загрузка...
 
Действие цитокинов на протективные свойства антирабической вакцины Ж.И. Авдеева, С.Е. Акользина, Н.А. Алпатова, А.А. Мовсесянц, Н.В. Медуницын
Повернутись до змісту

Действие цитокинов на протективные свойства антирабической вакцины Ж.И. Авдеева, С.Е. Акользина, Н.А. Алпатова, А.А. Мовсесянц, Н.В. Медуницын

ФГУН Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора, Москва

В экспериментах на мышах установлено стимулирующее действие рекомбинантных человеческих цитокинов на иммуногенную активность вакцины против бешенства (КОКАВ). Наиболее выраженное действие оказывали рчИ-ip, рчТЫРа в виде монопрепаратов или комплекс цитокинов, включающийрчIL-1?, рчIL-2 и рчTNF?. Исследуемые препараты цитокинов повышали протективный эффект культуральной антирабической вакцины КОКАВ, оцениваемый по уровню резистентности беспородных белых мышей к заражению фиксированным вирусом бешенства, штамм CVS. Введение животным цитокинов в качестве адъювантов способствовало также формированию более высоких титров ви- рус-нейтрализующих антител, превышающих в 2,5-6 раза уровень титров антител в контрольных группах животных, иммунизированных одной вакциной КОКАВ. (Цитокины и воспаление. 2007. Т. 6, № 2. С. 46-50.)

Ключевые слова: цитокины, бешенство, вакцинация, иммунологические адъюванты.

История исследования роли цитокинов в раз­витии иммунного ответа насчитывает более 50 лет, тем не менее, многие вопросы, связанные с изучением роли цитокинов в развитии поствак­цинального иммунитета, остаются недостаточно изученными [2, 5, 6]. Имеются сообщения об ис­пользовании препаратов цитокинов в качестве адъювантов при введении вакцин [1, 3, 7, 10, 15]. В экспериментах на лабораторных животных отмече­на эффективность использования фактора некроза опухолей альфа(TNF?), интерлейкина 2 (IL-2) при вакцинации против бешенства и герпеса, интерфе­рона гамма (IFN?), IL-1 — при вакцинации против малярии и гепатита В [11, 12], №N7 — при вакцина­ции против гепатита В пациентов на гемодиализе [13]. Поиск средств, способствующих формированию поствакцинального иммунитета, является крайне актуальным. В частности, это касается проблемы ус­коренного формирования полноценного поствакци­нального иммунитета против бешенства после укуса больными животными до появления у пациентов клинических признаков заболевания [4, 8, 9].

Цель настоящей работы заключалась в изучении на моделях экспериментальных животных возможности использования ряда цитокинов —рчIL-1?, рчIL-2, рчTNF?, тимозина а1, гибридного белка «неотима» и имунофана в качестве адъювантов при иммунизации против бешенства.

Экспериментальные исследования по изучению адъювантных свойств цитокинов проведены на 1430 беспородных белых мы­шах массой 7-8 г и 12-14 г. Животные получены из Центрального питомника лабораторных животных РАМН «Биомодель».

В работе использованы следующие вакцины:

Культуральная антирабическая вакцина (КАВ) инактивированная сухая из штамма вируса бешенства «Внуково-32», выращенного на первичной культуре клеток почек сирийского хомяка. В опытах использованы коммерческие серии вакцины КАВ с иммуногенной активностью 2,01 МЕ, 0,54 МЕ, 1,79 МЕ и 1,0 МЕ (производство ИПВЭ РАМН им. М.П. Чумакова, Москва, и НПО «Иммунопрепарат», Уфа).

Культуральная антирабическая вакцина концентрированная и очищенная методом ультрафильтрации (КОКАВ) инактивиро- ванная сухая. В экспериментах на животных использованы ком­мерческие серии вакцины КОКАВ с иммуногенной активностью 13,80 МЕ и 5,62 МЕ (производство ИПВЭ РАМН им. М.П. Чумакова, Москва).

При внутримозговом заражении беспородных белых мышей использовали стандартный разрешающий фиксированный вирус бешенства, штамм CVS (Challenge virus standart), вводимый в объеме 0,03 мл. Заражающая доза вируса была в пределах 3,0-3,6 lg LD50 или 0,6-0,9 lg LD50 (в зависимости от схемы эксперимента).

В работе использованы следующие рекомбинантные препа­раты цитокинов человека:

интерлейкин 1 бета (рчК-1Р) (НИИ ОЧБ, Санкт-Петербург),

интерлейкин 2 (рчК-2) (ООО «Биотех», Санкт-Петербург),

фактор некроза опухолей альфа ILTNFa) (НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ «Вектор», Бердск).

Использованы также препараты:

тимозин альфа 1 человека рекомбинантный (Та) (НИИ при­кладной микробиологии, Оболенск),

гибридный белок «неотим», состоящий из рекомбинантного TNFa человека и тимозина альфа 1 (Ta-TNF-Ta) (НИИ при­кладной микробиологии, Оболенск),

имунофан (НПП «БИОНОКС», Москва).

Все указанные препараты условно объединены под термином «цитокины».

Влияние цитокинов на протективный эффект вакцинации изучали в тесте защиты иммунизированных животных одним из двух видов инактивированной культуральной антирабичес- кой вакцины (КОКАВ или КАВ) при последующем заражении их фиксированным вирусом бешенства (штамм CVS). При этом применяли две схемы вакцинации и заражения мышей.

В первой серии экспериментов цитокины и вакцину вводили мышам одновременно. После окончания вакцинации живот­ных заражали фиксированным вирусом бешенства. При этом опытным группам животных вакцину КОКАВ вводили внутри- брюшинно в разведениях 1:25, 1:125, 1:625 или 1:50, 1:500, 1:5000. Цитокины вводили внутрибрюшинно в обьеме 0,5 мл. Каждая группа, соответствующая одному из разведений вак­цины, включала по 10-15 мышей. Вакцину и цитокины вводили животным двукратно с интервалом в одну неделю. Цитокины использовали в виде монопрепаратов или в виде комплекса отдельных цитокинов (монопрепараты — рчК-1р, рчTNFa, Ta, Ta-TNF-Ta в дозе 1000 нг на 1 мышь, комплекс цитокинов состоял из рчК-1р — 10 нг, рчК-2 — 10 МЕ, рчTNFa — 10 Е на 1 мышь). Контрольным группам мышей вакцину КОКАВ вводили в тех же разведениях, что и опытным группам, но без цитокинов. На 8-й день после окончания иммунизации мышам вводили фиксированный вирус бешенства. Заражающая доза вируса при внутримозговом введении составляла 3,0-3,6 lg LD50 в объеме 0,03 мл. Наблюдение за животными проводили в течение 14 дней, отмечая гибель, начиная с 6 дня после заражения. Эффективность вакцинации при изолированном использовании вакцины КОКАВ или сочетанном ее применении с цитокинами оценивали по числу выживших животных в каждой из групп, соответствующих разведению вакцины. Определяли процент выживших живот­ных и величину предельно допустимого разведения вакцины, обеспечивающую 50 %-ную выживаемость животных после заражения вирусом бешенства (КР50), рассчитанную по методу Reed — Muench [14].

Во второй серии экспериментов опыт начинали с заражения мышей путем интрацеребрального введения фиксированного вируса бешенства в дозе 0,6-0,9 lg LD50 в обьеме 0,03 мл. Сразу после заражения опытным группам мышам начинали вводить

вакцину КАВ по 0,1 мл подкожно в сочетании с цитокинами. Инъ­екции препаратов проводили в течение пяти дней с интервалом в 24 часа. Для иммунизации использовали цельную вакцину КАВ и ее разведения 1:4, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512. Каждое разведение вакцины вводили группе животных, состоящей из 10-15 мышей. Цитокины вводили животным подкожно в объеме 0,5 мл, доза для рч11_-1р составляла 200 нг/мышь, имунофа- на — 50 нг/мышь. Контрольным группам животных вакцину КАВ вводили в те же сроки и тех же разведениях, что и опытным группам, но без цитокинов.

Как при первой, так и при второй схеме экспериментов адекватность выбранной заражающей дозы вируса оценивали путем интрацеребрального введения десятикратных разведений вирус-содержащего материала неиммунизированным беспород­ным мышам. Доза инокулята в мозг мыши составляла 0,03 мл. Результаты опытов оценивали по числу павших и выживших животных на каждое разведение препарата. Титр тест-вируса рассчитывали по методу Reed — Muench [14].

На 7-е сутки после окончания иммунизации в сыворотке крови вакцинированных животных определяли титр вирус-ней- трализующих специфических антител в реакции биологической нейтрализации (РБН) на беспородных белых мышах массой 7-8 г. Постановку реакции осуществляли, используя постоянную дозу вируса бешенства, штамм CVS (38 LD50), и 5-кратные разведения предварительно инактивированной сыворотки иммунизирован­ных мышей. Равные объемы вирус-содержащей жидкости и тести­руемой сыворотки смешивали и выдерживали при 37 оС в течение 1,5 часов. Указанную смесь после инкубации реагентов вводили в мозг животных в объеме 0,03 мл. Наблюдение за мышами про­водили в течение 14 дней, учитывая их гибель, начиная с 6-го дня после инъекции. Определяли процент выживших животных и величину титра вирус-нейтрализующих антител.

Статистическую обработку данных проводили с использо­ванием стандартного пакета статистических программ. Досто­верность уровня различия сравниваемых величин оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

В первой серии экспериментов, проводимых на беспородных белых мышах, изучали эффектив­ность вакцинации против бешенства при использо­вании вакцины КОКАВ в сочетании с цитокинами. Указанные препараты вводили мышам до их зара­жения фиксированным вирусом бешенства, штамм CVS. Результаты исследований с использованием комплекса цитокинов приведены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, использование при им­мунизации животных вакцины КОКАВ в соче­тании с комплексом цитокинов (рчIL-10, рчIL-2, рчTNFa) способствует повышению ее эффектив­ности. Отмечен больший процент выживаемости экспериментальных животных при заражении фиксированным вирусом бешенства по сравнению с контрольной группой. Процент выживших жи­вотных, иммунизированных вакциной в разведе­нии 1:50 и 1:500, в опытной группе статистически достоверно отличался от показателей контрольной группы (р < 0,05). Так, при использовании вакцины в разведении 1:50 процент выживших животных в опытной группе в 2,0 раза превышал показатели контроля (83,4 % и 40,0 %, соответственно), а при использовании вакцины в разведении 1:500 в опытной группе выжило 46,1 % мышей, тогда как в контрольной группе все животные погибли. Показатель КР50 (величина предельного разведения вакцины, обеспечивающая 50%-ную выживаемость животных) в опытной группе, получившей вместе с вакциной комплекс цитокинов, увеличился в 7,3 раза по сравнению с контрольной группой, иммунизированной вакциной КОКАВ без цитокинов (1:365 и 1:50, соответственно).

В табл. 2 представлены результаты экспериментов, в которых животных иммунизировали вакциной КОКАВ в сочетании с монопрепаратами цитокинов —рчIL-1?, рчTNF?, Т? или Т?-TNF-Т?..

Как видно из табл. 2, эффективность иммунизации животных вакциной КОКАВ повышается в случае применения в качестве адъювантов рчIL-1? или рчTNF?. Отмечено увеличение выживаемости экспериментальных животных в указанных группах. Процент выживших мышей в группе с рчIL-1? при использовании вакцины вразведениях 1:25 и 1:125 был в 1,6 раза выше аналогичных показателей в контроле (45,5 % против 27,3 %; 40,0 % против 25,0 %, соответственно). В группе с рчTNFa при использовании вакцины Цитокины повышают эффективность антирабической вакцины

Таблица 1 Влияние комплекса цитокинов (рчIL-1?, рчIL-2, рчTNF?) на эффективность иммунизации животных вакциной КОКАВ

Примечание к табл. 1 и 2.

Представлены результаты 3-х экспери­ментов. Показатель КР50 — величина предельного разведения вакцины, обеспечивающая 50%-ную выживае­мость животных. РБН — реакция био­логической нейтрализации для опреде­ления уровня вирус-нейтрализующих антител. * — р < 0,05 по отношению к контрольной группе.

в разведении 1:25 указанный показатель был в 1,7 раза выше показателя контрольной группы мышей (46,2 % и 27,3 %, соответственно).

Установлено также, что в группах животных, получавших вместе с вакциной рчТМЕа или рч1Ъ-1р, показатель КР50 увеличился в 1,2-1,8 раза по сравнению с контрольной группой, им­мунизированной вакциной КОКАВ без цитокинов (1:29, 1:46 и < 1:25, соответственно). В группах животных с Та или Ta-TNF-Ta показатель КР 50 был на уровне контроля (< 1:25).

При оценке титров вирусейтрализующих антител в сыворотках крови экспериментальных животных установлено, что наиболее эффективны­ми, в плане стимулирующего влияния на процесс антителообразования, были препараты рч1Ъ-1р и рчTNFa. При введении вакцины в разведении 1:25 отмечено увеличение титров АТ в 6,9 и 2,7 раза, соответственно. При использовании вакцины в разведении 1:125 в группах с рчTNFa и рч1Ъ-1р титры АТ были в 2,4-3,7 раза выше уровня конт­рольной группы. При большем разведении вакцины стимулирующего влияния цитокинов на форми­рование антигенспецифических АТ не отмечено. В группах с Ta-TNF-Ta и Та титры АТ были на уровне контроля.

Во второй серии экспериментов мышей из­начально заражали фиксированным вирусом бешенства (штамм CVS), который вводили интра- церебрально (заражающая доза вируса составляла 0,6-0,9 lg LD50). Сразу после заражения мышей иммунизировали вакциной КАВ, которую вводили изолированно либо в сочетании с цитокинами. Эф­фективность иммунизации вакцины изучали при ее сочетанном использовании с монопрепаратами цитокинов — рч1Ъ-1р или имунофаном. Результа­ты исследований свидетельствуют о том, что при

Таблица 2 Влияние монопрепаратов цитокинов (рчIL-1?, рчTNF?, рчТ-?1, Т?-TNF-Т?) на эффективность иммунизации животных вакциной КОКАВ

 

указанной схеме эксперимента введение p4lL-1? или имунофана в сочетании с вакциной КАВ после заражения экспериментальных животных вирусом бешенства практически не оказывает влияния на протективный эффект вакцины. Количество вы­живших животных в опытных и контрольных груп­пах было практически одинаковым, а небольшие различия статистически недостоверны (p > 0,05). Исключение составляла группа животных, по­лучившая рчЗЪ-l? в сочетании с вакциной КАВ в разведении 1:32, исследуемые показатели которой статистически достоверно отличались от показа­телей контрольной группы, иммунизированной вакциной КАВ в указанном разведении без цито- кинов (p < 0,05). Количество выживших животных в группе, вакцинированной КАВ в сочетании с рчЗЪ-l?, составляло 62,5 ± 5,0 %, в контрольной группе — 42,8 ± 4,4 %.

Ряд авторов указывает на то, что титр специ­фических антител в сыворотках крови людей, зараженных вирусом бешенства, является доста­точно надежным показателем, предопределяющим степень их защиты [8, 9]. В то же время отмечено, что в сыворотках лиц, умерших от гидрофобии, об­наруживаются специфические антитела в титрах значительно более высоких, чем у лиц с успешным лечением [4]. В связи с этим, можно полагать, что наличие специфических антител в сыворотке крови не исключает заболевание гидрофобией, а также не меняет течения и исхода возникшего заболевания. Важнейшая особенность патогенеза заболевания заключается в том, что вирус бешен­ства, попав в клетки нервной системы, становится недоступным или малодоступным действию спе­цифических антител.

Основные усилия при лечении заболевания должны быть направлены на быструю и адек­ватную активацию иммунокомпетентных клеток, способствующую предотвращению попадания вируса в ЦНС. С этой целью и предприняты попытки использования цитокинов для оптими­зации вакцинального процесса при бешенстве. Имеются сообщения о положительном опыте ис­пользования рекомбинантных цитокинов, таких как TNFa и IL-2 в сочетании с антирабической вакциной. Профилактическое применение антирабической вакцины в комплексе с цитокинами обеспечивало протективный эффект у мышей при их последующем заражении вирусом бе­шенства [4, 7].

В наших исследованиях на модели профи­лактической иммунизации беспородных белых мышей антирабической вакциной выявлено сти­мулирующее действие монопрепаратов цитокинов (рчTNFa, рчIL-l?), а также комплекса цитокинов, включающего рчIL-l?, рчIL-2 и рчTNFa, на фор­мирование специфического иммунного ответа, обеспечивающего повышение выживаемости экспериментальных животных. Отмечено также сни­жение дозы вакцины, обеспечивающей 50%-ную защиту животных при заражении фиксированным вирусом бешенства (показатель КР50). При имму­низации вакциной КОКАВ вместе с комплексом цитокинов (рчІЬ-ip, рчІЬ-2, рчTNFa) эффективная доза вакцины (показатель КР50) была в 7,3 раза ниже эффективной дозы вакцины, используемой без цитокинов. В случае применения вакцины в сочетании с рчTNFa или рчІЬ-ip указанный по­казатель был в 1,2—1,8 раза ниже по сравнению с дозой вакцины, используемой для иммунизации животных без цитокинов.

При иммунизации вакциной КОКАВ с препара­тами рчTNFa или рчІЬ-ip отмечен также стиму­лирующий эффект на выработку специфических антител. Средние геометрические титры вирус- нейтрализующих антител были в 2,7-6,9 раза выше в случае использования вместе с вакциной КОКАВ указанных цитокинов, по сравнению с группой животных, вакцинированных без цитокинов. При использовании препаратов Ta или Ta-TNF-Ta в сочетании с вакциной КОКАВ не отмечено усиле­ния ее протективного эффекта.

Модель предварительной иммунизации, при ко­торой введение антирабической вакцины происхо­дит до заражения экспериментальных животных вирусом бешенства, естественно, не соответствует тому, с чем приходится сталкиваться на практике, когда лечение начинают после укуса человека животным, подозрительным или больным бешен­ством. В связи с этим, было проведено изучение действия цитокинов на эффективность вакцина­ции беспородных белых мышей, предварительно зараженных фиксированным вирусом бешенства. Результаты исследования показали, что введение рчIL-1? или имунофана в сочетании с антирабической вакциной практически не оказывало влияния на протективный эффект вакцины. Схему про­ведения экспериментов не удалось приблизить к естественным условиям заражения бешенством. В опытах использован интрацеребральный путь введения вируса бешенства и подкожное введе­ние антирабической вакцины и цитокинов, что может быть одной из причин отсутствия усиления специфического иммунного ответа при указанной аранжировке эксперимента.

Таким образом, использование цитокинов в ка­честве иммуноадъювантов усиливало защитный эффект вакцины КОКАВ при последующем зара­жении беспородных белых мышей фиксированным вирусом бешенства, штамм CVS. Стимулирующий эффект отмечен при использовании вместе с вак­циной КОКАВ цитокинов рчIL-1? или рчTNF? в виде монопрепаратов, наиболее выраженный эффект наблюдали при использовании комплек­са цитокинов, включающего рчIL-1?, рчIL-2 и рчTNF?..

ЛИТЕРАТУРА

Авдеева Ж.И., Акользина С.Е., Алпатова Н.А. и др. Оптимизация вакциналь­ного процесса с помощью цитокинов // Russ. J. Immunol. — 1999. — Vol. 4, SuppL. 1. — P. 54.

Медуницын Н.В. Вакцинология. — М.: Триада Х, 2004. — 446 с.

Медуницын Н.В., Акользина С.Е., Авдеева Ж.И. и др. Цитокины в вакци­нальном процессе // Тр. I Всеросс. конгр. патофизиол. — М., 1996. — C. 153-154.

Мовсесянц А.А. Современные проблемы лечения гидрофобии антирабичес- кими препаратами: Автореф. дисс. ... д-ра мед. наук. — М., 1993.

Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев А.А. Эндогенные иммуномодуля- торы. — СПб.: Гиппократ, 1992. — 256 с.

Симбирцев А.С. Цитокины — новая система регуляции защитных реакций организма // Цитокины и воспаление. — 2002. — Т. 1, № 1. — С. 9-17.

Шестопалов А.М., Рассадкин Ю.Н., Устинова Е.Н. и др. Влияние фактора не­кроза опухоли а на эффективность вакцинации против бешенства // Вопр. вирусол. — 2002. — № 3. — С. 37-40.

Aubert M.F., Blancou J., Selve M. Vaccination contre la rage: combinasion optimale des doses de vaccines injections // J. Biol. Stand. — 1985. — Vol. 13, № 1. — P. 23-30.

Blancou J., Aubert M.F., Andral L. Studies on pathogenic, immunogenic, and pro­tective efficiency of fox rabies virus before and after adaptation to cell culture: application to vaccination against rabies // Can. J. Microbiol. — 1983. — Vol. 29, № 1. — P. 77-83.

Meuer S.C., Dumann H., Meyer zum Buschenfelde K.H., Kohler H. Low-dose interleukin-2 induces systemic immune responses against HBsAg in immunode- ficient non-responders to hepatitis B vaccination // Lancet. — 1989. — Vol. 1, № 8628. — P. 15-18.

Nunberg J.H., Doyle M.V., York S.M., York C.J. Interleukin 2 acts as an adjuvant to encrease the potency of inactivated rabies virus vaccine // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1989. — Vol. 86, № 11. — P. 4240-4243.

Playfair J.H., De Souza J.B. Recombinant gamma interferon is a potent adjuvant for a malaria vaccine in mice // Clin. Exp. Immunol. — 1987. — Vol. 67, № 1. — P. 5-10.

Quiroga J.A., Castillo I., Porres J.C. et al. Recombinant gamma interferon as adjuvant to hepatitis B vaccine in haemodialysis patients // Hepatology. — 1990. — Vol. 12, № 4, pt. 1. — P. 661-663.

Reed L.J., Muench H. A simple method for estimating fifty percent end points // Am. J. Hyg. — 1938. — Vol. 27. — P. 493-497.

Sagara T., Mori S., Ohkawara S. et al. A limited role of IL-1 immune enhancement by adjuvants // Immunology. — 1990. — Vol. 71, № 2. — P. 251-257.

Effect of cytokines on the protective properties of rabies vaccine Zh.I. Avdeeva, S.E. Akol'zina, N.A. Alpatova, A.A. Movsesiants, N.V. Medunitsyn L.A. Tarasevich State Research Institute for Standardization and Control of Medical Biological Preparations, Moscow

Stimulating effect of recombinant human cytokines on immunogenic potency of rabies vaccine (COCAV) was studied in outbred white mice. RhIL-ip and rhTNFa each as a separate additive or a complex of cytokines including rhIL-ip, rhIL-2, rhTNFa were found to have the most pronounced stimulatory effect. These cytokines significantly increased the protective effect of cell culture rabies vaccine COCAV assayed by a level of resistance of mice to the subsequent inoculation with fixed virus of rabies (CVS strain). Injection of cytokines as adjuvants stimulated the production of virus neutralizing antibody with titers that were 2.5 to 6 times higher than in control mice immunized with COCAV alone. (Cytokines and Inflammation. 2007. Vol. 6, № 2. P. 46-50.)

Key words: cytokines, rabies, vaccination, immunological adjuvants.



загрузка...