загрузка...
 
Цитокининдуцирующая активность антигенов буркхольдерий
Повернутись до змісту

Цитокининдуцирующая активность антигенов буркхольдерий

О.Б. Прошина, С.И. Жукова, Н.Н. Пивень, Н.П. Храпова, И.В. Авророва, Н.М. Дрефс, А.В. Засядкина, А.Д. Кувшинова

Научно-исследовательский противочумный институт, Волгоград

Целью работы было изучение цитокининдуцирующей активности антигенов возбудителя мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) и близкородственного непатогенного вида (Burkholderia thailandensis). В опытах in vitro на макрофагах и лимфоцитах мышей BALB/с получены моноки- ны и лимфокины, индуцированные водно-солевыми экстрактами буркхольдерий. Изучена биологическая активность полученных цитокинов на нейтрофилах и макрофагах мышей. Показана взаимосвязь между протективными свойствами антигенных комплексов буркхольдерий и показателями биологической активности индуцируемых ими цитокинов — влиянием на экспрессию Fс-рецепто- ров на нейтрофилах, фагоцитарную активность макрофагов; цитотоксической активностью TNFa для мышиных фибробластов L-929. (Цитокины и воспаление. 2006. Т. 5, № 4. С. 22-25.)

Ключевые слова: мелиоидоз, протективность, цитокины. 

Мелиоидоз — особо опасное заболевание, вызываемое грамотрицательными бактериями Виг^оШета pseudomattei, эндемичное для стран Юго-Восточной Азии. Мелиоидоз характеризуется высокой летальностью и протекает как в виде различных местных патологических процессов (абсцессы, артриты, конъюнктивиты и др.), так и в виде сепсиса и пневмоний. Возбудитель мелиоидоза отличается высокой резистентностью к антибиотикотерапии, особенно при хроническом течении инфекции. Вакцина против мелиоидоза не разработана до настоящего времени, хотя работы по ее созданию продолжаются в нашей стране и за рубежом уже более полувека. Неудачи в деле вакцинопрофилактики мелиоидоза в значительной мере связаны с недостаточной изученностью механизмов формирования иммунитета и, в частности, закономерностей ци- токиновой иммунорегуляции. В ряде зарубежных работ показано, что определение в крови уровней TNFa, №N7, ^-6, ^-10 имеет прогностическое значение для исхода заболевания [6, 8]. Изучены количественные показатели различных цитокинов при остром и хроническом экспериментальном мелиоидозе у мышей, а также вза-

имосвязь высоты бактериемии с пиком продукции цитокинов клетками селезенки [5]. Особого внимания заслуживают публикации об использовании для лечения острого мелиоидоза у пациентов в госпиталях северной Австралии, наряду с антибиотиками, препаратов гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), позволивших снизить смертность с 95 % до 10 % [4]. Однако, по данным других авторов, в экспериментах на мышах использование G-CSF существенно не влияло на результаты антибиотикотера- пии острого мелиоидоза [7]. Учитывая противоречивость публикаций о роли отдельных цито- кинов при мелиоидозе, трудно составить целостную картину цитокиновой иммунорегуляции при этой инфекции. Цель данной работы состояла в изучении цитокининдуцирующей активности различных антигенных комплексов бурк- хольдерий и ее связи с протективными свойствами антигенов.

Материалы и методы

Работа выполнена на беспородных белых мышах и мышах BALB/с. В качестве продуцентов цитокинов (монокинов и лим- фокинов) были использованы макрофаги (Мф) перитонеально
го экссудата (ПЭ) и лимфоциты селезенки мышей BALB/с. Индукторами цитокинов служили водно-солевые экстракты (ВСЭ) буркхольдерий: B. pseudomallei С-141 (умеренно вирулентный штамм возбудителя мелиоидоза — АГ1), B. pseudomallei 100 (высоковирулентный штамм возбудителя мелиоидоза — АГ2), B. thailandensis 251 (непатогенный близкородственный вид буркхольдерий — АГ3 и 0,15 М раствор хлорида натрия (физ. раствор; контроль)). Клетки-продуценты примировали каждым из ВСЭ в дозе 10 мкг/мл для получения лимфоки- нов в течение 48 ч, монокинов — в течение 24 ч. По окончании срока инкубации супернатанты центрифугировали при 1000 об./мин в течение 10 мин, пропускали через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм и замораживали при -20 °С до начала исследования.

Тестирование биологической активности лимфокинов проводили на перитонеальных Мф мышей. Изучали влияние лимфокинов на экспрессию Fс-рецепторов на поверхности Мф, на способность вызывать реакцию исчезновения Мф из брюшной полости, а также на фагоцитарную активность Мф. Биологическую активность монокинов оценивали на нейтрофилах ПЭ мышей. Определяли способность монокинов модулировать хемотаксис Нф и экспрессию Fc-рецепторов. Кроме того, определяли активность TNFa, продуцируемого Мф, на перевиваемой клеточной линии мышиных фибробластов L-929.

Фагоцитарную активность Мф изучали хемилюминесцент- ным методом. Определяли спонтанную и стимулированную зи- мозаном хемилюминесценцию Мф на хемилюминометре WaLLac 1250 (LKB), вычисляли коэффициент стимуляции (КС) [3]. Об экспрессии FcR судили по розеткообразованию с эритроцитами барана, оксонизированными противоэритроцитарными кроличьими антителами (ЕА) [4]. Вычисляли процент клеток — Нф или Мф, адсорбировавших на своей поверхности 3 и более эритроцитов (ЕА-РОК). Хемотаксис Нф определяли в опытах in vivo через 4 ч после внутрибрюшинного введения монокинов (50 мкл) интактным мышам, контрольным животным вводили физиологический раствор. За 24 ч до опыта с целью увеличения количества клеточных элементов ПЭ мышам вводили внут- рибрюшинно по 5 мл раствора хлористого натрия (2,6 мл насыщенного раствора хлористого натрия на 100 мл дистиллированной воды). В мазках из ПЭ, окрашенных по Романовскому — Гимза, подсчитывали процент Нф, определяли общее число клеток в 1 мл ПЭ в камере Горяева, вычисляли абсолютное количество Нф в 1 мл ПЭ и определяли индекс активации Нф (ИАН) по формуле: ИАН = (Нфо- Нфк)/Нфк, где Нфо и Нфк — число Нф в опыте и контроле соответственно.

Для выявления способности лимфокинов вызывать реакцию исчезновения Мф (РИМ), являющуюся моделью повышенной чувствительности замедленного типа in vivo [1], иммунизированным (на 3-и сут после введения 30 мкг АГ1, АГ2 и АГ3) и интактным мышам вводили внутрибрюшинно 50 мкл лимфокинов (опытная группа) или физиологического раствора (контрольная группа) и через 4 ч у животных исследовали клеточный состав ПЭ. Определяли концентрацию клеток в камере Горяева и процент Мф в мазках, окрашенных по Романовскому — Гимза. Интенсивность реакции оценивали по индексу исчезновения макрофагов (ИИМ), который рассчитывали по формуле: ИИМ = ИМо-ИМк, где ИМо и ИМк — показатели исчезновения Мф в опыте и контроле, вычислявшиеся по формулам: ИМо = (ао-Ьо)/ао х 100 и ИМк = (ак- Ьк)/ак х 100, где ао и ак — абсолютное число Мф в ПЭ при- мированных (опытных) и интактных (контрольных) животных соответственно через 4 ч после введения физиологического раствора; Ьо и Ьк— абсолютное число Мф в ПЭ примиро- ванных и интактных животных через 4 ч после введения лимфокинов. Цитотоксическую активность TNFa в моноки- нах определяли на клетках мышиных фибробластов L-929. Активность TNFa выражали числом единиц активности, обратным разведению монокинов, обеспечивающему 50% гибель клеток L-929 в лунке (ЦТЕ-50). Протективные свойства антигенов изучали на беспородных белых мышах, которых двукратно иммунизировали 30 мкг антигенов в смеси с гидратом окиси алюминия (до конечной концентрации 1,2 мг/мл) с интервалом 10 сут, и на 21-е сут после первичной иммунизации заражали 5 и 50 ЛД50 умеренно вирулентного штамма B. pseudomallei 115. Определяли процент выживших животных и среднюю продолжительность жизни (СПЖ) погибших. Статистический анализ результатов исследований осуществляли с определением средних величин и доверительных интервалов для уровня достоверности 95 %.

Результаты и обсуждение

Анализ данных по изучению протективных свойств ВСЭ буркхольдерий показал, что ВСЭ В. pseudomallei 100 (АГ2) был наиболее протектив- ным, он защищал 50 % животных от 5 ЛД50 умеренно вирулентного штамма В. pseudomallei 115 и существенно повышал СПЖ павших мышей от 5-50 ЛД50 (соответственно до 13,4 и 15,1 дней по сравнению с 7,3 и 6,8 в контроле). ВСЭ В. pseudomallei С-141 (АГ1) защищал 40 % животных от 5 ЛД50 и также увеличивал СПЖ павших мышей от 5-50 ЛД50 (до 12,8 и 14,8 дней). Наименьшие защитные свойства зарегистрированы у ВСЭ В. thailandensis 251: значимое увеличение СПЖ при заражении небольшой дозой возбудителя мелиоидоза — 5 ЛД50 (13,6 дней). Выживаемость от 5 ЛД50 составила всего 22 %. Все изученные препараты существенно не влияли на выживаемость мышей при заражении 50 ЛД50.

Анализируя результаты исследований влияния монокинов и лимфокинов на количество FcR на поверхности фагоцитов, следует отметить, что все изученные препараты не вызывали индукции лимфокинов, регулирующих экспрессию FcR на Мф (табл. 1). Вместе с тем, монокины, индуцированные АГ1 и АГ2, усиливали экспрессию FcR на поверхности Нф: отмечено возрастание процента ЕА-РОК по сравнению с контролем (58 ± 1,4 и

± 2,2 соответственно, в контроле — 28 ± 0,6, р0,05) (табл. 2). Активность монокинов, индуцированных АГ3, была значительно ниже и существенно не отличалась от контрольных цифр (34 ± 2,1).

Изучение способности монокинов, полученных под воздействием антигенов буркхольде- рий, оказывать регуляторное воздействие на хемотаксис Нф показало, что АГ1 в качестве индуктора не отличался от АГ3 (см. табл. 1). Более выраженной хемотаксической активностью обладали цитокины Мф, стимулированных АГ2 (ИАН = 3,23)

 

 


 

 

 

Изучение цитотоксичности TNFa в супернатантах лимфоцитов, стимулированных антигенами буркхольдерий, на клетках L-929 показало, что в лимфокинах, индуцированных АГ2, активность TNFa была максимальной— 128 ед. актив. (см. табл. 1). Уровни активности TNFa в лимфокинах, полученных при воздействии АГ1 и АГ3, были ниже (32 и 16 ед. актив. соответственно).

При изучении регуляторного влияния лимфокинов, образовавшихся под воздействием ВСЭ буркхольдерий, на фагоцитарную активность Мф установлено, что цитокины, стимулированные АГ2, в наибольшей степени повышали фагоцитарную активность Мф (КС = 4,94 ± 0,9; в контроле

± 0,4, p < 0,05). Лимфоциты, примированные АГ1, также продуцировали цитокины, существенно стимулировавшие фагоцитоз Мф (КС = 4,13 ± 0,8, p < 0,05). Наименьшей стимулирующей активностью обладали лимфокины, полученные с помощью АГ3.

Оценка влияния лимфокинов на содержание Мф в ПЭ показала, что введение иммунизированным мышам лимфокинов, стимулированных любым из трех антигенных комплексов, сопровождалась реакцией исчезновения МФ из ПЭ (РИМ), уровень которой был невысоким (см. табл. 2). Несколько более выраженную РИМ обусловливали лимфоки- ны, стимулированные АГ2 (ИИМ = 13,8 %), однако различия с другими индукторами цитокинов были несущественными (АГ1 — 8 %, АГ2 — 11,1 %, p > 0,05).

Анализ полученного экспериментального материала позволяет констатировать взаимосвязь между цитокининдуцирующей активностью антигенных комплексов буркольходерий и их про- тективными свойствами. Установлена зависимость между уровнем активности лимфокинов, модулирующих фагоцитарную способность Мф, и степенью протективности антигена — индуктора лимфокинов. Отмечена прямая взаимосвязь между степенью экспрессии FcR на поверхности Нф под влиянием монокинов и защитными свойствами антигена-индуктора. Выявлена взаимосвязь между способностью антигенов буркхоль- дерий активировать продукцию TNFa и их защитными свойствами.

Таким образом, защитные свойства антигенов буркхольдерий зависят от их способности индуцировать выработку цитокинов, стимулирующих клеточное звено иммунитета. Полученные нами данные вполне согласуются с известным положением о доминирующей роли клеточных факторов иммунитета в защите от мелиоидозной инфекции [2, 7] и могут быть использованы при конструировании мелиоидозной вакцины в качестве дополнительных критериев отбора протек- тивных антигенов.

 

 

 


ЛИTЕРАTУРА

 

 

 

Васильева Г.И., Дорошенко Е.П., Киселева А.К., Пустовалов В.Л. Выявление повышенной чувствительности замедленного типа к чумному микробу в реакции исчезновения макрофагов // Иммунология. — 1988. — № б. — С. 82-84.

Илюхин В.И., Мельников Б.И. Постинфекционный иммунитет при мелиоидозе // Ж. микробиол. — 1980. — № 4. — С. 87-91.

Любимов Г.Ю., Зенков Н.К., Вольский Н.Н., Козлов В.А. Хемилюминесценция перитонеальных макрофагов при действии макрофагактивирующего фактора // Иммунология. — 1992. — № 1. — С. 40-43.

Родионов С.В., Щербухин В.В., Николаева Е.Н. и др. Перераспределение субпопуляций перитонеальных макрофагов, несущих Fс-рецепторы, под влиянием иммуномодулятора // Ж. микробиол. — 1988. — № 1. — С. 97-107.

Barnes J.L., ULett G.C., Ketheesan N. et al. Induction of multiple chemok- ine and colony-stimulating factor genes in experimental Burkholderia pseudomallei iufection // Immunol. Cell Biol. — 2001. — Vol. 79, № 5. — P. 490-501.

Lauw F.N., Simpson A.J., Prins J.M. et al. Elevated plasma concentrations of interferon (IFN)-gamma and the IFN-gamma-inducing cytokines interleukin (IL)-

IL-12 and IL-15 in severe melioidosis // J. Infect. Dis. — 1999. — Vol. 180, № 6. — P.1878-1885.

Stephens D.P., Fisher D.A., Currie B.J. An audit of the use of granulocyte colony-stimulating factor in septic shock // Intern. Med. J. — 2002. — Vol. 32, № 4. — P. 143-148.

Simpson A.J., Smith M.D., Weverling G.J. et al. Prognostic value of cytokine concentrations (tumor necrosis factor-alpha, interleukin-6 and interleukin-10) and clinical parameters in severe melioidosis // J. Infect. Dis. — 2000. — Vol. 181, № 2. — P. 621-625.

 

 

 

Cytokine-inducing activity of Burkholderia’s antigens

O.B. Proshina, S.I. Zukova, N.N. Piven, N.P. Khrapova,I.V. Avrorova, N.M. Drefs,

V. Zasjadkina, A.D. Kuvshinova Antiplague Research Institute, Volgograd

The purpose of this research was the studying of cytokine-inducing activity of antigens of melioidosis agent (Burkholderia pseudomallei) and closely linked nonpathogenic variety (Burkholderia thailanden- sis). In experiments in vitro on BALB/c mouse macrophages and lymphocytes lymphokines and monokines induced by burkholdreia water-salt extracts have been obtained. The correlation between protective properties of burkholderia"s antigens and some parameters of their cytokine-inducing activity (the influence on Fc-receptors expression on neutrophils, phagocytic activity of macrophages and cytotoxic activity of TNFa for mouse L-929 fibroblasts) has been shown. (Cytokines and Inflammation. 2006. Vol. 5, № 4. P. 22-25.)

Key words: melioidosis, protectivity, cytokines.

 

 

 

Новая книга

 

 

 

Сибиряк С.В., Черешнев В.А., Симбирцев А.С., Сибиряк Д.С., Гаврилова Т.В.



загрузка...