ФГУН Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратовим. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора, Москва
В экспериментах на мышах установлено стимулирующее действие рекомбинантных человеческихцитокинов на иммуногенную активность вакцины против бешенства (КОКАВ). Наиболее выраженноедействие оказывали рчИ-ip, рчТЫРа в виде монопрепаратов или комплекс цитокинов, включающийрчIL-1?, рчIL-2 и рчTNF?. Исследуемые препараты цитокинов повышали протективный эффект культуральной антирабической вакцины КОКАВ, оцениваемый по уровню резистентности беспородныхбелых мышей к заражению фиксированным вирусом бешенства, штамм CVS. Введение животнымцитокинов в качестве адъювантов способствовало также формированию более высоких титров ви-рус-нейтрализующих антител, превышающих в 2,5-6 раза уровень титров антител в контрольныхгруппах животных, иммунизированных одной вакциной КОКАВ. (Цитокины и воспаление. 2007.Т. 6, № 2. С. 46-50.)
История исследования роли цитокинов в развитии иммунного ответа насчитывает более 50 лет, тем не менее, многие вопросы, связанные с изучением роли цитокинов в развитии поствакцинального иммунитета, остаются недостаточно изученными [2, 5, 6]. Имеются сообщения об использовании препаратов цитокинов в качестве адъювантов при введении вакцин [1, 3, 7, 10, 15]. В экспериментах на лабораторных животных отмечена эффективность использования фактора некроза опухолей альфа(TNF?), интерлейкина 2 (IL-2) при вакцинации против бешенства и герпеса, интерферона гамма (IFN?), IL-1 — при вакцинации против малярии и гепатита В [11, 12], №N7 — при вакцинации против гепатита В пациентов на гемодиализе [13]. Поиск средств, способствующих формированию поствакцинального иммунитета, является крайне актуальным. В частности, это касается проблемы ускоренного формирования полноценного поствакцинального иммунитета против бешенства после укуса больными животными до появления у пациентов клинических признаков заболевания [4, 8, 9].
Цель настоящей работы заключалась в изучении на моделях экспериментальных животных возможности использования ряда цитокинов —рчIL-1?, рчIL-2, рчTNF?, тимозина а1, гибридного белка «неотима» и имунофана в качестве адъювантов при иммунизации против бешенства.
Экспериментальные исследования по изучению адъювантных свойств цитокинов проведены на 1430 беспородных белых мышах массой 7-8 г и 12-14 г. Животные получены из Центрального питомника лабораторных животных РАМН «Биомодель».
В работе использованы следующие вакцины:
Культуральная антирабическая вакцина (КАВ) инактивированная сухая из штамма вируса бешенства «Внуково-32», выращенного на первичной культуре клеток почек сирийского хомяка. В опытах использованы коммерческие серии вакцины КАВ с иммуногенной активностью 2,01 МЕ, 0,54 МЕ, 1,79 МЕ и 1,0 МЕ (производство ИПВЭ РАМН им. М.П. Чумакова, Москва, и НПО «Иммунопрепарат», Уфа).
Культуральная антирабическая вакцина концентрированная и очищенная методом ультрафильтрации (КОКАВ) инактивиро- ванная сухая. В экспериментах на животных использованы коммерческие серии вакцины КОКАВ с иммуногенной активностью 13,80 МЕ и 5,62 МЕ (производство ИПВЭ РАМН им. М.П. Чумакова, Москва).
При внутримозговом заражении беспородных белых мышей использовали стандартный разрешающий фиксированный вирус бешенства, штамм CVS (Challenge virus standart), вводимый в объеме 0,03 мл. Заражающая доза вируса была в пределах 3,0-3,6 lg LD50 или 0,6-0,9 lg LD50 (в зависимости от схемы эксперимента).
В работе использованы следующие рекомбинантные препараты цитокинов человека:
тимозин альфа 1 человека рекомбинантный (Та) (НИИ прикладной микробиологии, Оболенск),
гибридный белок «неотим», состоящий из рекомбинантного TNFa человека и тимозина альфа 1 (Ta-TNF-Ta) (НИИ прикладной микробиологии, Оболенск),
имунофан (НПП «БИОНОКС», Москва).
Все указанные препараты условно объединены под термином «цитокины».
Влияние цитокинов на протективный эффект вакцинации изучали в тесте защиты иммунизированных животных одним из двух видов инактивированной культуральной антирабичес- кой вакцины (КОКАВ или КАВ) при последующем заражении их фиксированным вирусом бешенства (штамм CVS). При этом применяли две схемы вакцинации и заражения мышей.
В первой серии экспериментов цитокины и вакцину вводили мышам одновременно. После окончания вакцинации животных заражали фиксированным вирусом бешенства. При этом опытным группам животных вакцину КОКАВ вводили внутри- брюшинно в разведениях 1:25, 1:125, 1:625 или 1:50, 1:500, 1:5000. Цитокины вводили внутрибрюшинно в обьеме 0,5 мл. Каждая группа, соответствующая одному из разведений вакцины, включала по 10-15 мышей. Вакцину и цитокины вводили животным двукратно с интервалом в одну неделю. Цитокины использовали в виде монопрепаратов или в виде комплекса отдельных цитокинов (монопрепараты — рчК-1р, рчTNFa, Ta, Ta-TNF-Ta в дозе 1000 нг на 1 мышь, комплекс цитокинов состоял из рчК-1р — 10 нг, рчК-2 — 10 МЕ, рчTNFa — 10 Е на 1 мышь). Контрольным группам мышей вакцину КОКАВ вводили в тех же разведениях, что и опытным группам, но без цитокинов. На 8-й день после окончания иммунизации мышам вводили фиксированный вирус бешенства. Заражающая доза вируса при внутримозговом введении составляла 3,0-3,6 lg LD50 в объеме 0,03 мл. Наблюдение за животными проводили в течение 14 дней, отмечая гибель, начиная с 6 дня после заражения. Эффективность вакцинации при изолированном использовании вакцины КОКАВ или сочетанном ее применении с цитокинами оценивали по числу выживших животных в каждой из групп, соответствующих разведению вакцины. Определяли процент выживших животных и величину предельно допустимого разведения вакцины, обеспечивающую 50 %-ную выживаемость животных после заражения вирусом бешенства (КР50), рассчитанную по методу Reed — Muench [14].
Во второй серии экспериментов опыт начинали с заражения мышей путем интрацеребрального введения фиксированного вируса бешенства в дозе 0,6-0,9 lg LD50 в обьеме 0,03 мл. Сразу после заражения опытным группам мышам начинали вводить
вакцину КАВ по 0,1 мл подкожно в сочетании с цитокинами. Инъекции препаратов проводили в течение пяти дней с интервалом в 24 часа. Для иммунизации использовали цельную вакцину КАВ и ее разведения 1:4, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512. Каждое разведение вакцины вводили группе животных, состоящей из 10-15 мышей. Цитокины вводили животным подкожно в объеме 0,5 мл, доза для рч11_-1р составляла 200 нг/мышь, имунофа- на — 50 нг/мышь. Контрольным группам животных вакцину КАВ вводили в те же сроки и тех же разведениях, что и опытным группам, но без цитокинов.
Как при первой, так и при второй схеме экспериментов адекватность выбранной заражающей дозы вируса оценивали путем интрацеребрального введения десятикратных разведений вирус-содержащего материала неиммунизированным беспородным мышам. Доза инокулята в мозг мыши составляла 0,03 мл. Результаты опытов оценивали по числу павших и выживших животных на каждое разведение препарата. Титр тест-вируса рассчитывали по методу Reed — Muench [14].
На 7-е сутки после окончания иммунизации в сыворотке крови вакцинированных животных определяли титр вирус-ней- трализующих специфических антител в реакции биологической нейтрализации (РБН) на беспородных белых мышах массой 7-8 г. Постановку реакции осуществляли, используя постоянную дозу вируса бешенства, штамм CVS (38 LD50), и 5-кратные разведения предварительно инактивированной сыворотки иммунизированных мышей. Равные объемы вирус-содержащей жидкости и тестируемой сыворотки смешивали и выдерживали при 37 оС в течение 1,5 часов. Указанную смесь после инкубации реагентов вводили в мозг животных в объеме 0,03 мл. Наблюдение за мышами проводили в течение 14 дней, учитывая их гибель, начиная с 6-го дня после инъекции. Определяли процент выживших животных и величину титра вирус-нейтрализующих антител.
Статистическую обработку данных проводили с использованием стандартного пакета статистических программ. Достоверность уровня различия сравниваемых величин оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.
В первой серии экспериментов, проводимых на беспородных белых мышах, изучали эффективность вакцинации против бешенства при использовании вакцины КОКАВ в сочетании с цитокинами. Указанные препараты вводили мышам до их заражения фиксированным вирусом бешенства, штамм CVS. Результаты исследований с использованием комплекса цитокинов приведены в табл. 1.
Как видно из табл. 1, использование при иммунизации животных вакцины КОКАВ в сочетании с комплексом цитокинов (рчIL-10, рчIL-2, рчTNFa) способствует повышению ее эффективности. Отмечен больший процент выживаемости экспериментальных животных при заражении фиксированным вирусом бешенства по сравнению с контрольной группой. Процент выживших животных, иммунизированных вакциной в разведении 1:50 и 1:500, в опытной группе статистическидостоверно отличался от показателей контрольнойгруппы (р < 0,05). Так, при использовании вакциныв разведении 1:50 процент выживших животныхв опытной группе в 2,0 раза превышал показатели контроля (83,4 % и 40,0 %, соответственно), апри использовании вакцины в разведении 1:500 вопытной группе выжило 46,1 % мышей, тогда какв контрольной группе все животные погибли. Показатель КР50 (величина предельного разведениявакцины, обеспечивающая 50%-ную выживаемостьживотных) в опытной группе, получившей вместес вакциной комплекс цитокинов, увеличился в7,3 раза по сравнению с контрольной группой, иммунизированной вакциной КОКАВ без цитокинов(1:365 и 1:50, соответственно).
В табл. 2 представлены результатыэкспериментов, в которых животныхиммунизировали вакциной КОКАВв сочетании с монопрепаратамицитокинов —рчIL-1?, рчTNF?, Т? или Т?-TNF-Т?..
Как видно из табл. 2, эффективностьиммунизации животных вакцинойКОКАВ повышается в случае применения в качестве адъювантоврчIL-1? или рчTNF?. Отмечено увеличениевыживаемости экспериментальныхживотных в указанных группах. Процент выживших мышей в группе срчIL-1? при использовании вакцины вразведениях 1:25 и 1:125 был в 1,6 разавыше аналогичных показателей в контроле (45,5 % против 27,3 %; 40,0 % против 25,0 %, соответственно). В группе срчTNFa при использовании вакциныЦитокины повышают эффективность антирабической вакцины
Представлены результаты 3-х экспериментов. Показатель КР50 — величина предельного разведения вакцины, обеспечивающая 50%-ную выживаемость животных. РБН — реакция биологической нейтрализации для определения уровня вирус-нейтрализующих антител. * — р < 0,05 по отношению к контрольной группе.
в разведении 1:25 указанный показатель был в 1,7 раза выше показателя контрольной группы мышей (46,2 % и 27,3 %, соответственно).
Установлено также, что в группах животных, получавших вместе с вакциной рчТМЕа или рч1Ъ-1р, показатель КР50 увеличился в 1,2-1,8 раза по сравнению с контрольной группой, иммунизированной вакциной КОКАВ без цитокинов (1:29, 1:46 и < 1:25, соответственно). В группах животных с Та или Ta-TNF-Ta показатель КР50был на уровне контроля (< 1:25).
При оценке титров вирусейтрализующих антител в сыворотках крови экспериментальных животных установлено, что наиболее эффективными, в плане стимулирующего влияния на процесс антителообразования, были препараты рч1Ъ-1р и рчTNFa. При введении вакцины в разведении 1:25 отмечено увеличение титров АТ в 6,9 и 2,7 раза, соответственно. При использовании вакцины в разведении 1:125 в группах с рчTNFa и рч1Ъ-1р титры АТ были в 2,4-3,7 раза выше уровня контрольной группы. При большем разведении вакцины стимулирующего влияния цитокинов на формирование антигенспецифических АТ не отмечено. В группах с Ta-TNF-Ta и Та титры АТ были на уровне контроля.
Во второй серии экспериментов мышей изначально заражали фиксированным вирусом бешенства (штамм CVS), который вводили интра- церебрально (заражающая доза вируса составляла 0,6-0,9 lg LD50). Сразу после заражения мышей иммунизировали вакциной КАВ, которую вводили изолированно либо в сочетании с цитокинами. Эффективность иммунизации вакцины изучали при ее сочетанном использовании с монопрепаратами цитокинов — рч1Ъ-1р или имунофаном. Результаты исследований свидетельствуют о том, что при
Таблица 2Влияние монопрепаратов цитокинов (рчIL-1?, рчTNF?, рчТ-?1, Т?-TNF-Т?) на эффективность иммунизации животных вакциной КОКАВ
указанной схеме эксперимента введение p4lL-1? или имунофана в сочетании с вакциной КАВ после заражения экспериментальных животных вирусом бешенства практически не оказывает влияния на протективный эффект вакцины. Количество выживших животных в опытных и контрольных группах было практически одинаковым, а небольшие различия статистически недостоверны (p > 0,05). Исключение составляла группа животных, получившая рчЗЪ-l? в сочетании с вакциной КАВ в разведении 1:32, исследуемые показатели которой статистически достоверно отличались от показателей контрольной группы, иммунизированной вакциной КАВ в указанном разведении без цито- кинов (p < 0,05). Количество выживших животных в группе, вакцинированной КАВ в сочетании с рчЗЪ-l?, составляло 62,5 ± 5,0 %, в контрольной группе — 42,8 ± 4,4 %.
Ряд авторов указывает на то, что титр специфических антител в сыворотках крови людей, зараженных вирусом бешенства, является достаточно надежным показателем, предопределяющим степень их защиты [8, 9]. В то же время отмечено, что в сыворотках лиц, умерших от гидрофобии, обнаруживаются специфические антитела в титрах значительно более высоких, чем у лиц с успешным лечением [4]. В связи с этим, можно полагать, что наличие специфических антител в сыворотке крови не исключает заболевание гидрофобией, а также не меняет течения и исхода возникшего заболевания. Важнейшая особенность патогенеза заболевания заключается в том, что вирус бешенства, попав в клетки нервной системы, становится недоступным или малодоступным действию специфических антител.
Основные усилия при лечении заболевания должны быть направлены на быструю и адекватную активацию иммунокомпетентных клеток, способствующую предотвращению попадания вируса в ЦНС. С этой целью и предприняты попытки использования цитокинов для оптимизации вакцинального процесса при бешенстве. Имеются сообщения о положительном опыте использования рекомбинантных цитокинов, таких как TNFa и IL-2 в сочетании с антирабической вакциной. Профилактическое применение антирабической вакцины в комплексе с цитокинами обеспечивало протективный эффект у мышей при их последующем заражении вирусом бешенства [4, 7].
В наших исследованиях на модели профилактической иммунизации беспородных белых мышей антирабической вакциной выявлено стимулирующее действие монопрепаратов цитокинов (рчTNFa, рчIL-l?), а также комплекса цитокинов, включающего рчIL-l?, рчIL-2 и рчTNFa, на формирование специфического иммунного ответа, обеспечивающего повышение выживаемости экспериментальных животных. Отмечено также снижение дозы вакцины, обеспечивающей 50%-ную защиту животных при заражении фиксированным вирусом бешенства (показатель КР50). При иммунизации вакциной КОКАВ вместе с комплексом цитокинов (рчІЬ-ip, рчІЬ-2, рчTNFa) эффективная доза вакцины (показатель КР50) была в 7,3 раза ниже эффективной дозы вакцины, используемой без цитокинов. В случае применения вакцины в сочетании с рчTNFa или рчІЬ-ip указанный показатель был в 1,2—1,8 раза ниже по сравнению с дозой вакцины, используемой для иммунизации животных без цитокинов.
При иммунизации вакциной КОКАВ с препаратами рчTNFa или рчІЬ-ip отмечен также стимулирующий эффект на выработку специфических антител. Средние геометрические титры вирус- нейтрализующих антител были в 2,7-6,9 раза выше в случае использования вместе с вакциной КОКАВ указанных цитокинов, по сравнению с группой животных, вакцинированных без цитокинов. При использовании препаратов Ta или Ta-TNF-Ta в сочетании с вакциной КОКАВ не отмечено усиления ее протективного эффекта.
Модель предварительной иммунизации, при которой введение антирабической вакцины происходит до заражения экспериментальных животных вирусом бешенства, естественно, не соответствует тому, с чем приходится сталкиваться на практике, когда лечение начинают после укуса человека животным, подозрительным или больным бешенством. В связи с этим, было проведено изучение действия цитокинов на эффективность вакцинации беспородных белых мышей, предварительно зараженных фиксированным вирусом бешенства. Результаты исследования показали, что введение рчIL-1? или имунофана в сочетании с антирабической вакциной практически не оказывало влияния на протективный эффект вакцины. Схему проведения экспериментов не удалось приблизить к естественным условиям заражения бешенством. В опытах использован интрацеребральный путь введения вируса бешенства и подкожное введение антирабической вакцины и цитокинов, что может быть одной из причин отсутствия усиления специфического иммунного ответа при указанной аранжировке эксперимента.
Таким образом, использование цитокинов в качестве иммуноадъювантов усиливало защитный эффект вакцины КОКАВ при последующем заражении беспородных белых мышей фиксированным вирусом бешенства, штамм CVS. Стимулирующий эффект отмечен при использовании вместе с вакциной КОКАВ цитокинов рчIL-1? или рчTNF? в виде монопрепаратов, наиболее выраженный эффект наблюдали при использовании комплекса цитокинов, включающего рчIL-1?, рчIL-2 и рчTNF?..
Авдеева Ж.И., Акользина С.Е., Алпатова Н.А. и др. Оптимизация вакцинального процесса с помощью цитокинов // Russ. J. Immunol. — 1999. — Vol. 4, SuppL. 1. — P. 54.
Медуницын Н.В. Вакцинология. — М.: Триада Х, 2004. — 446 с.
Медуницын Н.В., Акользина С.Е., Авдеева Ж.И. и др. Цитокины в вакцинальном процессе // Тр. I Всеросс. конгр. патофизиол. — М., 1996. — C. 153-154.
Мовсесянц А.А. Современные проблемы лечения гидрофобии антирабичес- кими препаратами: Автореф. дисс. ... д-ра мед. наук. — М., 1993.
Симбирцев А.С. Цитокины — новая система регуляции защитных реакций организма // Цитокины и воспаление. — 2002. — Т. 1, № 1. — С. 9-17.
Шестопалов А.М., Рассадкин Ю.Н., Устинова Е.Н. и др. Влияние фактора некроза опухоли а на эффективность вакцинации против бешенства // Вопр. вирусол. — 2002. — № 3. — С. 37-40.
Aubert M.F., Blancou J., Selve M. Vaccination contre la rage: combinasion optimale des doses de vaccines injections // J. Biol. Stand. — 1985. — Vol. 13, № 1. — P. 23-30.
Blancou J., Aubert M.F., Andral L. Studies on pathogenic, immunogenic, and protective efficiency of fox rabies virus before and after adaptation to cell culture: application to vaccination against rabies // Can. J. Microbiol. — 1983. — Vol. 29, № 1. — P. 77-83.
Meuer S.C., Dumann H., Meyer zum Buschenfelde K.H., Kohler H. Low-dose interleukin-2 induces systemic immune responses against HBsAg in immunode- ficient non-responders to hepatitis B vaccination // Lancet. — 1989. — Vol. 1, № 8628. — P. 15-18.
Nunberg J.H., Doyle M.V., York S.M., York C.J. Interleukin 2 acts as an adjuvant to encrease the potency of inactivated rabies virus vaccine // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1989. — Vol. 86, № 11. — P. 4240-4243.
Playfair J.H., De Souza J.B. Recombinant gamma interferon is a potent adjuvant for a malaria vaccine in mice // Clin. Exp. Immunol. — 1987. — Vol. 67, № 1. — P. 5-10.
Quiroga J.A., Castillo I., Porres J.C. et al. Recombinant gamma interferon as adjuvant to hepatitis B vaccine in haemodialysis patients // Hepatology. — 1990. — Vol. 12, № 4, pt. 1. — P. 661-663.
Reed L.J., Muench H. A simple method for estimating fifty percent end points // Am. J. Hyg. — 1938. — Vol. 27. — P. 493-497.
Sagara T., Mori S., Ohkawara S. et al. A limited role of IL-1 immune enhancement by adjuvants // Immunology. — 1990. — Vol. 71, № 2. — P. 251-257.
Stimulating effect of recombinant human cytokines on immunogenic potency of rabies vaccine (COCAV)was studied in outbred white mice. RhIL-ip and rhTNFa each as a separate additive or a complex of cytokines including rhIL-ip, rhIL-2, rhTNFa were found to have the most pronounced stimulatory effect.These cytokines significantly increased the protective effect of cell culture rabies vaccine COCAV assayedby a level of resistance of mice to the subsequent inoculation with fixed virus of rabies (CVS strain).Injection of cytokines as adjuvants stimulated the production of virus neutralizing antibody with titers that were 2.5 to 6 times higher than in control mice immunized with COCAV alone. (Cytokines andInflammation. 2007. Vol. 6, № 2. P. 46-50.)