует длительной персистенции возбудителя в организме [4].

В основе иммунного ответа лежат межклеточные и межмолекулярные взаимодействия, важную роль в реализации которых играют мембранные белки клеток иммунной системы. Известно, что мембранные белки могут иметь растворимые аналоги (так называемые s-формы), образующиеся за счет шеддинга или альтернативного сплайсинга матричной РНК. Растворимые формы мембранных антигенов представляют собой новый класс иммунорегуляторных молекул, которые участвуют в передаче сигнала клетке или, наоборот, выполняют функции ограничителей иммунных реакций. В настоящее время насчитывается более 260 дифференцировочных антигенов системы гемопоэза, однако информация о количественном содержании растворимых форм мембранных антигенов в сыво-


ротке крови и их функциональной роли в норме и при патологии, в том числе и при бактериальных воспалительных инфекциях, получена лишь для немногих из них. Тем не менее исследования, проведенные в различных лабораториях, выявили, что ряд дифференцировочных антигенов гемопоэтических клеток могут обнаруживаться в значительных количествах в сыворотке крови и выполнять роль диагностических и прогностических маркеров при ряде заболева- ниий. Изменение концентрации s-форм диффе- ренцировочных антигенов в биологических жидкостях может вызывать множественные эффекты, отражающие патогенетические механизмы, с одной стороны, и вносящие свой вклад в нарушение гомеостаза при различных заболеваниях, с другой стороны [5].

Целью настоящего исследования явилась оценка при урогенитальном хламидиозе сывороточных уровней растворимых форм мембранных антигенов, принадлежащих к функциональной группе молекул межклеточной адгезии.

Материалы и методы

В работе использованы образцы сыворотки крови 32 больных урогенитальным хламидиозом, положительные в реакции прямой иммунофлуоресценции. Образцы были получены из Сормовского кожно-венерологического диспансера Нижнего Новгорода. Контрольную группу составили образцы сыворотки крови 80 здоровых доноров, сопоставимых по возрасту и полу с больными УГХ.

Краткая характеристика антигенов адгезии, сывороточная концентрация которых оценивались в настоящей работе, представлена в таблице.

Содержание в сыворотке крови антигенов sCD50, sCD54 и его димера (sCD54-димер), sCD18, sCD38 антигена и его димерной фракции (sCD38-димер) определяли с помощью твердофазного иммуноферментного метода с применением моноклональных антител (МКА) серии ИКО (ИК0-60, ИКО-184, ИК0-108, ИК0-20 соответственно) [2] и поликлональных антител, направленных против поверхностных антигенов мононуклеарных клеток периферической крови человека.

На первом этапе при определении антигенов sCD50, sCD38, sCD18, sCD54 поликлональные козьи антитела, очищенные сульфатом аммония и риванолом, в объеме 100 мкл сорбировали в лунках планшетов для иммуноферментного анализа в течение 16-18 ч при 25 °С. При определении олигомерных форм антигенов sCD38, sCD54 в лунки планшетов аналогично вносили по 100 мкл рабочего раствора моноклональных антител ИК0-20 или ИКО-184 соответственно с последующей инкубацией планшетов в тех же условиях. Несвязавшиеся антитела пятикратно отмывали фосфатно-солевым раствором (ФСР-Т), содержащим 0,9 % NaCL, 0,1 % Na2HPO4 и 0,1 % твина-80.

Затем в лунки планшетов вносили исследуемые образцы сыворотки крови с последующей инкубацией планшетов в течение 16-18 ч при 25 °С во влажной камере. После этого планшеты отмывали ФСР-Т, как указано выше. При определении уровня антигена sCD38 и его димера перед внесением исследуемой сыворотки во все лунки добавляли по 100 мкл блокирующего раствора (3 %-ный раствор ферментативного пептона) и инкубировали планшеты 2 ч во влажной камере при комнатной температуре. Затем планшеты промывали 5 раз раствором ФСР-Т.

После инкубации планшетов с образцами исследуемой сыворотки в лунки добавляли по 100 мкл рабочего раствора моноклональных антител, конъюгированных с перокси- дазой хрена, и инкубировали 1 ч при 37 °C . После отмывания несвязавшегося конъюгата реакцию проявляли раствором 0,1 %-ного ортофенилендиамина в 0,05 М цитратном буферном растворе, рН 5,0, содержащем 0,01 % перекиси водорода. Реакцию останавливали 5 %-ным раствором H2SO4 Учет результатов проводили спектрофотометрически при длине волны 492 нм с использованием фотометра АИФ-М/340. Сывороточные уровни растворимых антигенов оценивали, переводя единицы оптической плотности в условные единицы (ЕД/мл), используя раститровку положительной контрольной сыворотки. Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стъюдента.


Результаты и обсуждение

Оценка сывороточных уровней молекул адгезии показала существенное их изменение при УГХ. Если в норме содержание антигена sCD50 (ICAM-3) соответствовало 374,5 ± 63,9 Ед/мл, то у больных средний уровень sCD50 антигена превысил нормальные значения в 2,2 раза (р < 0,05) и составил 824,4 ± 247,7 Ед/мл. Повышение уровня другого антигена адгезии — sCD54 (ICAM-1) — оказалось намного более выраженным (в 8,8 раза) в сравнении с нормой (р < 0,05). Определение сывороточной концентрации димерной формы sCD54 антигена также показало ее увеличение более чем в 8 раз при хламидиозе в сравнении с нормой (р < 0,01). Исследование у больных УГХ сывороточного содержания растворимого антигена CD18 обнаружило его статистически достоверное повышение в 2,0 раза.

Таким образом, хламидийная инфекция сопровождалась значительным увеличением сывороточных концентраций как растворимых молекул адгезии ICAM-1 и ICAM-3, так и растворимой изоформы CD18 антигена, являющегося 02-субъединицей их основного мембранного лиганда — LFA-1 антигена (рис. 1).

Известно, что синтез растворимых форм молекул ICAM происходит за счет слу-щивания мембранной формы и требует предварительного синтеза протеаз [1]. Считается, что молекуле ICAM-3 принадлежит роль главного лиганда для LFA-1 при инициации иммунного ответа, например, при взаимодействии покоящихся Т-лимфоцитов и антигенпрезентирующих В-клеток. После первичного инициирующего контакта начинает доминировать связывание LFA-1 с CD54 вследствие более высокой аффинности CD54. При этом значимость ICAM-3 снижается, в то время как ICAM-1 имеет важное значение для взаимодействия уже примированных лимфоцитов [15].

Функциональное значение растворимых CD50 и CD54 антигенов заключается в ограничении процессов адгезии. Увеличение концентрации sCD50 в биологических жидкостях может приводить к блокаде взаимодействия мембранной формы ICAM-3 с молекулами CD209 (лигандом CD50 антигена при инициации иммунного ответа) и LFA-1. Следствием этого может явиться снижение уровня активации Т-клеток.

Непропорциональное увеличение у больных хламидиозом сывороточной концентрации CD54 (более чем в 8 раз) при двукратном повышении содержания sCD18 антигена может привести к выраженному дисбалансу в содержании растворимых форм этих двух белков. Можно предположить, что молекулам sCD54, находящимся в избытке по отношению к sCD18 (в отличие от sICAM-3, увеличение концентрации которого не отличалось от изменения концентрации sCD18), вероятно, принадлежит при хламидиозе важная роль в ограничении адгезивных процессов между клетками. Конкурируя за лиганд LFA-1, находящийся на мембране антигенпрезентирующих клеток и клеток-мишеней, растворимые молекулы CD54 могут блокировать как первоначальное взаимодействие между клетками иммунной системы, опосредованное связыванием LFA-1 с CD50, так и дальнейшие межклеточные взаимодействия, опосредованные молекулами CD54 и LFA-1.

Известно, что экспрессия CD54 является индуцированной и резко повышается на активированных лимфоцитах. Предполагается, что интенсивный сход молекул ICAM-1 с мембраны активированных клеток способствует сдерживанию чрезмерной активации иммунной системы [1]. Также следствием таких процессов в целом может стать ограничение иммунных реакций, направленных на эффективную элиминацию хламидий, что в свою очередь может явиться одним из факторов персистенции и хрониза- ции инфекции.

По данным литературы, несмотря на то что ICAM-1 и ICAM-3 имеют одинаковый рецептор связывания, сывороточные уровни этих антигенов не коррелируют друг с другом ни у больных, ни у здоровых людей [14]. Однако в нашем исследовании с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена было выявлено существование такой корреляции с высокой степенью достоверности в сывороточных уровнях всех трех молекул адгезии, сравниваемых попарно, как у здоровых доноров (р < 0,001), так и при урогенитальном хламидиозе (р < 0,01).

Как показано исследованиями по перекрестному связыванию мембранных белков, ICAM-1 может существовать в виде димера в своем естественном состоянии на клеточной поверхности, причем димеры ICAM-1 преобладают над


между группами доноров и больных мономерами. Димеризация осуществляется через трансмембранный домен. Предполагается, что димер 1САМ-1 может одновременно связываться с двумя молекулами LFA-1, при этом связывание димерного 1САМ-1 с LFA-1 так же эффективно, как и связывание мономерного CD54 с лигандом. Растворимый 1САМ-1 также может быть димеризован в белковые глобулы, подобно кольцу через домен 1 и С-конец молекул. Взаимопревращения среди топомеров 1САМ-1 и дальнейшая олигомеризация имеет важное значение для участия молекулы в межклеточной адгезии [11]. Выявленное нами восьмикратное повышение уровня sICAM-1-димера при хламидиозе свидетельствует о том, что в торможении процессов межклеточной адгезии важную роль, вероятно, играет димерная фракция растворимого антигена. Косвенным подтверждением этого предположения могут служить результаты, полученные при индивидуальном анализе данных о содержании суммарного и димерного sCD54 антигена в сыворотке крови больных. Так, частота встречаемости образцов сыворотки с содержанием тестируемых антигенов выше М+с (где М — среднее, а — стандартное отклонение) практически не различалась и составила 29 % для суммарного sCD54 антигена и 33 % для sCD54-димера.

Исследование уровня другой молекулы адгезии — sCD38 — обнаружило трехкратное увеличение его у больных, однако различия между группами не были статистически достоверны вследствие значительного разброса данных (рис. 2).

Поскольку экспрессия CD38 антигена является индуцибельной и повышается при активации [8], то, вероятно, повышенный в несколько раз уровень растворимой формы CD38 антигена при хламидиозе формируется за счет шеддинга с поверхности активированных клеток мембранного предшественника.

При проникновении активированных Т-лим- фоцитов через сосудистую стенку важную роль играет взаимодействие мембранных форм CD31 и CD38 антигенов [10]. Поскольку растворимая форма CD38 антигена сохраняет способность взаимодействовать с мембранным лигандом, то она может блокировать места связывания мембранных Т-клеточных молекул CD38 с СD31 антигеном и тем самым препятствовать поступлению активированных Т-лимфоцитов в очаг воспаления. Таким способом может реализоваться ограничивающее иммунный ответ действие сывороточного CD38 антигена у больных хламидиозом.

Ранее была обнаружена димерная форма sCD38 с молекулярной массой около 78кДа [13]. С помощью разработанного нами метода, основанного на применении одних и тех же моноклональных антител ИКО-20 в двухсайтовом имму- ноферментном анализе (см. «Материалы и методы»), мы оценили уровень sCD38-димера в сыворотке крови больных хламидиозом. Сравнение с контролем концентрации sCD38-димера в сыворотке больных УГХ показало выраженное повышение (почти в 8 раз) данного показателя, который соответствовал 1129,0 ± 300,2 Ед/мл (Р < 0,001) (см. рис. 2). Индивидуальный анализ данных показал наличие положительной корреляционной зависимости суммарного и димерного CD38 антигена (р < 0,001), при этом 41 % больных имел значительно повышенный уровень (>М+ с) sCD38-димера, в то время как превышающие норму реакции значения концентрации sCD38 антигена регистрировались лишь у 23 % пациентов. Столь значительное изменение уровня димерного sCD38 антигена у больных в отличие от общего sCD38 антигена позволяет говорить об особой роли димерной фракции данного белка в молекулярных механизмах иммунного ответа при хламидиозе.

Таким образом, при УГХ нами выявлено повышение сывороточного уровня растворимых форм таких молекул адгезии, как CD18, CD50, CD54 и CD38, а также димерных форм растворимых антигенов CD54 и CD38. Одновременная оценка уровней нескольких растворимых молекул адгезии позволила обнаружить признаки дисбаланса в их содержании, что с нашей точки зрения может влиять на патогенетические механизмы развития хламидийной инфекции. В частности, значительное повышение уровня sCD54 антигена, не уравновешиваемое сравнительно небольшим подъемом сывороточного уровня его растворимого лиганда (sCD18 антиген), может вызывать блокаду межклеточных взаимодействий и приводить к ограничению специфического иммунного ответа на хламидии и хронизации инфекции


 

 

© Коллектив авторов, 2003 УДК 616-022.854-085.37

 



загрузка...