загрузка...
 
Динамика цитокинов при антигенемии вируса клещевого энцефалита у лиц после укуса клеща Н.В. Крылова, Г.Н. Леонова, Е.В. Павленко НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, г. Владивосток
Повернутись до змісту

Динамика цитокинов при антигенемии вируса клещевого энцефалита у лиц после укуса клеща Н.В. Крылова, Г.Н. Леонова, Е.В. Павленко НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, г. Владивосток

Исследовали динамику продукции цитокинов (TNFa, IFNy, IL-4) и антигенемии вируса клещевого энцефалита (КЭ) у людей после укуса клеща. 59 человек были разделены на 3 группы в зависимости от длительности антигенемии вируса КЭ. У лиц 1-й группы (с кратковременной антигенемией) в ранние сроки наблюдения повышалось содержание Thl-цитокинов (TNFa, IFNy), а через 4-5 недель возрастал синтез 2-цитокина (IL-4), что подтверждалось обнаружением у 55,2% лиц вирус-специфических антител класса IgG. Лица 2-й (антигенемия более 4-5 недель) и 3-й групп (антигенемия более 6 месяцев) во все сроки наблюдения демонстрировали невысокие уровни продукции сывороточных цитокинов, особенно IFNy. Вирусспецифические IgG появились у 44,4% лиц 2-й группы и только у 16,7% лиц 3-й группы. Таким образом, исследование цитокинов на самых ранних стадиях инфицирования вирусом КЭ может служить критерием направленности иммунного ответа и прогнозирования возможного исхода инфекции. (Цитокины и воспаление. 2008. Т. 7, № 1. С. 35-39.)

Ключевые слова: цитокины, антигенемия, вирус, клещевой энцефалит.

С улучшением качества лабораторной диа­гностики в последнее десятилетие в структуре заболеваемости клещевым энцефалитом (КЭ) наметилась тенденция к увеличению частоты стертых форм инфекции с хроническим течением и бессимптомным вирусоносительством. Меха­низмы развития патологического процесса при КЭ обусловлены как особенностями вирулентных свойств возбудителя, так и состоянием иммунной системы макроорганизма, которые определяют клиническое течение и исход заболевания. По современным представлениям, характер им­мунного ответа, в том числе при вирусных ин­фекциях, во многом зависит от доминирующего участия Th1- и ^2-субпопуляций лимфоцитов, которые различаются по спектру продуцируе­мых ими цитокинов [5, 12]. Так, TM-лимфоциты, продуцируя IL-2, IFNy и ряд других цитокинов, усиливают клеточный иммунный ответ, который играет существенную роль в регуляции проти­вовирусного иммунитета [3]. Формирование им­мунного ответа по гуморальному типу, с которым связаны определенные механизмы хронизации инфекционного процесса [4, 11], происходит при доминирующем влиянии ^2-цитокинов — IL-4, IL-6, IL-10. Дисбаланс цитокинового профиля, ориентированный на Th1- или №2-тип иммун­ного ответа, оказывает важное влияние как на элиминацию вируса и выздоровление больного, так и на возможность развития персистентной вирусной инфекции [12, 14]. В литературе до сих пор нет однозначных сведений о предпочтении определенного Th-типа ответа при различных вирусных инфекциях. Клещевой энцефалит при всем разнообразии клинического течения не яв­ляется исключением.

В этой связи целью настоящего исследования явилось изучение динамики продукции цитокинов, вырабатываемых преимущественно Th1 (IFNy), Th2 (IL-4) и мононуклеарными фагоцитами (TNFa), на фоне антигенемии вируса КЭ у лиц после укуса клеща.

Материалы и методы

В динамике наблюдения находилось 59 человек после при­сасывания клеща, у которых был выявлен антиген вируса КЭ, Реакция цитокинов на укус клеща но клинических проявлений заболевания зарегистрировано не было. Контрольную группу составили 20 здоровых доноров.

Для выявления антигена вируса КЭ в крови у лиц с укусом клеща использовали авторский способ экспресс-диагностики КЭ [8] иммуноферментным методом с применением тест-сис­темы ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Уровень антигенемии оценивали по оптической плотности (ОП) и показателю К (ОП исследуемой пробы/ОП отрицательного контроля). Пороговой считали величину К0 = 2,1. Для обнаружения антител к вирусу КЭ класса IgG применяли иммуноферментный метод с исполь­зованием тест-системы «Вектор-ВКЭ-IgG» производства ЗАО «Вектор-Бест».

Количественное определение концентрации цитокинов (TNFa, IFNy, IL-4) в сыворотке крови проводили иммунофер­ментным методом с использованием тест-систем производства ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск) согласно прилагаемой инструкции.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программ Statistica 6.0, Excel, а также па­кета GeoStat, разработанного В.А. Смолиным (ДВГТУ, ИИСЭ; ) и любезно предоставленного авторам статьи для апробации. Для проверки нормальности распределения показателей использовали W-критерий Шапиро—Уилкса. Про­верку достоверности различий осуществляли с помощью не­параметрических критериев Уилкоксона и Манна — Уитни [2]. Различие двух сравниваемых величин считали достоверным, если вероятность их тождества была меньше 5% (p < 0,05).

Результаты и обсуждение

В результате проведенных исследований вы­явлено (табл. 1), что в первые сроки наблюдения (3-и - 5-е сутки) после укуса клеща у всех 59 лиц обнаружен антиген вируса КЭ, уровень которого (К) в 2,2-2,7 раза превышал пороговую величину (К0 = 2,1). Повторное обследование этих лиц на наличие антигена проводилось через 4-5 недель, и при необходимости — через 6 и более месяцев. В зависимости от длительности антигенемии вируса КЭ все обследованные люди были разделены на 3 группы. Первую группу (29 человек) составили лица с кратковременной антигенемией, при пов­торном обследовании которых через 4-5 недель показатель К был ниже пороговых значений. Во второй группе (18 человек) антигенемия была более длительной, через 4-5 недель ее уровень превышал пороговые значения в 2,3 раза. Третью группу (12 человек) составили лица, у которых антиген вируса КЭ обнаруживали через 6 и более месяцев.

Установлено, что люди с кратковременной и длительной антигенемией вируса КЭ относи­лись к разным возрастным группам. Так, в 1-й группе средний возраст составил 40,1 ± 2,9 года, во 2-й группе — 44,9 ± 4,3 года, а в 3-й группе — 57,7 ± 3,2 года. Таким образом, люди с антигенемией более 6 месяцев оказались старше лиц 1-й группы (p = 0,001) и 2-й группы (p = 0,039). Кроме того, частота выявления специфических антител (IgG) к вирусу КЭ в этих группах также различалась: в 1-й группе через 4-5 недель доля серопозитивных лиц составляла 55,2%, во 2-й группе — 44,4%. В 3-й группе спустя 6 месяцев на фоне антигенемии антитела к вирусу КЭ выявлялись редко (16,7%). Эти результаты повторяют ранее полученные данные В.Г. Борисевич и Г.Н. Леоновой [1] при изучении антигенемии вируса КЭ у больных с инаппарантной формой инфекции.

При изучении характера изменений продукции цитокинов, вырабатываемых преимущественно ТЬ1-лимфоцитами (IFNy), ТЬ2-лимфоцитами (IL-4) и мононуклеарными фагоцитами (TNFa) у лиц с наличием кратковременной и длительной антигенемии вируса КЭ, были установлены сле­дующие закономерности.

В сыворотке крови лиц 1-й группы на 3-и - 5-е сутки после присасывания клеща содержание TNFa было увеличено в 3 раза (p2 = 0,003), а IFNy — в 2,3 раза (p2 = 0,0001) по сравнению с показателями в контрольной группе, повышения концентрации противовоспалительного цитокина IL-4 не выявлено (p2 = 0,211) (табл. 1). Изучено (табл. 2) взаимоотношение различных видов ци- токинов: TNFa к IL-4, характеризующее соотно­шение про- и противовоспалительного цитокинов, и отношение IFNy к IL-4, отражающее состояние баланса Th1/Th2 клеток. У лиц 1-й группы по­казатель TNFa/IL-4 был увеличен на 121,0% (p2 = 0,0001), IFNy/IL-4 — на 65,8% (p2 = 0,0001) по сравнению с контрольными показателями. Эти результаты указывают на то, что у лиц этой груп­пы на ранних стадиях инфицирования вирусом КЭ превалирует TM-тип иммунного ответа. При повторном обследовании антиген вируса КЭ у лиц 1 й группы не был обнаружен. К этому времени уровни TNFa и IFNy значимо снизились (p: = 0,039 и = 0,023, соответственно), а концентрация про­тивовоспалительного цитокина IL-4 повысилась (p1 = 0,034) по сравнению с таковыми в первые сроки наблюдения. В это же время коэффициент TNFa/IL-4, повышенный в начале наблюдения, нормализовался, достигая контрольных значе­ний. Показатель отношения IFNy/IL-4 снизился на 18,4% (p3 = 0,017) по сравнению с таковым в контрольной группе, что может расцениваться как свидетельство дифференцировки иммунного ответа в сторону №2-типа (гуморального).

У лиц с длительной антигенемией вируса КЭ (2-я и 3-я группы) формирование реакций им­мунного ответа носило другой характер. Так, во 2-й группе в первые сроки наблюдения уровень антигенемии К был равен 5,43 ± 1,15. Содержа­ние TNFa было выше в 1,9 раза по сравнению с показателями в контрольной группе (p2 = 0,013), а концентрации IFNy и IL-4 находились на уровне контрольных значений (p2 = 0,988,p2= 0,630, соответственно. При этом, если отношение TNFa/IL-4 превышало значения в контрольной группе на 86,2% (p2 = 0,002), то соотношение IFNy/IL-4 было снижено на 6,8% (p2 = 0,059) по сравнению с таковым у здоровых людей. Через 4-5 недель у лиц этой группы уровень антигенемии оставался достаточно высоким (К2 = 4,93 ± 1,03).Отмечалась тенденция к снижению содержания в сыворотке крови провоспалительного цитокина TNFa:концентрация TNFa снизилась на 18,6% (p1 = 0,048) по сравнению с таковой в начале инфицирования. В то же время в этой группе наблюдалась стимуляция продукции IFNy — на 25,5% (p1 < 0,020) и повышение концентрации противовоспалительного цитокина IL-4 на 55,5% (p1 < 0,048) по сравнению с таковым в первые сроки наблюдения. В указанные сроки отмечалось снижение соотношения IFNy/IL-4 на 25,7% (p3 = 0,0001) по сравнению с таковым в контрольной группе, что подтверждает превалирование в этой группе Т2-типа дифференцировки иммунного ответа. У лиц 3-й группы наличие антигена вируса КЭ (К1 = 4,66 ± 1,22) на 3-и - 5-е сутки после укуса клеща не сопровождалось повышением продукции TNFa (p2 = 0,471) и IL-4 (p2 = 0,800) по сравнению с контрольной группой. В то же время, у этой группы лиц в ранние сроки инфицирования наблюдалось снижение как содержания IFNy на 33,7% (p2 = 0,049), так и соотношения IFNy/IL-4 на 23,6% (p2 = 0,019) по сравнению с контрольной группой.

Таблица 1 Динамика продукции сывороточных цитокинов у лиц с различной длительностью антигенемии вируса КЭ

 

Примечание к табл. 1 и 2. 1-я группа — лица с кратковременной антигенемией в КЭ; 2-я группа — лица с антигенемией более 4-5 недель; 3-я группа — лица с длительной антигенемией более 6 месяцев; А — первое обследование (1-я сыворотка); Б — второе обследование (2-я сыворотка); р1 — значимость различий между показателями 1-й и 2-й сывороток в группах (парный критерий Уилкоксона); р2 — значимость различий между показателями 1-й сыворотки в группах и контролем (критерий Манна — Уитни); р3 — значимость различий между показателями 2-й сыворотки в группах и контролем (критерий Манна — Уитни).

Таблица 2 Соотношение цитокинов TNFa и IFNy к противовоспалительному цитокину IL-4 у лиц с различной длительностью антигенемии вируса КЭ

 

Через 6 месяцев в этой группе лиц, не­смотря на отсутствие клинических проявлений, уровень антигенемии все еще оставался несколько выше пороговых значений (К2 = 2,71 ± 0,65). При этом отмечалась стимуляция продукции IFNy на 31,6% (p1 < 0,020) и повышение концентрации IL-4 на 51,8% (p1 < 0,02) по сравнению с таковыми в первые сроки наблюдения. Коэффициент IFNy/IL-4 снизился на 38,4% (p3 = 0,005) по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует о формировании ТЬ2-типа иммунного ответа в этой группе лиц.

Полученные данные демонстрируют различный характер иммунного ответа при кратковременной и длительной антигенемии у лиц, инфицирован­ных вирусом КЭ. Так, у лиц с кратковременной антигенемией уже в ранние сроки инфициро­вания доминирует Thl-тип иммунного ответа, сопровождающийся значительным повышением концентрации цитокинов TNFa и IFNy. В динамике наблюдения (через 4-5 недель) у лиц этой груп­пы на фоне произошедшей элиминации антигена вируса КЭ увеличилось содержание в сыворотке крови противовоспалительного цитокина IL-4, что свидетельствовало о дифференцировке им­мунного ответа по Т2-типу. Это подтверждалось обнаружением у 58,6% лиц вирус-специфических антител класса IgG, которые, как известно [10, 11], обладают наиболее выраженной афинностью и вирус-нейтрализующим действием среди анти­тел, вырабатывающихся в ответ на вирусные ан­тигены. Таким образом, у лиц с кратковременной антигенемией активацию клеточного звена имму­нитета, выявленную в первые сутки наблюдения, с переключением на активацию гуморального звена в более поздний срок, можно рассматривать как адекватный иммунный ответ организма, который способствует быстрой элиминации вируса и не требует дополнительных лекарственных препа­ратов.

Наличие антигенемии вируса КЭ у лиц 2-й группы в первые сроки наблюдения вызывало повышение содержания провоспалительного цитокина TNFa, что указывало на активацию клеточного звена иммунитета. В то же время незначительная (на уровне контроля) продукция IFNy, ключевого «определителя» Th-дихотомии, свидетельствовала о возможной дифференциров- ке иммунного ответа у лиц этой группы в пользу №2-типа (гуморального) уже в ранние сроки ин­фицирования. Невысокие показатели продукции IFNy, выявленные в эти сроки, дали нам основание предположить возможность замедленной эли­минации вируса КЭ. Действительно, через 4-5 недель во 2-й группе лиц все еще обнаруживался достаточно высокий уровень антигенемии вируса КЭ. При этом повышения продукции провоспали- тельного цитокина TNFa не обнаружено, более того, отмечалась тенденция к снижению его содер­жания. В этот срок наблюдения регистрировалась достоверно значимая стимуляция продукции IFNy и IL-4 (на уровне значений 1-й группы), что, ве­роятно, способствовало обеспечению выработки антител класса IgG к вирусу КЭ у 44,4% лиц этой группы. Спустя 6 месяцев у лиц этой группы ан­тигена вируса КЭ не обнаруживали.

Особый интерес для наблюдения представляли лица 3-й группы с антигенемией, длившейся более 6 месяцев, у которых показатели инфицирован- ности вирусом КЭ были ниже, чем в 1-й и 2-й груп­пах, но возраст которых был выше. Как в ранние сроки наблюдения (3-и - 5-е сутки), так и через 6 месяцев наличие антигена вируса КЭ у лиц этой группы вызывало незначительную продукцию сывороточных цитокинов, уровень которых был ниже, чем в 1-й и во 2-й группах. Уже в первые сроки наблюдения обращало на себя внимание крайне низкое содержание в сыворотке крови этих лиц IFNy (ниже контрольных значений) и отсутствие стимуляции IL-4, что предполагало неактивный антителогенез. По существующим в настоящее время представлениям, активация специфического противовирусного иммунного ответа с участием IFNy — важного иммунорегуляторного цитокина — является ключевым моментом противовирусной защиты макроорга­низма [3]. В дальнейших наблюдениях у лиц этой группы была отмечена стимуляция продукции IFNy и IL-4 (№2-путь иммунного ответа), но, как и предполагалось ранее, вирус-специфические антитела класса IgG появились только у 16,7% лиц. Кроме того, наличие в этот период наблюде­ния невысокого уровня антигенемии вируса КЭ у лиц 3-й группы также предопределило недоста­точную продукцию противовирусных антител. Все это способствовало развитию длительной персистенции вируса. Как известно по данным других авторов [7], бессимптомные формы КЭ ха­рактеризуются слабо выраженной антигенемией, но при этом достаточно высоким уровнем цирку­ляции специфических иммунных комплексов и низким уровнем гуморального ответа. По мнению других авторов [4, 9, 10], персистенция вируса КЭ в макроорганизме связана также с биологически­ми свойствами возбудителя (низкая авидность, способность к формированию дефектных частиц), которые оказывают влияние на полноценность иммунного ответа.

Известно, что развитие иммунного ответа по Th1- или Th2-типу зависит от комплекса факторов: природы иммуногена, исходного ци- токинового профиля пациента, дозы антигена в момент его представления, а также генетической предрасположенности индивида к определенно­му типу ответа [6, 13]. Полученные нами данные позволили предположить, что длительная анти- генемия вируса КЭ у лиц 3-й группы, средний возраст которых — 57,7 ± 3,2 года, вероятно, свидетельствовала об иммунной недостаточности макроорганизма еще до попадания вируса. На это указывали невысокие уровни продукции сыво­роточных цитокинов на протяжении всего срока наблюдения.

Таким образом, нами впервые была показана взаимосвязь продукции сывороточных цитокинов с уровнем антигенемии вируса КЭ в крови лиц после укуса клеща в динамике наблюдения. Исследова­ние цитокинов на самых ранних стадиях инфициро­вания может служить критерием направленности иммунного ответа и прогнозирования возможного исхода инфекции. Это, — в свою очередь, вероятно, может поставить вопрос о целесообразности при­менения специфической иммунотропной терапии или о необходимости применения иммунокорригирующих препаратов у лиц, инфицированных вирусом КЭ после укуса клеща.

ЛИТЕРАТУРА

Борисевич В.Г., Леонова Г.Н. Клещевой энцефалит (к 65-летию открытия). — Владивосток. — 2002. — С. 48-59.

Гланц С. Медико-биологическая статистика. — М., Практика. — 1999. — 459 с.

Ершов Ф.И., Наровлянский А.Н., Мезенцева М.В. Ранние цитокиновые реак­ции при вирусных инфекциях // Цитокины и воспаление. — 2004. — Т. 3, № 1. — С. 3-6.

Жукова О.Б., Рязанцева Н.В., Новицкий В.В. Вирусная персистенция: иммуно­логические и молекулярно-генетические аспекты патогенеза // Бюлл. Сибирск. мед. — 2003. — № 4. — С. 113-120.

Кетлинский С.А. Роль Т-хелперов типов 1 и 2 в регуляции клеточного и гумо­рального иммунитета // Иммунология. — 2002. — № 2. — С. 77-79.

Коненков В.И. Структурные основы и функциональная значимость аллельного полиморфизма генов цитокинов человека и их рецепторов // Мед. имму- нол. — 2003. — Т. 5, № 1-2. — С. 11-28.

Кузяев Р.З., Пархоменко Т.Г., Душкин Е.А. и др. Антигенемия и циркуляция специфических иммунных комплексов при бессимптомном течении клещевого энцефалита // Ж. микробиол. — 1998. — № 2. — С. 86-88.

Леонова Г.Н., Борисевич В.Г. Патент № 2205652 «Способ выделения арбови- русов, в частности клещевого энцефалита», 10.06.2003.

9. Маянский А.Н., Бурков А.Н., Астафьев Д.Г. и др. Персистенция вирусов: имму­нологические и патогенетические аспекты // Клин. мед. — 1998. — № 12. — С. 19-25.

Насырова Р.Ф., Рязанцева Н.В., Жукова Н.Г. и др. Молекулярные и клеточные основы патогенеза клещевого энцефалита // Бюлл. Сибирск. мед. — 2006. — Прил. 1. — С. 42-51.

Фрейдлин И.С., Тотолян А.А. Клетки иммунной системы. — СПб.: Наука, 2001. — 390 с.

Del Prete G. The concept of type-1 and type-2 helper T cells and their cytokines in humans // Int. Rev. Immunol. — 1998. — Vol. 16, № 3-4. — P. 427-455.

Kitamura N., Kaminuma O., Mori A. et al. Correlation between mRNA expres­sion of Th1/Th2 cytokines and their specific transcription factors in human helper T-cell clones // Immunol. Cell. Biol. — 2005. — Vol. 83, № 5. — P. 536-541.

Pellegrini P., Contasta I., Berghella A.M. et al. The Th1 and Th2 cytokine network in healthy subjects: suggestions for experimental studies to create prognostic and diagnostic indices for biotherapeutic treatments // Cancer Biother. Radio- pharm. — 2000. — Vol. 15, № 3. — P. 267-278.

Dynamics of cytokines and tick-borne encephalitis virus antigenemia in individuals after stinging of the tick

N.V. Krylova, G.N. Leonova, E.V. Pavlenko

Institute of Epidemiology and Microbiology, Siberian Branch RAMS, Vladivostok

Production of cytokines (TNFa, IFNy, IL-4) and tick-borne encephalitis (TBE) virus antigenemia in individuals after a sting of the tick were studied. Depending on the duration of the TBE virus antigenemia, 59 patients were divided into 3 groups. Group I (with short-term antigenemia) demonstrated an early increase of Th1 cytokines (TNFa, IFNy). 4-5 weeks later, a rise of Th2 cytokine (IL-4) was observed in this group, which was followed by virus specific IgG antibodies in 55,2 % of patients. Low levels of serum cytokines, especially IFNy, have been detected in groups II (with antigenemia more than 4-5 weeks) and III (with antigenemia more than 6 months) at all terms of observation. Virus specific IgG has appeared in 44,4 % patients of group II and only in 16,7 % patients of group III. Thus, the study of cytokines at the earliest stages of TBE virus infection could provide criteria for the defining of the immune response trend and prognosis of the infection outcome. (Cytokines and Inflammation. 2008. Vol. 7, № 1. P. 35-39.)

Keywords: cytokines, antigenemia, virus, tick-borne encephalitis.



загрузка...