Сравнение наборов реагентов для определения интерлейкина 1бета и интерлейкина 6 двух различных производителей Т.Г. Рябичева, Н.А. Вараксин, Н.В. Тимофеева
С целью расширения номенклатуры выпускаемых диагностических наборов в ЗАО «Вектор-Бест» была проведена разработка двух новых наборов реагентов для количественного определения интерлейкина 1бета (И-1Р) и интерлейкина 6 (11.-6) человека методом им- муноферментного анализа (ИФА). С началом их производства перечень наборов для ИФА цитокинов в каталоге продукции предприятия возрос до 9 наименований.
Интерлейкин 1бета относится к семейству интерлейкина 1, вместе с ТILа и 11.-6 входит в группу провоспалитель- ных цитокинов и играет центральную роль в локальном и системном, остром и хроническом воспалении [5]. И-1Р представляет собой полипептид с молекулярной массой 17 кДа, который преимущественно продуцируется макрофагами и фагоцитами (в меньшей степени лимфоцитами, фибробластами, эпителиальными клетками). 11.-10 инициирует и регулирует воспалительные и иммунные процессы, активирует нейтрофилы, Т- и В-лимфоциты, стимулирует синтез белков острой фазы, цитокинов, молекул адгезии, простагландинов. Он также повышает хемотаксис, фагоцитоз, гемопоэз, проницаемость сосудистой стенки, цитотоксическую и бактерицидную активность, стимулирует синтез коллагена. Кроме того, 11.-10 служит медиатором взаимодействий между иммунной и нервной системами, участвует в формировании костной ткани, секреции инсулина, регулировании аппетита, развитии лихорадки [4].
Синтез И-1Р в организме человека, как правило, происходит в ответ на бактериальную инфекцию, действие микробных токсинов, воспалительных агентов, активированных компонентов комплемента или системы свертывания крови, а также других цитокинов [5]. Повышение содержания И-1Р в крови отмечено при обострении панкреатита, язвенной болезни, вирусного гепатита, болезни Крона, пневмокониозе, туберкулезе и др. [3]. Кроме того, у больных с ревматоидным артритом его уровень возрастает в синовиальной жидкости, а у пациентов после неврологических воспалений или инсультов — в цереброспинальной жидкости. Содержание IL-ip в сыворотке крови здоровых людей не превышает 6 пг/мл.
Результаты изучения спонтанного и индуцированного митогенами синтеза IL-ip мононуклеарами периферической крови (МПК) показали, что его продукция in vitro в культуре клеток и ex vivo в цельной крови у пациентов с различными заболеваниями отличается. Она повышена при бактериальных инфекциях: пневмокониозе, саркоидозе, туберкулезе; и понижена у больных с атопиями, раком легкого, респираторными вирусными инфекциями [2]. Мононуклеары периферической крови здоровых доноров (106 клеток/мл) могут спонтанно продуцировать IL-ip от 2 до 250 пг/мл, а при индукции фитогемагглютинином (ФГА) — 200-2500 пг/мл.
Интерлейкин 6 представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 26 кДа, является плейотропным цитокином, координирующим иммунный и острофазный воспалительный ответы, а также онкогенез и гемопоэз [6]. Синтез IL-6, осуществляемый как лимфоидными, так и нелимфоидными клетками (лимфоцитами, макрофагами, фибробластами, гепатоцитами, васкулярными, эндоте- лиальными, опухолевыми и др.), стимулируют митогены, липополисахариды, IL-1, TNFa и вирусы. Одна из основных функций IL-6 состоит в регуляции процессов созревания антителообразующих клеток и продукции ими иммуноглобулинов. IL-6 участвует в активации Т-лимфоцитов, индуцирует синтез многих острофазных белков: фибриногена, альфа1-антихимотрипсина, гаптоглобина, сывороточного амилоида А, С-реактивного белка и др. Кроме того, он способен ингибировать синтез провоспалительных цитокинов (IL-ip и TNFa), может оказывать гормоноподобное действие на печень, поддерживая гомеостаз глюкозы [2].
Повышенные уровни IL-6 наблюдаются при многих патологических состояниях человека, таких как артрит и болезнь Кастлемана, гломерулонефрит, псориаз, воспаление кишечника, злокачественные плазмоцитома, миелома, лимфома, лейкемия, рак яичников. Его концентрация также возрастает при травмах или обширных хирургических операциях, ишемии и ожогах. Содержание IL-6 в сыворотке крови человека коррелирует с индексоммассы тела, а также возрастает при ожирении и атеросклерозе. IL-6 может повышать сывороточный уровень триглицеридов и глюкозы, а также стимулировать гипота- ламо-гипофизарно-надпочечниковую систему, активность которой играет важную роль при заболеваниях, связанных с нарушениями обмена веществ [2, 3, 6]. Содержание IL-6 в сыворотке крови здоровых людей не превышает 10-15 пг/мл. Спонтанная продукция IL-6 МПК здоровых доноров (106 клеток/мл) составляет от 2 до 600 пг/мл, ФГА-индуцированная продукция — 9000-30000 пг/мл.
Рис. 1. Диаграмма рассеяния значений IL-ip, полученных в наборах «ИЛ-1бета-ИФА-Бест» и «Quantikine Human IL-1beta Immunoassay»
R! = 0,9891
Рис. 2. Диаграмма рассеяния значений IL-6, полученных в наборах «ИЛ-6-ИФА-Бест» и «Quantikine Human IL-6 Immunoassay»
Мониторинг концентрации сывороточных цитокинов IL-ip, IL-6 и их спонтанной и митоген-индуцированной продукции клетками крови больных в ходе противовирусной, антибактериальной или иммуномодулирующей терапии позволяет оценить эффективность проводимого лечения и при необходимости скорректировать его.
Целью настоящей работы было предварительное испытание наборов реагентов «ИЛ-1бета-ИФА-Бест» и «ИЛ-6-ИФА-Бест», в том числе их сравнение с импортными тестами аналогичного назначения по некоторым основным параметрам.
Сложность проведения таких исследований состояла в том, что в настоящее время не существует аттестованных контрольных материалов с точно определенной концентрацией данных цитокинов. Поэтому для проведения этой работы были использованы образцы сыворотки крови доноров, а также панель положительных образцов (ППО), которая была нами приготовлена при разведении в 10 и 100 раз отрицательной донорской сывороткой суперна- тантов, полученных при индуцированной ФГА продукции цитокинов клетками цельной крови пациентов [1].
В качестве тестов сравнения использовали наборы реагентов «Quantikine Human IL-1peta Immunoassay» и «Quantikine Human IL-6 Immunoassay» фирмы «R&D Systems», Great Britain («RnD»). В результате исследования с их помощью ряда образцов сыворотки крови доноров были созданы 3 рабочие панели сывороток: I — с концентрацией IL-1P ниже 3,9 пг/мл, II и III — с содержанием IL-6 меньше и больше 3,12 пг/мл, соответственно. Такие концентрации IL-1P и IL-6 имеют нижниекалибровочные образцы наборов фирмы «RnD», и они же являются минимальными (пороговыми) уровнями этих цитокинов, определяемыми в анализируемых пробах при использовании данных наборов.
При исследовании I рабочей панели сывороток с помощью набора «ИЛ-1бета-ИФА-Бест» концентрация этого цитокина в каждом из 21 образца была менее 3 пг/мл. Содержание IL-6 в 26 сыворотках II панели, определенное при использовании набора «ИЛ-6-ИФА-Бест», находилось в диапазоне 0,0-2,7 пг/мл. Таким образом, полученные данные показали, что анализ сывороток крови, содержащих IL-1? и IL-6 в концентрациях ниже минимальных пороговых уровней наборов «RnD», с использованием разработанных наборов реагентов «ИЛ-1бета-ИФА-Бест» и «ИЛ-6-ИФА-Бест» дает близкие результаты.
Для изучения корреляции между результатами определения IL-1?, получаемыми при проведении ИФА с набором реагентов «ИЛ-1бета-ИФА-Бест» и набором-аналогом «RnD», были протестированы 19 образцов ППО с различной концентрацией данного цитокина. Как видно из диаграммы рассеяния (рис. 1), результаты исследования ППО, полученные при использовании двух наборов, хорошо совпадают (коэффициент корреляции r = 0,999).
Результаты анализа 18 сывороток III панели с концентрацией IL-6 в интервале 3,12-43,80 пг/мл и 8 образцов ППО, полученные при использовании наборов «ИЛ-6- ИФА-Бест» и «RnD» (рис. 2), также хорошо коррелировало (r = 0,995).
Чувствительность анализа (минимальную определяемую концентрацию, Смин) вычисляют по калибровочному графику либо по соответствующей программе, исходяиз оптическои плотностиОПрассчитаннои поформуле:
ОПСmin = ОП0ср + 2?
где: ОП0ср — среднее арифметическое значение ОП в 12 лунках с нулевой калибровочной пробой;? — среднее квадратичное отклонение от ОП0ср Чувствительность набора реагентов «ИЛ-1бета-ИФА-Бест» составила 0,49 пг/мл (соответствующий показатель длянабора «RnD», приведенный в его паспорте, — 1,00 пг/мл),а набора «ИЛ-6-ИФА-Бест» — 0,43 пг/мл (набор-аналог«RnD» — 0,70 пг/мл, по паспортным данным).
В рамках настоящей работы была также проведенапредварительная клиническая проверка новых наборовреагентов ЗАО «Вектор-Бест». Они были использованы дляопределения концентрации сывороточных IL-1? и IL-6 уусловно здоровых доноров крови в возрасте 20-50 летиз Новосибирской области и Алтайского края. Средняяконцентрация IL-1? в сыворотке крови 125 обследованныхдоноров составила 1,6 пг/мл (от 0 до 11,2 пг/мл), причему 116 (92,8 %) человек она была ниже 5 пг/мл. Средняяконцентрация IL-6 для 46 доноров составила 3,2 пг/мл(0-28 пг/мл), а у 42 (91,3 %) из них была ниже 10 пг/мл.Кроме того, у 32 условно здоровых доноров крови сиспользованием наборов реагентов «ИЛ-1бета-ИФА-Бест»и «ИЛ-6-ИФА-Бест» была исследована спонтанная и стимулированная митогеном продукция данных цитокиновклетками цельной крови. С этой целью пробу крови пациентов забирали утром натощак в пробирки с гепариномнатрия, разводили в 5 раз средой DMEM M, содержащей гепарин (2,5 ЕД/мл), гентамицин (100 мкг/мл), L-глютамин (0,6 мг/мл), и культивировали при 37 °C 24 ч. Для стимуляции продукции цитокинов перед культивированием добавляли 10 мкг/мл ФГА [6]. Спонтанная продукция IL-ip клетками крови доноров варьировала в интервале от 6 до 250 пг/мл, а стимулированная ФГА — 270-2360 пг/мл. Для IL-6 соответствующие показатели составили 8-365 и 9600-29500 пг/мл.
Проведенные исследования показали, что результаты определения цитокинов IL-ip и IL-6 в пробах с их различным содержанием, полученные с применением наборов реагентов «ИЛ-1бета-ИФА-Бест» и «ИЛ-6-ИФА-Бест» и аналогичных наборов фирмы «R&D Systems» хорошо коррелируют (r = 0,999 и 0,995, соответственно). Чувствительность новых наборов ЗАО «Вектор-Бест», по крайней мере, не уступает наборам «RnD». Таким образом, наборы реагентов «ИЛ-1бета-ИФА-Бест» и «ИЛ-6-ИФА-Бест» могут быть успешно использованы в лабораторной практике для определения сывороточных IL-ip и IL-6, а также для измерения их спонтанной и митоген-индуцированной продукции клетками крови человека.
Литература
Рябичева Т.Г., Вараксин Н.А., Тимофеева Н.В. и др. Новости «Вектор-Бест». — 2006. — № 4 (42). — С. 12-14.
Тотолян А.А., Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы. — СПб.: Наука, 2000. — С. 173-178.
Царегородцева Т.М., Серова Т.И. Цитокины в гастроэнтерологии. — М.: Анахарсис, 2003. — С. 24-26.
Dinarello C.A. Interleukin-1. In: The Cytokine Handbook / A.W. Thomson and M.T. Lotze, Eds. — London: Academic Press, 2003. — P. 643-668.
Fields Virology / D.M. Knipe Ed. — Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. — Vol. 1. — P. 321-353.
Kishimoto T. in: The Cytokine Handbook / A.W. Thomson and M.T. Lotze, Eds. — London: Academic Press, 2003. — P. 281-304.
Авдеева Ж.И., Акользина С.Е., Алпатова Н.А. и др. Оптимизация вакцинального процесса с помощью цитокинов // Russ. J. Immunol. — 1999. — Vol. 4, SuppL. 1. — P. 54.
Медуницын Н.В. Вакцинология. — М.: Триада Х, 2004. — 446 с.
Медуницын Н.В., Акользина С.Е., Авдеева Ж.И. и др. Цитокины в вакцинальном процессе // Тр. I Всеросс. конгр. патофизиол. — М., 1996. — C. 153-154.
Мовсесянц А.А. Современные проблемы лечения гидрофобии антирабичес- кими препаратами: Автореф. дисс. ... д-ра мед. наук. — М., 1993.
Симбирцев А.С. Цитокины — новая система регуляции защитных реакций организма // Цитокины и воспаление. — 2002. — Т. 1, № 1. — С. 9-17.
Шестопалов А.М., Рассадкин Ю.Н., Устинова Е.Н. и др. Влияние фактора некроза опухоли а на эффективность вакцинации против бешенства // Вопр. вирусол. — 2002. — № 3. — С. 37-40.
Aubert M.F., Blancou J., Selve M. Vaccination contre La rage: combinasion optimale des doses de vaccines injections // J. Biol. Stand. — 1985. — Vol. 13, № 1. — P. 23-30.
Blancou J., Aubert M.F., Andral L. Studies on pathogenic, immunogenic, and protective efficiency of fox rabies virus before and after adaptation to cell culture: application to vaccination against rabies // Can. J. Microbiol. — 1983. — Vol. 29, № 1. — P. 77-83.
Meuer S.C., Dumann H., Meyer zum Buschenfelde K.H., Kohler H. Low-dose interleukin-2 induces systemic immune responses against HBsAg in immunode- ficient non-responders to hepatitis B vaccination // Lancet. — 1989. — Vol. 1, № 8628. — P. 15-18.
Nunberg J.H., Doyle M.V., York S.M., York C.J. Interleukin 2 acts as an adjuvant to encrease the potency of inactivated rabies virus vaccine // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1989. — Vol. 86, № 11. — P. 4240-4243.
Playfair J.H., De Souza J.B. Recombinant gamma interferon is a potent adjuvant for a malaria vaccine in mice // Clin. Exp. Immunol. — 1987. — Vol. 67, № 1. — P. 5-10.
Quiroga J.A., Castillo I., Porres J.C. et al. Recombinant gamma interferon as adjuvant to hepatitis B vaccine in haemodialysis patients // Hepatology. — 1990. — Vol. 12, № 4, pt. 1. — P. 661-663.
Reed L.J., Muench H. A simple method for estimating fifty percent end points // Am. J. Hyg. — 1938. — Vol. 27. — P. 493-497.
Sagara T., Mori S., Ohkawara S. et al. A limited role of IL-1 immune enhancement by adjuvants // Immunology. — 1990. — Vol. 71, № 2. — P. 251-257.