загрузка...
 
Изучение влияния Бестима (SCV-07) на дифференцировку Т-лимфоцитов у мышей А.В. Петров, Н.В. Пигарева, А.Ю. Котов, А.А. Колобов, А.С. Симбирцев
Повернутись до змісту

Изучение влияния Бестима (SCV-07) на дифференцировку Т-лимфоцитов у мышей А.В. Петров, Н.В. Пигарева, А.Ю. Котов, А.А. Колобов, А.С. Симбирцев

ФГУП «ГосНИИ особо чистых биопрепаратов» ФМБА России, Санкт-Петербург

Бестим — новый иммуномодулирующий препарат, используемый для терапии вторичных иммунодефицитов. В данной работе показано, что после введения Бестима у мышей наблюдается стимуляция лимфопоэза, что проявляется увеличением доли c-kit+- и Thy1+

-клеток в костном мозге, изменением субпопуляционного состава и функциональной активности тимоцитов. Также увеличивается митогениндуцированная продукция IL-2 и IFN? спленоцитами при неизменной или сниженной продукции IL-4, что свидетельствует о поляризации иммунного ответа в направлении Т-хелперов 1-го типа. При пероральном введении Бестим полностью сохраняет свою иммуномодулирующую активность. В

целом полученные данные указывают, что Бестим является перспективным препаратом для терапии широкого круга заболеваний, сопровождающихся дефицитом Т-клеточного звена, а также связанных с нарушением баланса Th1/Th2. (Цитокины и воспаление. 2007. Т. 6, № 3. С. 27–31.)

Ключевые слова: Бестим, Т-лимфоциты, дифференцировка, цитокины. Бестим (?-D-глутамIL-L-триптофан) — иммуномодулятор пептидной природы, разработанный в ГосНИИ особо чистых биопрепаратов (Санкт-Петербург). Открытие препарата стало результатом масштабного исследования активности синтетических аналогов глутамIL-триптофана с атипичными пептидными связями и/или содержащих D-аминокислоты. В ряду подобных веществ Бестим проявлял наибольшую активность в тестах in vitro — увеличивал экспрессию маркера Thy1 на клетках костного мозга и усиливал конканавалин А (КонА)-индуцированную продукцию IL-2 спленоцитами мыши. Эти же активности наблюдались также при введении препарата in vivo. В дополнение к усилению продукции IL-2 введение Бестима мышам приводило к повышению митоген-индуцированной продукции спленоцитами интерферона (IFN)  ? при неизменной или сниженной продукции IL-4. Данное обстоятельство показывает влияние препарата на поляризацию Т-хелперов в направлении Т-хелперов первого типа (Th1) [3].Бестим характеризуется практически полным отсутствием токсичности. Опыт клинического применения Бестима продемонстрировал клинико-иммунологическую эффективность этого препарата в комплексной терапии различных форм патологии, таких как хламидийная инфекция и туберкулез [2, 4], а также для повышения эффективности вакцинации [1]. Таким образом, Бестим является перспективным иммуномодулятором, терапевтическая активность которого исследуется в настоящее время в нескольких контролируемых клинических испытаниях. В то же время представления о действии препарата на различные этапы созревания Т-лимфоцитов недостаточно полны.В настоящей работе представлены результаты глубокого изучения влияния препарата Бестим на лимфопоэз и поляризацию иммунного ответа у мышей при парентеральном и пероральном введениях. Результаты имеют существенное значение для понимания особенностей действия данного иммуномодулятора и создают предпосылки для использования Бестима при более широком круге заболеваний.

Материалы и методы

В работе использовались мыши (CBAЧC57Bl/6)F1 (Питомник лабораторных животных «Рапполово»), а также беспатогенные мыши линии BALB/c и аутбредные мыши Swiss Webster (Питомник лабораторных животных «Пущино»). Ампулированный препарат Бестим (ООО «НПФ Верта») вводили животным внутрибрюшинно (в/б) в дозах 0,1 и 1,0 мкг/кг в 200 мкл стерильного физиологического раствора (ФР) или перорально (п/о) в тех же дозах с помощью пищеводного зонда ежедневно в течение 3 дней. Контрольным животным вводили 200 мкл ФР в/б или п/о. В каждой группе было не менее 5 животных. Анализ иммунно го ответа проводили, если не указано иначе, через 72 часа после последнего введения. Клетки тимуса и селезенки выделяли стерильно. Тимоциты (1 ?  106 клеток на лунку) и спленоциты (5 ?  105 клеток на лунку) в 4-х параллелях стимулировали в присутствии конканавалина А (КонА) (Sigma) в среде RPMI-1640 с 10 % или 2 % телячьей эмбриональной сыворотки (Sigma), соответственно, в 96-луночных плоскодонных культуральных платах (Costar) в течение 72 часов в CO2-инкубаторе при 37 °С в условиях абсолютной влажности. Интенсивность пролиферации оценивали по включению 3  Н-тимидина и выражали числом импульсов в минуту (имп/мин).Для оценки КонА-индуцированной продукции цитокинов в культурах тимоцитов и спленоцитов клетки в концентрации 1 ?  106/мл стимулировали различными дозами КонА, супернатанты собирали через 24 часа и определяли содержание IL-4 и интерферона гамма (IFN?) с помощью твердофазного ИФА на основе реагентов EIA Expansion Kits (BD Biosciences Pharmingen) по инструкции изготовителя. Кроме того, биологическую активность IL-2 в супернатантах определяли с помощью биологического теста с IL-2-зависимой линией клеток CTLL-2.Экспрессию антигенов CD3, CD4, CD8, CD90.1 (Thy1) и CD117 (c-kit) на клетках периферической крови, тимуса, селезенки и костного мозга определяли с помощью проточной цитофлюориметрии на цитофлюориметре EPICS XL (Beckman Coulter) послеокраски соответствующими флюоресцеин- или фикоэритрин-меченными моноклональными антителами (Caltag) по инструкции изготовителя. Гейт (окно) популяции клеток устанавливали на основе комбинации прямого и бокового светорассеяния. При учете результатов подсчитывали 10000 клеток в гейте. Статистическую обработку данных цитометрии проводили с использованием программного пакета WinMDI 2.8.Статистическую обработку результатов проводили с использованием двустороннего теста Стьюдента. Взаимосвязь параметров оценивали с помощью критерия Спирмена. Отличия считали достоверными при р < 0,05.Результаты и обсуждениеДля оценки влияния Бестима на костномозговую стадию лимфопоэза мы изучили экспрессию на клетках красного костного мозга (ККМ) молекулы Thy1, которая является маркером ранних предшественников Т-лимфоцитов, а также молекулы c-kit (CD117), рецептора фактора роста стволовых клеток, которая у мышей экспрессируется на стволовых гемопоэтических клетках и плюрипотентных предшественниках лимфопоэза. Увеличение процента Thy1+-клеток в ККМ через трое суток после курсового введения Бестима наблюдалось у мышей всех использованных линий (рис. 1б), а при введении препарата животным, свободным от специфических патогенов, уже через сутки после курсового введения было зарегистрировано небольшое, но достоверное увеличение также и доли c-kit-положительных клеток (рис. 1а).Далее нами было подробно изучено влияние введения Бестима на функциональную активность и субпопуляционный состав клеток тимуса. Было выявлено, что после введения Бестима тимоциты мышей более интенсивно пролиферируют в ответ на КонА, а также продуцируют больше IL-2 при стимуляции митогеном (рис. 2а и 2б). Данные эффекты были очень хорошо воспроизводимыми на мышах различных линий и наблюдались как при внутрибрюшинном, так и при пероральном введениях. В то же время достоверные воспроизводимые изменения субпопуляционного состава тимоцитов были получены только при использовании беспатогенных мышей. Было выявлено снижение процента «двойных позитивных» (CD4+CD8+) клеток на 10–25 % и увеличение на 5–10 % «двойных негативных» и CD4–CD8+-тимоцитов и на 10–15 %CD4+CD8–-тимоцитов (рис. 2в). При пероральном введении Бестима беспатогенным мышам также наблюдались подобные изменения (данные не представлены). При этом интенсивность пролиферативного ответа на КонА положительно коррелировала с процентом зрелых форм тимоцитов (CD4+CD8–,  r = 0,764,  p = 0,0002)  и  отрицательно — с процентом «двойных положительных» клеток  (r = – 0,759,  p = 0,0003).  Таким  образом, полученные данные указывают на то, что повышение функциональной активности тимоцитов после введения Бестима связано с изменением их субпопуляционного состава.Несмотря на многочисленные попытки выявить воспроизводимые изменения количества или процента CD3+CD4+- или CD3+CD8+-лимфоцитов в селезенке или периферической крови у интактных мышей после введения Бестима нам не удалось (данные не представлены).При изучении митоген-индуцированной продукции цитокинов клетками селезенки мышей после введения Бестима выявлено усиление продукции IL-2. В значительном числе экспериментов также было зафиксировано увеличение продукции IFN? (преимущественно на фоне стимуляции субоптимальной дозой КонА). При этом уровень IL-4 оставался неизменным или снижался (преимущественно на фоне стимуляции максимальной дозой КонА) (таблица), что свидетельствует о преимущественной поляризации Т-клеточного ответа в направлении Т-хелперов 1-го типа. Пероральное введение Бестима приводило, в целом, к идентичным изменениям КонА-индуцированной продукции спленоцитами данных цитокинов (см. таблицу).

Созревание Т-лимфоцитов от стволовой клетки костного мозга до зрелых эффекторов — слож- ный, длительный, многоступенчатый процесс. Наиболее ранним признаком его стимуляции после введения Бестима является увеличение доли c-kit+-клеток в костном мозге (см. рис. 1а). У мышей эта молекула экспрессируется на CD34-положительных стволовых гемопоэтических клетках, а также на других субпопуляциях ранних предшественников как Т-, так и В-лимфоцитов [7]. Однако наблюдавшееся нами увеличение количества Thy1+-клеток в костном мозге все же свидетельствует о преимущественной стимуляции Бестимом Т-клеточного ростка (см. рис. 1б). Последующие этапы созревания лимфоцитов происходят в тимусе, куда мигрируют Thy1+CD4–CD8–-предшественники из костного мозга. В процессе дифференцировки тимоцитов в этих клетках вначале происходит реаранжировка ?-цепи Т-клеточного рецептора и экспрессия ее на поверхности клеток в комплексе с инвариантной цепью рТ?. Далее клетки приобретают фенотип CD4+CD8+ и вступают во второй этап селекции, когда реаранжируется ?-цепь. Затем на поверхности тимоцита остается либо CD4-, либо CD8-молекула, и клетка приобретает фенотип зрелого хелперного (CD4+) или цитотоксического (CD8+) лимфоцита [8].Поскольку описанные нами изменения субпопуляционного состава тимоцитов после введения Бестима не сопровождались достоверными изменениями клеточности тимуса, мы полагаем, что введение препарата приводит, во-первых, к увеличению притока ранних предшественников тимоцитов из костного мозга в тимус (увеличение популяции CD4–CD8–-клеток) и, во-вторых, — к ускорению созревания промежуточных форм (CD4+CD8+) в зрелые CD4+- и CD8+-лимфоциты (см. рис. 2в). При этом увеличение доли зрелых форм тимоцитов сопровождается и усилением митоген-индуцированной пролиферации и продукции IL-2 (см. рис. 2а и 2б). Следует отметить, что при неспецифической активации тимоцитов in vitro не только зрелые формы являются продуцентами цитокинов. IL-2, IL-4 и некоторые другие цитокины могут синтезироваться также и «двойными отрицательными» предшественниками, однако физиологическая роль этого явления остается не вполне ясной [5, 10].

Как уже отмечалось выше, достоверные изменения субпопуляционного состава Т-лимфоцитов на периферии после введения Бестима интактным животным отсутствуют, что свидетельствует о том, что введение препарата не приводит к выраженным количественным изменениям субпопуляций периферических Т-клеток в отсутствие патологических изменений в организме.В то же время после введения исследуемого препарата отмечались выраженные изменения функциональной активности спленоцитов, которые отчасти наблюдались и ранее [3].

Таблица 1 Конканавалин А-индуцированная продукция цитокинов клетками селезенки животных после введения Бестима

 

Примечание.   Приведены средние величины ± стандартные отклонения.* — p < 0,05 по сравнению с контрольной группой.

 

а) процент клеток костного мозга, экспрессирующих CD117;24 часа после трехкратного введения Бестима

 

Рис. 1. Экспрессия маркеров CD117 и Thy1 на клетках костного мозга мышей после введения Бестима (беспатогенные мыши Swiss Webster)

б) процент клеток костного мозга, экспрессирующих Thy1;72 часа после трехкратного введения Бестима

** — p < 0,01 по сравнению с контрольной группой

 

а) КонА-индуцированная пролиферация тимоцитов (КонА, 0,5 мкг/мл)

 

Рис. 2. Изменения функциональной активности и субпопуляционного состава тимоцитов после введения Бестима. Беспатогенные мыши, 72 часа после трехкратного введения препарата

в) Цитофлюориметрический анализ экспрессии CD4 и CD8 на тимоцитах Данные представлены в виде: среднее ± стандартное отклонение процента клеток, экспрессирующих соответствующие маркеры; * — р < 0,05 по сравнению с контрольной группой

Выраженная стимуляция продукции IL-2, разнонаправленные изменения продукции IFN? и IL-4 с увеличением первого при тенденции к снижению второго указывают на преимущественную активацию Т-хелперов 1-го типа. Небольшие различия, наблюдавшиеся при использовании разных доз митогена (так, при активации малыми дозами наблюдалось усиление продукции IFN? при неизменном уровне IL-4, а при использовании больших доз — незначительное увеличении продукции IFN? на фоне достоверного снижения синтеза IL-4), вероятно, указывают на то, что при различном исходном уровне соотношения Th1/Th2 действие Бестима может проявляться либо в выраженной стимуляции Т-хелперов 1-го типа, либо преимущественном подавлении активации Т-хелперов 2-го типа. Данное обстоятельство позволяет предположить, что Бестим может быть эффективен не только в ситуациях, при которых наблюдается Т-клеточный иммунодефицит с недостаточной активацией Th1 (например, туберкулезная инфекция), но и при Th2-опосредованной патологии, в частности, при аллергических заболеваниях.Учитывая временные интервалы, когда были зафиксированы изменения как в тимусе, так и в продукции цитокинов спленоцитами, следует предполагать, что Бестим оказывает действие как клетки, находящиеся в промежуточных стадиях созревания, так и на зрелые Т-лимфоциты на периферии.Все описанные эффекты Бестима наблюдались как при парентеральном (внутрибрюшинном), так и при пероральном введении препарата. Диапазон доз, при которых наблюдались максимальные эффекты, был одинаков для двух путей введения и составлял 0,1–1,0 мкг/кг. Подобные наблюдения являются весьма необычными, поскольку пептидные препараты, как правило, достаточно нестабильны в агрессивной среде желудочно-кишечного тракта. Тем не менее, прямое измерение уровней Бестима в сыворотке мышей после различных введений подтвердило факт поступления данного препарата в системный кровоток мышей после перорального введения, а анализ биодоступности позволил оценить значение данного параметра при в/б и п/о введениях как 55–60 % [6]. Открытые в последние годы физиологические механизмы активного транспорта коротких (двух- и трехчленных) пептидов в кишечнике [9], вероятнее всего, обеспечивают и всасывание Бестима. Таким образом, Бестим является первым иммуномодулятором на основе коротких пептидов, который может быть использован перорально. Впрочем, необходимо проведение дополнительных исследований для уточнения биодоступности данного препарата при введении per os у человека.

Выводы

1. Введение Бестима мышам вызывает активацию лимфопоэза, что проявляется увеличеним доли c-kit+- и Thy1+-клеток в костном мозге, а также изменением субпопуляционного состава и увеличением функциональной активности тимоцитов.

2. Изменения митоген-индуцированной продукции цитокинов спленоцитами мышей после введения Бестима указывают на сдвиг баланса Т-хелперов в направлении Th1.

3. При пероральном введении Бестим полностью сохраняет спектр иммуномодулирующих свойств.

Работа выполнена при поддержке гранта МНТЦ № 2788

 ЛИТЕРАТУРА

1.  Абрамова Н.Н. Влияние Бестима и Беталейкина на эффективность вакцинации против вирусного гепатита В: Дисс. … канд. мед. наук. — Челябинск, 2005.

2.  Васильева Г.Ю., Баласанянц Г.С., Сахарова И.Я. Эффективность различных доз препарата Бестим у больных инфильтративным туберкулезом легких // Матер. VII Росс. съезда фтизиатров 3–5 июня 2003 г. — М., С.27-29.

3. Пигарева Н.В. Изучение иммуномодулирующего действия синтетического дипептида  ?-D-глутаминил-L-триптофана (Бестима): Дисс. … канд. мед. наук. — СПб., 2000.

4. Позняк А.Л., Лобзин Ю.В., Симбирцев А.С., Смирнов М.Н. Принципы рациональной иммунотерапии больных генерализованными формами хламидийной инфекции у лиц молодого возраста // Terra Medica. — 2000. — № 2. — С. 5–10.

5.  Fischer M., MacNeil I., Suda T. et al. Cytokine production by mature and immature thymocytes // J. Immunol. — 1991. — Vol. 146, № 10. — P. 3452–3256. 6. Kolobov A., Petrov A., Trofimov A. et al. Pharmacokinetic study of gamma-D-glu-taminyl-L-tryptophan // J. Pept. Sci. — 2006. — Vol. 12, S1. — P. 578.

7. Pelayo R., Welner R., Perry S.S. et al. Lymphoid progenitors and primary routes to becoming cells of the immune system // Curr. Opin. Immunol. — 2005. — Vol. 17, № 2. — P. 100–107.

8. Saito T., Watanabe N. Positive and negative thymocyte selection // Crit. Rev. Immunol. — 1998. — Vol. 18, № 4. — P. 359–370.

9.  Steffansen B., Nielsen C.U., Frokjaer S. Delivery aspects of small peptides and substrates for peptide transporters // Eur. J. Pharm. Biopharm. — 2005. — Vol. 60, № 2. — P. 241–245.

10. Zlotnik A., Godfrey D.I., Fischer M., Suda T. Cytokine production by mature and immature CD4-CD8- T cells. Alpha beta-T cell receptor+ CD4-CD8- T cells produce IL-4 // J. Immunol. — 1992. — Vol. 149, № 4. — P. 1211–1215.

The influence of Bestim (SCV-07) on T-cell differentiation in mice A.V. Petrov, N.V. Pigareva, A.Yu. Kotov, A.A. Kolobov, A.S. Simbirtsev

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations, St. PetersburgSCV-07 is a novel immunomodulatory drug used for treatment of secondary immune deficiencies. Here we provide data which show that in mice SCV-07 stimulates lymphopoesis, increase of c-kit+ and Thy1+ cells in the bone marrow, and causes changes in subpopulations of thymocytes accompanied by increased proliferation capacity and cytokine production by these cells. Administration of SCV-07 also increases IL-2 and IFN? production by mitogen stimulated spleen cells while IL-4 production remains unchanged or is reduced indicating a shift of the immune response towards Th1 phenotype. When administered per os SCV-07 completely retains its immunomodulatory activity. Together these data suggest that SCV-07 is a promising drug for treatment of numerous diseases which are accompanied by T cell deficiency or mediated by impaired Th1/Th2 balance. (Cytokines and Inflammation. 2007. Vol. 6, № 3. P. 27–31.)

Key words: SCV-07, T lymphocyte, differentiation, cytokines.



загрузка...