Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов с бронхиальной астмой в республике Башкортостан А.С. Карунас, А.Р. Измайлова, Ш.З. Загидуллин, Э.К. Хуснутдинова
Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов с бронхиальной астмой в республике Башкортостан А.С. Карунас, А.Р. Измайлова, Ш.З. Загидуллин, Э.К. Хуснутдинова
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН;
Башкирский государственный медицинский университет, г. Уфа
Бронхиальная астма (БА) — распространенное хроническое заболевание дыхательных путей, развитие которого определяется взаимодействием генетических и средовых факторов. Цитокины играют важную роль в развитии и поддержании аллергического воспаления дыхательных путей при БА. В работе представлены результаты анализа ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов и их рецепторов (IL-4, ?-цепи рецептора IL-4 и IL-10) с БА в республике Башкортостан (РБ). Материалом для исследования послужили образцы ДНК 156 больных БА и 169 здоровых доноров, проживающих в РБ. Геномную ДНК выделяли из периферической крови фенольно-хлороформной экстракцией. Амплификацию локусов проводили с помощью ПЦР; генотипирование изучаемых полиморфизмов проводили методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Обнаружена ассоциация аллеля IL4*Т промоторного полиморфизма гена IL-4 (– 590C > Т) с БА у татар, а также ассоциация генотипа IL4*Т/*Т с выраженным нарушением вентиляционной функции легких. Выявлена ассоциация IL4RA*Ile50/*Ile50 генотипа Ile50Val полиморфизма гена ?-цепи рецептора IL-4 с БА у русских и ассоциация данного генотипа с тяжестью течения заболевания. Показано отсутствие ассоциации полиморфных вариантов Gln576Arg гена IL4RА и – 627С > А гена IL-10 с бронхиальной астмой в РБ. (Цитокины и воспаление. 2007. Т. 6, № 4. С. 22–28.)
Бронхиальная астма (БА) — одно из наиболее распространенных многофакторных хронических воспалительных заболеваний дыхательных путей, представляющих серьезную проблему как для детей, так и для взрослых [1] . Высокая распространенность и неуклонный рост в последние годы данной патологии определяют важное социально-экономическое и медицинское значение этой проблемы, необходимость исследования механизмов развития заболевания с целью разработки эффективных методов диагностики, профилактики и патогенетической терапии с учетом этнической принадлежности и генетических особенностей каждого больного. В настоящее время известно более 100 генов, функция белковых продуктов которых тесно связана с развитием БА [12]. Проведено более двадцати полногеномных скринингов, в результате которых подтверждено сцепление БА с локусами, в которых локализованы гены-кандидаты данного заболевания (5q31.1–33, 6p12–21.2, 11q12–13, 12q14–24.1, 16p12.1–11.2, Xq28/Yq12), выявлен целый ряд других ДНК-локусов, сцепленных с БА [12]. Среди значительного количества генов-кандидатов БА особое место занимают гены цитокинов, участвующих в развитии и поддержании аллергических реакций и воспаления дыхательных путей. Как и при многих других воспалительных заболеваниях, при БА наблюдается дисбаланс противо- и провоспалительных цитокинов в пользу последних, что может приводить к нарушению адекватного течения воспалительного ответа. Целью исследования явилось изучение ассоциации полиморфных вариантов генов интерлейкина 4 (– 590С > Т), ?-цепи рецептора интерлейкина 4 (Ile50Val, Gln576Arg) и интерлейкина 10 (– 627С > А) с БА в Республике Башкортостан (РБ).
Материалы и методы
Материалом для исследования служили образцы ДНК больныхс БА, проживающих в РБ. Обследованный контингент представлен 156 больными БА различной этнической принадлежности(60 русских, 33 татарина, 16 башкир и 47 пациентов метисного происхождения). Средний возраст больных составил 46,5 года. Диагноз заболевания устанавливался согласно положению: «Бронхиальная астма. Руководство для врачей России (формулярная система)» на основании данных клинического и лабораторного обследования, данных спирографии, рентгенографии, кожных аллергологических проб. В качестве контроля в исследовании участвовала группа здоровых доноров, представленная жителями РБ русской (58 человек), татарской (61 человек) и башкирской (50 человек) этнической принадлежности. ДНК выделяли из периферической крови методом фенольнохлороформной экстракции [8]. Амплификацию изученных локусов проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК на амплификаторе «Терцик» производства компании «ДНК-технология» (г. Москва). Для амплификации использовали реакционную смесь объемом 25 мкл, которая содержала 2,5 мкл 10 ? Taq-буфера (67 мМ трис-HCl (pH 8,8), 16,6 мМ (NH4)2SO4 1,5 мМ MgCl2, 0,01 % Тween-20), 0,1 мкг геномной ДНК, смесь dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP, по 200 мкМ каждого), 1 ЕД ДНК-полимеразы Termus aquaticus («Cилекс», г. Москва) и 5–10 пМ локусспецифичных олигонуклеотидных праймеров. Перечень исследуемых локусов, последовательности праймеров, размеры амплифицируемых фрагментов представлены в табл. 1. Для определения нуклеотидных замен методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов проводили гидролиз амплифицированных фрагментов соответствующей рестриктазой (см. табл. 1). Результаты ПДРФ-анализа оценивали путем проведения вертикального электрофореза в 7 %-ном полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием и визуализацией в проходящем ультрафиолетовом свете. Cтатистическую обработку результатов исследования проводили с использованием программ Statistica 6.0 [14] Microsoft Exсel.
Результаты и обсуждение
Интерлейкин 4 (IL-4) является ключевым цитокином в развитии аллергического воспаления. IL-4 участвует в дифференцировке Т-хелперов: индуцирует дифференцировку CD4 Т-лимфоцитов в Т-хелперы второго типа и подавляет развитие T-хелперов первого типа; стимулирует пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцитов. При взаимодействии со своим рецептором на поверхности В-лимфоцитов он переключает их на синтез IgE [15]. Ген интерлейкина 4 локализован в области 5q31–34, с которой было неоднократно показано сцепление БА и ассоциированных с ней признаков [5, 7]. В американской, японской и европейских популяциях обнаружена ассоциация БА с полиморфными вариантами гена IL4 [2, 10]. Проведен анализ промоторного полиморфизма гена IL4 (– 590С > Т) у пациентов c БА и здоровых доноров из РБ, результаты которого представлены в табл. 2. Выявлены достоверные различия в распределении частот аллелей и генотипов данного локуса между здоровыми донорами татарской и русской этнической принадлежности (?2 = 8,65, р = 0,009), татарами и башкирами (?2 = 9,33, р = 0,008). Преобладающим во всех группах был аллель IL4*С, присутствовавший у татар с более высокой частотой (82,79 %), чем у русских (67,24 %) и башкир (65 %). По литературным данным, в изученных европеоидных популяциях также чаще встречался аллель IL4*С (70–82 %), тогда как в монголоидных и афро-американских — аллель IL4*Т (54–70 %) [2, 4, 10]. Частота генотипа IL4*С/*С у татар (67,21 %) была значительно выше, чем у русских (41,38 %) и башкир (44 %). У башкир отмечалась более высокая частота генотипа IL4*Т/*Т (14 %) по сравнению с 1,64 % у татар и 6,9 % у русских. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов между объединенными выборками больных БА и здоровыми донорами не выявил достоверных различий. При разделении исследуемых групп по этнической принадлежности значимые отличия
Таблица 1 Тип полиморфизма, последовательности праймеров и номенклатура аллелей анализируемых ДНК-локусов
Таблица 2 Распределение частот аллелей и генотипов (– 590С > Т) полиморфизма гена IL4 у больных БА и здоровых доноров
были обнаружены между больными БА и здоровыми донорами татарской этнической принадлежности (?2 = 4,8; р = 0,05): у больных БА была достоверно выше частота аллеля IL4*Т (30,3 % по сравнению с 17,21 % в контрольной группе, ?2 = 2,09, р = 0,038). Для оценки риска развития заболевания использовалась таблица сопряженности 2?2 с вычислением статистик связи (с поправкой Йейтса). Относительный риск для больных БА, носителей аллеля IL4*Т, составил 2,09 (CI95 % 1,03–4,23). Кроме того, выявлена тенденция увеличения у больных частоты генотипов IL4*Т/*Т (9,09 % по сравнению с 1,64 % в контроле) и IL4*С/*Т (42,42 % по сравнению с 31,15 %). Генотип IL4*С/*С среди больных БА опре делялся гораздо реже (в 48,48 % случаев), чем в контрольной группе (67,21 %). OR = 0,46 (0,18–1,09), ?2 = 3,15, р = 0,076. При сравнении распределения частот аллелей и генотипов данного локуса в зависимости от степени тяжести заболевания не выявлено значимых отличий между больными со средней и тяжелой формами БА из РБ. Ранее рядом авторов было установлено влияние данного полиморфного варианта на тяжесть течения БА, в частности, уменьшение объема форсированного экспираторного выдоха было ассоциировано с – 590*Т аллелем и – 590*Т/*Т генотипом [4, 13]. Проведен анализ ассоциации полиморфных вариантов этого локуса со степенью выраженности нарушения дыхания по одному из основных показателей вентиляционной функции легких — объему форсированного выдоха (ОФВ), по данным спирографии (см. табл. 2). Установлено, что у больных с ОФВ 20–39 % от должных величин частота генотипа IL4*С/*Т была значительно выше и составляла 52,94 % по сравнению с 21,05 % у пациентов с ОФВ 80 % и выше (?2 = 3,88, р = 0,049). Таким образом, в результате проведенного исследования промоторного полиморфизма гена IL4 (– 590С > Т) обнаружена ассоциация аллеля IL4*Т с БА у татар, а также ассоциация генотипа IL4*С/*Т с выраженным нарушением вентиляционной функции легких.IL-4 осуществляет свои функции, взаимодействуя с клетками-мишенями через специфическиерецепторы, расположенные на их поверхности. Рецептор IL-4 состоит из 2-х цепей: альфа и гамма. Наиболее функционально значимой для стимуляции выработки иммуноглобулина Е является ?-цепь. Ген, кодирующий данную субъединицу (IL-4R?), локализован на коротком плече 16 хромосомы в области 16р12.1 [7]. В различных популяциях разные аллели и гаплотипы полиморфных локусов гена IL4RA ассоциированы с БА [11].Проведенное исследование Ile50Val полиморфизма гена IL4RA не выявило достоверных отличий между объединенными выборками больных БА и здоровых доноров из РБ (табл. 3). При сравнительном анализе распределения частот аллелей и генотипов в контрольных группах русских, татар и башкир, выраженные отличия были обнаружены между русскими и татарами (?2 = 4,64, р = 0,09). Наиболее распространенный во всех группах аллель IL4RA*Ile50 у русских встречался реже (на 53,45 % хромосом), чем у татар (63,93 %) и башкир (58 %). Частота гомозигот по этому аллелю у русских была также значительно ниже (24,14 %), чем у татар (42,62 %) и башкир (38 %). У русских с более высокой частотой определялся гетерозиготный генотип — в 58,62 % случаев по сравнению с 42,62 % у татар и 40 % у башкир. При попарном сравнении частот генотипов этого полиморфного локуса между больными и здоровыми донорами, согласно их этнической принадлежности, выраженные отличия были обнаружены у русских. У больных БА частота генотипа IL4RA*Ile50/*Ile50 была выше (40 %), чем в соответствующей контрольной группе русских (24,14 %). OR = 2,1 (0,95–4,63), ?2 = 3,4, p = 0,056. Кроме того, более высокая частота встречаемости генотипа IL4RA*Ile50/*Ile50 была обнаружена у больных с тяжелой формой БА (42,19 %), чем у больных со средне-тяжелой формой заболевания (30,43 %). У больных русской этнической принадлежности с тяжелым течением БА частота генотипа IL4RA*Ile50/*Ile50 составила 46,15 % по сравнению с 35,29 % у больных со среднетяжелым течением заболевания и 24,14 % в контрольной группе соответствующего происхождения. Относительный риск развития тяжелой формы БА
Таблица 3 Распределение частот аллелей и генотипов Ile50Val полиморфизма гена IL4RA у больных БА и здоровых доноров
у русских составил 2,69 (1,01–7,16), ?2 = 2,69, p = 0,043. Для уточнения полученных данных об ассоциации генотипа IL4RA*Ile50/*Ile50 с тяжестью течения заболевания, проведен анализ сравнения распределения частот аллелей и генотипов этого полиморфного локуса с ОФВ. Выявлена статистически значимая зависимость между частотой встречаемости генотипа IL4RA*Ile50/*Ile50 и показателями ОФВ: у больных БА с низкими значениями ОФВ (20–39 %) генотип IL4RA*Ile50/*Ile50 встречался почти в два раза чаще (в 52,94 % случаев), чем у больных с ОФВ 80 % и выше (28,57 %) (?2 = 3,87; р = 0,048). Данные проведенного исследования согласуются с результатами Mitsuya su H. et al. [9], которые в 1998 г. выявили ассоциацию полиморфного варианта Ile50 с атопической астмой и установили, что Ile50 вариант IL4RA примерно в три раза по сравнению с Val50 усиливает IL-4 ответ за счет повышения активности субъединицы рецептора. Таким образом, анализ Ile50Val полиморфизма гена рецептора IL-4 у больных БА и здоровых доноров из РБ выявил ассоциацию генотипа IL4RA*Ile50/*Ile50 с БА у русских, а также ассоциацию данного генотипа с тяжестью течения заболевания.Проведенный анализ Gln576Arg полиморфизма гена ?-цепи рецептора IL-4 показал, что распределения частот аллелей и генотипов данного ДНКлокуса в объединенных выборках больных БА и здоровых доноров практически не отличаются друг от друга (табл. 4). В обеих группах преобладающим оказался генотип IL4RA*Gln576/*Gln576, выявленный у больных в 62,18 % случаев, у здоровых доноров — в 63,91 % случаев. Генотип IL4RA*Arg576/*Arg576 определялся очень редко: в 2,56 % случаев в группе больных БА и в 1,78 % случаев — в контроле. Наиболее распространенный аллель IL4RA*Gln576 у больных БА встречался с частотой 79,81 %, в контрольной группе — с частотой 81,31 %. При разделении изучаемых выборок по этнической принадлежности и тяжести течения заболевания также не обнаружено выраженных отличий в распределении частот аллелей и генотипов данного локуса. Таким образом, исследование Gln576Arg полиморфизма гена IL4RА показало отсутствие ассоциации данного полиморфного варианта с БА в РБ. Анализ распределения частот сочетаний генотипов по двум полиморфным вариантам в гене рецептора IL-4 (Ile50Val и Gln576Arg) также не выявил статистически достоверных отличий как между объединенными выборками больных БА и здоровых доноров, так и при разделении их по этнической принадлежности.Учитывая данные литературы об изменении у больных БА синтеза противовоспалительного цитокина IL-10, влиянии промоторных полиморфных вариантов гена IL10 на уровень экспрессии данного цитокина и ассоциации полиморфизмов гена IL10 с бронхиальной астмой [3, 6], проведен анализ – 627С > А полиморфизма гена IL10 (1q31-32) у больных БА и здоровых доноров в РБ. Анализ распределения частот аллелей и генотипов данного локуса не выявил выраженных отличий между объединенными выборками больных БА и здоровых доноров (табл. 5). Наиболее распространенным в обеих выборках оказался генотип IL10*C/*C, определенный в 55,13 % случаев у больных БА и в 49,11 % случаев — в контрольной группе. Частоты аллелей IL10*C и IL10*А составили у пациентов с БА — 74,68 % и 25,32 %, а у здоровых доноров —
Таблица 4 Распределение частот аллелей и генотипов Gln576Arg полиморфизма гена IL4RA у больных БА и здоровых доноров
Таблица 5 Распределение частот аллелей и генотипов (– 627С > А) полиморфизма гена IL10 у больных БА и здоровых доноров
71,6 % и 28,4 %, соответственно. При разделении исследуемых групп по этнической принадлежности достоверные отличия были обнаружены между контрольными группами татар и башкир (?2 = 7,18; р = 0,02). У татар частота аллеля IL10*C и генотипа IL10*С/*С была значительно выше — 77,87 % и 57,38 %, по сравнению с 63 % и 36 % у башкир. У последних чаще встречались генотипы IL10*C/*А (54 % против 40,98 % у татар) и IL10*А/*А (10 % против 1,64 %). Сравнение частот аллелей и генотипов данного локуса между больными БА и здоровыми донорами, согласно этнической принадлежности, не выявило достоверных различий, что свидетельствует об отсутствии ассоциации данного полиморфного варианта гена IL10 с БА в РБ. Таким образом, исследование полиморфных вариантов генов IL-4 и ?-цепи рецептора IL-4 показало, что маркерами повышенного риска развития бронхиальной астмы у татар является аллель IL4*Т; а у русских — генотип IL4RA*Ile50/*Ile50. Генотипы IL4*С/*Т и IL4RA*Ile50/*Ile50 ассоциированы с тяжестью течения БА, в частности со степенью нарушения вентиляционной функции легких. Полиморфные варианты Gln576Arg гена IL4RА и – 627С > А гена IL10 не ассоциированы с БА в РБ.Работа выполнена при поддержке гранта ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002–2006 гг. (XIII очередь), НИР «Комплексное изучение бронхиальной астмы в Волго-Уральском регионе России», государственный контракт № 02.434.11.7115 от 18 августа 2006 г.
ЛИТЕРАТУРА
1. Чучалин А.Г. Белая книга. Пульмонология. Россия. — Москва, 2003. — 67 с.
2. Beghe B., Barton S., Rorke S . et al. Polymorphisms in the interleukin-4 and interleukin-4 receptor ? chain genes confer susceptibility to asthma and atopy in a Caucasian populations // Clin. Exp. Allergy. — 2003. — Vol. 33, № 8. — P.1111–1117.
3. Borish L., Aarons A., Rumbyrt J. et al. Interleukin-10 regulation in normal subjects and patients with asthma // J. Allergy Clin. Immunol. — 1996. — Vol. 97, № 6. — P. 1288–1296.
4. Burchard E.G., Silverman E.K., Rosenwasser L.J. et al. Association between a sequence variant in the IL-4 gene promoter and FEV(1) in asthma // Am. J. Respir. Crit. Care Med. — 1999. — Vol. 160, № 3. — P. 919–922.
5. Daniels S.E., Bhattacharrya S., James A. et al. A genome-wide search for quantitative trait loci underlying asthma // Nature. — 1996. — Vol. 383. — P. 247–250.
6. Hang L., Hsia T., Chen W. et al. Interleukin-10 gene – 627 allele variants, not interleukin-1 beta gene and receptor antagonist gene polymorphisms, are associated with atopic bronchial asthma // J. Clin. Lab. Anal. — 2003. — Vol. 17, № 5. — P. 168–173.
7. Kauppi P., Lindblad-Toh K., Sevon P. et al. A second-generation association study of the 5q31 cytokine gene cluster and the interleukin-4 receptor in asthma // Genomics. — 2001. — Vol. 77, № 1–2. — P. 35–42.
8. Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in molecular biology / Ed. by Walker J.M. — N.-Y.: Haman Press, 1984. — Vol. 2. — P. 31–34.
9. Mitsuyasu H., Izuhara K., Mao X. et al. Ile50Val variant of IL4R alpha upregulates IgE synthesis and associates with atopic asthma // Nat. Genet. — 1998. — Vol. 19, № 2. — P. 119–120.
10. Noguchi E., Shibasaki M., Arinami T. et al. Association of asthma and the interleukin-4 promoter gene in Japanese // Clin. Exp. Allergy. — 1998. — Vol. 28, № 4. — P. 449–453.
11. Ober C., Leavitt S. A., Tsalenko A. et al. Variation in the interleukin 4-receptor alpha gene confers susceptibility to asthma and atopy in ethnically diverse populations // Am. J. Hum. Genet. — 2000. — Vol. 66, № 2. — P. 517–526. 12. Ober C., Hoffjan S. Asthma genetics 2006: the long and winding road to gene discovery // Genes Immun. — 2006. — Vol. 7, № 2. — P.95–100.
13. Sandford A.J., Chagani T., Zhu S. et al. Polymorphisms in the IL4, IL4RA, and FCERIB genes and asthma severity // J. Allergy Clin. Immunol. — 2000. — Vol. 106, № 1. — P. 135–140.
14. StatSoft, Inc. (2001). STATISTICA (data analysis software system), version 6./ statsoft.com.
15. Steinke J.W., Borish L. Th2 cytokines and asthma. Interleukin-4: its role in the pathogenesis of asthma, and targeting it for asthma treatment with interleukin4 receptor antagonists // Respir. Res. — 2001. — Vol. 2, № 2. — P. 66–70.
Association of cytokine genes polymorphism analysis in bronchial asthmain Bashkortostan RepublicA.S. Karunas1, A.R. Izmaylova2, S.Z. Zagidullin2, E.K. Khusnutdinova11
Institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Scientific Center, Russian Academy of Sciences, Ufa;2
Bashkir Medical State University, Ufa
Asthma is a common chronic respiratory disease, its development being determined by the interaction between genetic and environmental factors. Cytokines play an integral role in the coordination and persistence of allergic inflammation of the airways in asthma. This study reports the results of association analysis of polymorphic variants of cytokine and cytokine receptor genes (IL4, IL4RA, IL10) in asthma in Bashkortostan Republic. The asthma group consisted of 140 patients; the control group included 169 unrelated nonasthmatic subjects. Genomic DNA was extracted from peripheral blood leucocytes by standard phenol/chloroform method. Genotyping was performed by polymerase chain reaction with specific primers and restriction analysis. The association of IL4*Т allele of the – 590C > Т polymorphism of the IL4 gene with bronchial asthma was found in Tatars. Moreover, association of IL4*Т/*Т genotype with significant decrement in pulmonary function was detected. The association of IL4RA*Ile50/Ile50 genotype of the Ile50Val polymorphism of the IL4RA gene with bronchial asthma in Russians and association of this genotype with severity of the disease were revealed. The analysis of the Q576R polymorphism of the IL4RA gene and the – 627C > A polymorphism of the IL10 gene detected no association between these polymorphic variants of genes and bronchial asthma in Bashkortostan Republic. (Cytokines and Inflammation. 2007. Vol. 6, № 4. P. 22–28.)