Влияние миелопептидов на пролиферацию лимфоцитов и продукцию IL-1 ? и TNFa мононуклеарами, моноцитами и нейтрофилами С.В. Гейн, Т.В. Гаврилова, В.А. Черешнев, М.В. Черешнева Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь; Пермский государственный университет; Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, Екатеринбург
Миелопептиды МП-1, МП-3, МП-5 и МП-б угнетают пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови и снижают продукцию IL-1P мононуклеарами. МП-5, кроме того, снижает синтез TNFa. Подавление пролиферации и продукции IL-ip проявляется только в условиях межклеточной кооперации и только в стимулированных культурах. На пролиферативную активность очищенных лимфоцитов, а также на продукцию провоспалительных цитокинов фракциями моноцитов и нейтрофилов миелопептиды не влияют. (Цитокины и воспаление. 2008. Т. 7, № 1. С. 24-28.)
Нормальное функционирование иммунной системы обеспечивается сложной сетью взаимосвязанных сигналов, опосредуемых эндогенными информационными субстанциями [8]. Основная роль в реализации межклеточных взаимодействий в процессе развития иммунного ответа принадлежит цитокинам, представляющим собой полипептидные макромолекулы. Кроме цитокинов в регуляции процессов пролиферации и дифференцировки иммуноцитов участвуют и низкомолекулярные пептиды. В настоящее время описано три класса таких пептидов, участвующих в процессах имму- норегуляции, — нейропептиды, пептиды тимуса и пептиды костного мозга (миелопептиды) [6, 8].
Миелопептиды (МП) представляют собой группу биорегуляторных пептидов костномозгового происхождения, состоящую из шести отдельных фракций (МП-1, МП-2, МП-3, МП-4, МП-5, МП-6) и обладающую дифференцировочной и иммунорегуляторной активностью [9]. Широкий спектр биологической активности смеси МП реализуется за счет способности отдельных пептидных фракций направленно влиять на различные звенья иммуногенеза через взаимодействие с отдельными клеточными популяциями. В настоящее время известно,что МП-1 имеет центры специфического связывания на Т-лимфоцитах [5, 10], МП-3 модулирует функции клеток моноцитарно-макрофагального ряда [1], а МП-6 стимулирует дифференцировку перевиваемой клеточной линии миеломонобластного лейкоза человека HL-60 [7]. Однако, несмотря на направленные эффекты отдельных пептидных фракций, влияние МП на процессы взаимодействия отдельных клеточных популяций в ходе развития иммунных реакций изучено недостаточно.
Цель работы — исследовать влияния миелопептидов МП-1, МП-3, МП-5 и МП-6 на функциональную активность лимфоцитов и продукцию IL-10 и TNFa моноцитами и нейтрофилами периферической крови.
Лейкоциты периферической крови здоровых мужчин-добровольцев в возрасте от 22 до 30 лет культивировали с субоптимальной (2,5 мкг/мл) концентрацией фитогемагглютинина («Sigma») в 9б-луночных круглодонных планшетах. Каждая культура содержала 2 х 105 клеток в 0,2 мл полной питательной среды, состоявшей из среды 199, 10 мМ HEPES («Sigma»), 2 мМ L-глу- тамина («Sigma»), 100 мкг/мл гентамицина и 10% аутоплазмы. Культивирование осуществляли во влажной атмосфере с 5% СО2 при 37 °С в течение 72 ч. За 18 ч до окончания культивирования в каждую лунку вносили по 2 мкКи 3Н-метилтимидина в обLеме 10 мкл.
Рис. 1. Влияние МП-1 (а), МП-3 (б) и МП-5, МП-6 (в) на ФГА индуцированный пролиферативный ответ лимфоцитов в нефракционированной лейкоцитарной суспензии и фракции лимфоцитов, n = 10
К — культуры без МП; * — р < 0,05; ** — р < 0,01; *** — р < 0,001 к контролю
Радиоактивность проб определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике «Guardian» (WaLLac, Finland). МП-1 (Phe- Leu-GLy-Phe-Thr) и МП-3 (Leu-Val-Cys-Tyr-Pro-Gln) использовали в концентрациях 10-6, 10-8, 10-10 г/мл. МП-5 (Val-Val-Tyr-Pro-Asp) и МП-б (Val-Asp-Pro-Pro) использовали в концентрации 10-7 г/мл, выбор концентрации которых основывался на исследованиях, проведенных ранее [3, 4, 7]. Использованные в работе МП любезно предоставлены профессором А.А. Михайловой (Институт биоорганической химии РАН).
Выделение фракции мононуклеаров производили на градиенте плотности фиколла-верографина (р = 1,077 г/см3). Затем клеточную суспензию дважды отмывали, суспендировали в среде 199 и выдерживали в течение 1 ч при 4 °С для снятия активации, вызванной выделением. Разделение моноцитов и лимфоцитов производили методом адгезии на чашках Петри.
Выделение нейтрофилов производили путем центрифугирования верхнего слоя плазмы с лейкоцитами на градиенте плотности фиколла-верографина (р = 1,0б8 г/см3) в течение 30 мин. Супернатант с мононуклеарными клетками удаляли, а осадок, содержащий нейтрофилы, собирали и дважды отмывали от фиколла в среде 199.
Культивирование мононуклеаров, нейтрофилов и моноцитов осуществляли в 24-луночных планшетах Costar (США) 1 х 10б клеток в 1 мл полной питательной среды 199 с добавлением 10 мМ HEPES («Sigma»), 2 мМ L-глутамина («Sigma»), 100 мкг/мл ген- тамицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ICN) во влажной атмосфере с 5% СО2 при 37 °С в течение 24 ч в присутствии липополисахарида (ЛПС, Escherichia coli 02б:Вб, «Sigma») в концентрации 0,1 мкг/мл. Супернатанты клеточных культур хранили в замороженном состоянии при -20 °С.
Определение концентрации цитокинов IL-1? и TNFa в супернатантах производили с использованием наборов ООО «Цитокин» (Санкт Петербург) в соответствии с методикой, предложенной производителем.
Все полученные данные представлены в виде средней и стандартной ошибки средней. Статистический анализ проводили с использованием парного t-критерия Стьюдента.
Миелопептид МП-1 (рис. 1а) оказывает статистически достоверное влияние на индуцированную ФГА (2,5 мкг/мл) пролиферативную активность в концентрации 10-10 г/мл, угнетая включение Н3-тимидина лимфоцитами. В случае удаления моноцитов из фракции мононуклеаров пептид МП-1 на ФГА-индуцированную пролиферацию не влияет. Следовательно, пептид не проявляет прямого действия на пролиферацию лимфоцитов, а угнетающий эффект на реакцию бласттранс- формации лимфоцитов (РБТЛ) опосредуется моноцитами. МП-3 (рис. 16) оказывает статистически достоверный эффект на выраженность пролиферации лимфоцитов в нефракционированной лейкоцитарной суспензии, угнетая интенсивность захвата Н3-тимидина в исследуемых концентрациях. Во фракции лимфоцитов эффекта пептида не зарегистрировано. Аналогичная картина имела место при анализе эффектов МП-5 и МП-6 (рис. 1е). Оба пептида угнетают РБТЛ в присутствии ФГА в нефракционированной лейкоцитарной суспензии. В случае удаления моноцитов из культуры угнетающий эффект МП-5 и МП-6 на пролиферацию не проявляется. Таким образом, зарегистрирован угнетающий эффект МП на пролиферацию лимфоцитов, проявляющийся только в нефракционированной клеточной суспензии и только при условии активации [4], т. е. эффект является опосредованным и зависит от процессов межклеточной кооперации.
Рис. 2. Влияние МП-1 на продукцию IL-1P и TNFa мононуклеарами, n=8
К — культуры без МП; * — р < 0,05; ** — р < 0,01; *** — р < 0,001 к контролю
Учитывая важную роль клеток моноцитарномакрофагального звена в регуляции направленности эффектов МП, исследовали влияние МП на продукцию мононуклеарами, моноцитами и нейтрофилами основных провоспалительных цитокинов IL-1? и TNFa, которым принадлежит пусковая роль в процессе запуска и формирования иммунного ответа. Влияние МП-1 на продукцию IL-1? и TNFa мононуклеарами периферической крови представлено на рис. 2. МП-1 угнетает продукцию IL-1? мононуклеарами в концентрации 10-10 г/мл в ЛПС-индуцированных культурах. На спонтанную продукцию IL-1? МП-1 в исследуемом диапазоне концентраций влияния не оказывает. На спонтанную и ЛПС-индуцированную продукцию TNFa мононуклеарами пептид не влияет, несмотря на тенденцию к угнетению продукции фактора в ЛПС-стимулированных культурах. Анализ влияния МП-3 (рис. 3) показал угнетение пептидом продукции IL-1? в присутствии ЛПС во всех исследуемых концентрациях. На продукцию TNFa МП-3 влияния не оказывает. Аналогичный эффект наблюдается в культурах с МП-5 и МП-6 (рис. 4). Оба пептида угнетают ЛПС-индуцированную продукцию IL-1?, а МП-5, кроме этого, снижает уровень TNFa.
Влияние МП на LPS-стимулированную продукцию IL-1? и TNFa моноцитами и нейтрофилами периферической крови представлено на рис. 5. Ни один из исследуемых пептидов на продукцию IL-1? и TNFa очищенными моноцитами не влияет. Во фракции нейтрофилов обращает на себя внимание значительно более низкий уровень продукции IL-1?, нежели во фракциях моноцитов и мононуклеаров. Уровень TNFa во фракции нейтрофилов ниже пороговых значений. Внесение в культуры МП не оказывало влияния на продукцию IL-1? и TNFa нейтрофилами.
Таким образом, полученные данные указывают на угнетающее влияние исследуемых МП на пролиферативный ответ лимфоцитов и продукцию провоспалительных цитокинов. Возможно, именно с подавлением МП продукции IL-1?, пускового фактора в каскаде иммунного ответа, связано их угнетающее влияние на пролиферацию. Отсутствие прямого влияния МП на пролиферативный ответ во фракции лимфоцитов только подтверждает данную гипотезу. Необходимо отметить, что угнетение IL-1?, также как и угнетение пролиферации, проявляется только в условиях межклеточной кооперации; во фракции моноцитов и нейтрофилов МП на уровень провоспалительных цитокинов не влияют. Ранее была показана способность МП-1 снижать фагоцитарную активность нейтрофилов in vitro [2], несмотря на то, что основной мишенью МП-1 являются CD4 + -клетки, которые опосредуют эффекты МП-1 на антитело- генез и CD4 + /CD8 + -баланс [5, 10].
Рис. 3. Влияние МП-3 на продукцию IL-1P и TNFa мононуклеарами, n=8
К — культуры без МП; * — р < 0,05; ** — р < 0,01; *** — р < 0,001 к контролю
Рис. 4. Влияние МП-5 и МП-6 на продукцию IL-1? и TNFa мононуклеарами, п=8
К — культуры без МП; * — р < 0,05; ** — р < 0,01; *** — р < 0,001 к контролю
В отношении МП-3 было показано, что пептид способен активировать фагоцитоз, цитотоксичность, усиливать адгезию моноцитов, повышать экспрессию Ia-антигенов, не влияя на синтез IL-1 и TNFa, основных факторов, участвующих в индукции иммунного ответа [1]. Полученные в настоящей работе данные указывают на возможность разнонаправленного, не только стимулирующего, влияния МП-3 на функции моноцитов. Угнетающий пролиферацию эффект у МП-5 и МП-6 может обLясняться как снижением продукции IL-1 и TNFa, так и дифференцировочной активностью [7]. Полученные результаты позволяют говорить о наличии у МП противовоспалительных свойств, несмотря на то, что их стимулирующая активность в отношении антителогенеза и фагоцитоза неоднократно описана ранее [9].
Рис. 5. Влияние миелопептидов МП-1 (10-10 г/мл), МП-3 (10-8 г/мл), МП-5 и МП-6 (10-7 г/мл) на продукцию IL-1? и TNFa моноцитами (а) и нейтрофилами (б), n = 5
К — культуры без МП; * — р < 0,05; ** — р < 0,01; *** — р < 0,001 к контролю
Концентрация TNFa во фракции нейтрофилов (б) была ниже аналитической чувствительности иммуноферментных тест-систем.
При сравнительном анализе эффектов различных МП обращает на себя внимание их однонаправленное влияние как на пролиферативный ответ, так и на продукцию IL-1? и TNFa, что предполагает наличие единого механизма действия у данной группы пептидных биорегуляторов. Тем не менее, наиболее выраженный эффект выявлен именно у МП-3, миелопептида, действующего на клетки макрофагально-моноцитарного звена.
Работа поддержана интеграционным проектом Президиума УрО РАН и СО РАН и грантами РФФИ №06-04-49001 и 06-04-48897.
Априкян В.С., Михайлова А.А., Петров Р.В. Повышение под влиянием мие- лопептида-3 антигенпредставляющей функции макрофагов // Иммунология. — 2000. — № 2. — С. 21-23.
Гаврилова Т.В., Гейн С.В. Иммуномодулирующие эффекты миелопептидов при экспериментальном проникающем ранении глаза. — Екатеринбург, 2004. — 101 с.
Гаврилова Т.В., Гейн С.В., Погудина Т.А. и др. Влияние миелопида, миелопептидов МП-5 и МП-б на пролиферативный ответ лимфоцитов // Докл. акад. наук. — 2004. — Т. 398, № 4. — С. 560-562.
Гаврилова Т.В., Гейн С.В., Погудина Т.А. и др. Механизм влияния миелопептидов на пролиферативный ответ лимфоцитов in vitro// Бюлл. эксперим. биол. мед. — 2005. — Т. 140, № 7. — С. 85-87.
Кирилина Е.А., Михайлова А.А., Малахов А.А. и др. Механизм иммунокорригиру- ющего действия миелопида-1 // Иммунология. — 1998. — № 4. — С. 26-29.
Михайлова А.А. Доклиническое изучение миелопептидов, обладающих противоопухолевой и противобактериальной активностями // Int. J. ImmunorehabiL — 2000. — Т. 2, № 2. — С. 7.
Михайлова А.А. Миелопептиды и их роль в функционировании иммунной системы // Иммунология. — 2001. — № 5. — С. 1б-18.
Петров Р.В., Михайлова А.А., Фонина Л.А. Эндогенные иммунорегуляторные пептиды (миелопиды): структура, функция, механизм действия // Биоорг. хим. — 1999. — Т. 25, № 11. — С. 811-815.
Петров Р.В., Михайлова А.А., Фонина Л.А. и др. Миелопептиды. — М.: Наука, 2000. — 181 с.
10. MikhaiLova A., Fonina L., KiriLina E. et al. Immunoregulatory properties of hexapeptide isolated from porcine bone marrow cell culture // Regul. Pept. — 1994. — Vol. 53. — P. 203-209.
S.V. Gein, T.V. Gavrilova, V.A. Chereshnev, M.V. Chereshneva Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, Perm; Perm State University; Institute of Immunology and Physiology, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, Yekaterinburg It was established that myelopeptides MP-1, MP-3, MP-5 and MP-6 decreased proliferative activity of peripheral blood lymphocytes and IL-1? production by mononuclear cells. MP-5 depressed IL-1? and TNFa synthesis. Depression of proliferation and IL-1? production took place only in stimulated cultures and in cell to cell cooperation conditions. Effects of myelopeptides on proliferative response in lymphocyte fraction and on production of proinflammatory cytokines by purified monocytes and neutrophils were not observed. (Cytokines and Inflammation. 2008. Vol. 7, № 1. P. 24-28.)
В январе 2008 г. в издательстве «Фолиант» вышла в свет книга С.А. Кетлинского и А.С. Симбирцева «Цитокины». Монография посвящена цитокинам, представляющим собой новый класс эндогенных полипептидных медиаторов межклеточного взаимодействия, которые регулируют развитие организма, ряд нормальных физиологических функций и поддержание нарушенного гомеостаза. Сейчас известно уже более 200 веществ, относящихся к семейству цитокинов. К цитокинам относятся интерфероны, интерлейкины, ростовые и колониестимулирующие факторы, хемокины, медиаторы из группы фактора некроза опухолей, трансформирующие ростовые факторы и некоторые другие молекулы. Изучение цитокинов стало самостоятельным разделом иммунологии и развивается очень быстрыми темпами. В мире и в России издается несколько специальных журналов, посвященных цитокинам. Безусловно, исследование цитокинов заслуживает систематизации накопленных знаний, проведения детального описания, сравнения всех исследуемых медиаторов и создания единой классификации цитокинов, как отдельного семейства регуляторных молекул организма.
Первая обобщающая монография на эту тему под названием «Эндогенные иммуномодуляторы» была издана в России 15 лет назад. За прошедшее время в области изучения цитокинов произошли существенные изменения, которые привели к открытию новых медиаторов, рецепторов и механизмов клеточного сигналинга. Изучение цитокинов можно считать частью развития нанотехнологий в медицине, с помощью которых разработаны и внедрены в клиническую практику рекомбинантные препараты цитокинов с охарактеризованной молекулярной структурой, проявляющие биологическую активность в наноконцентрациях и обладающие селективным фармакологическим действием.
Авторы монографии имеют более чем 20-летний опыт работы в данной области, что позволило им создать наиболее полное на сегодняшний день описание цитокинов и предложить их структурно-функциональную классификацию. Авторы подошли к характеристике цитокинов с двух сторон, разделив книгу на две основные части. Сначала читателю предоставляется возможность познакомиться со всеми основными цитокинами по отдельности, узнав об их строении, генах, рецепторах и биологических свойствах. Во второй части книги описано участие цитокинов разных семейств в регуляции главных физиологических функций организма, их роль в развитии иммунодефицитных состояний, различных видов иммунопатологии, опухолевом росте. Большое внимание уделено существующим возможностям и перспективам терапевтического применения цитокинов для лечения важнейших заболеваний человека.
Судя по последним результатам исследований в области цитокинов, приведенных в рецензируемой книге, основной вектор работ в этой интереснейшей области биомедицины направлен на разработку диагностических и лекарственных препаратов нового поколения, которые могут быть использованы при изучении фундаментальных вопросов патогенеза заболеваний, а также для создания новых современных средств диагностики и лечения.
Книга рассчитана на специалистов в области иммунологии, физиологии, патологии, нанотехнологии и наномедицины, студентов медицинских и биологических ВУЗов, а также на широкий круг врачей различных специальностей.