Эритропоэтин как модулятор цитокинсинтезирующей активности клеток эритроидного ряда С.В. Сенников, Т.В. Инжелевская, С.В. Крысов, В.А. Козлов
Институт клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск
Ранее было установлено, что клетки эритроидного ряда мышей и человека обладают цитокинсинтезирующей активностью. Известно, что эритропоэтин (ЕРО) является специфическим фактором, регулирующим выживаемость, пролиферацию и дифференцировку клеток эритроидного ряда.
Целью работы было исследование влияния ЕРО на цитокинсинтезирующую активность эрит роидных ядросодержащих клеток (ЭЯК).
В качестве источника ЭЯК использовали клетки костного мозга человека (КМ), клетки селезенки новорожденных и взрослых мышей линии (DBA?C57Bl/6)F1 после введения фенилгидразина. ЭЯК выделяли методами негативной и позитивной селекции. Кондиционную среду от ЭЯК (1?106 /мл) получали после 24 ч культивирования с и без ЕРО (5 ед/мл — для мышей и 2 ед/мл — для человека). Определение количественного содержания цитокинов производили электрохемилюминесцентным методом. Показано, что ЭЯК, выделенные из селезенок как новорожденных мышей, так и взрослых мышей после воздействия фенилгидразина при культивировании с ЕРО продуцировали достоверно меньше GMCSF и IFN?, чем ЭЯК, которые культивировали без ЕРО. Значимое влияние ЕРО оказывал только на менее зрелые клетки КМ человека, а именно на АГЭБ+ЭЯК, вызывая достоверное снижение продукции ими IL-2 и IFN?. Таким образом, ЕРО является модулятором цитокининтезирующей активности ЭЯК. ЕРО приводит к снижению продукции ЭЯК цитокинов, оказывающих ингибирующее действие на пролиферативную активность эритроидных клеток. Ключевые слова: эритропоэтин, эритроидные клетки, цитокины. Установлено, что эритроидные ядросодержащие клетки (ЭЯК) обладают цитокинсинтезирующей активностью. Продемонстрирована способеность ЭЯК новорожденных мышей и мышей с фенилгидразининдуцированной анемией продуцировать IFN? и GMCSF [11]. Способность к продукции ряда цитокинов, таких как: IL-1?, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF?, IFN? и TGF?1 — показана также для эритроидных клеток фетальной печени [12, 13] и костного мозга (КМ) человека [2]. Цитокины — это, в основном, индуцибельные белки, многие из которых могут влиять на цитокинсинтезирующую активность клеток различных ростков кроветворения. Известно, что эритропоэтин (ЕРО) является специфическим фактором, регулирующим выживаемость, пролиферацию и дифференцировку клеток эритроидного ряда. Под влиянием ЕРО в эритроидных клетках наблюдается повышение синтеза РНК и ДНК [5]. Целью данной работы было исследование влияния ЕРО на цитокинсинтезирующую активность ЭЯК.
Материалы и методы
В качестве источника ЭЯК использовали клетки КМ человека, клетки селезенки новорожденных и взрослых мышей линии (DBA?C57Bl/6)F1 после введения фенилгидразина. Гемолитическую анемию у мышей вызывали введением фенилгидразина (Fisher Sci. Co.) внутрибрюшинно по схеме: первый день — по 1,2 мг на мышь в 17 ч, второй день — по 0,6 мг на мышь в 9 и 17 ч. Селезенки забирали на 4'й день [11, 2]. Селезенки новорожденных забирали в период активного эритропоэза на 0–3 сут. постнатального периода. Метод выделения ЭЯК КМ человека и получение кондиционной среды от ЭЯК Клетки КМ, полученные при проведении стернальной пунк' ции, наносили на раствор фиколлверографина (1,082 г/см3 ) ицентрифугировали 30 мин при 1200 об/мин. Клетки, составляющие интерфазное кольцо, собирали, трижды отмывали в среде RPMI'1640 с 1% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Суспензию освобождали от адгезирующих элементов в чашке Петри [1]. Полученную суспензию клеток инкубировали в течение 30–40 мин с человеческой сывороткой IV группы крови. По окончании инкубации клетки два раза отмывали. Получение обогащенной популяции ЭЯК Клетки, освобожденные от адгезивных элементов, инкубировали в концентрации 1?107 /мл в бессывороточной среде RPMI1640 с Lлейцилметиловым эфиром (L'ЛМЭ,15 мМ) 30 мин при 37 °С для освобождения от клеток с хорошо выраженным лизосомальным аппаратом [14]. По окончании инкубации клетки два раза отмывали. Получение популяции АГЭБ+и GlA+эритроидных клеток Часть клеток, полученных после освобождения от адгезивных клеток, инкубировали в концентрации 1?107 /мл 1 ч при 4°С с мышиными моноклональными антителами против GlA (гликофорина А эритроцитов) (Harlan SeraLab, UK) или с антителами против антигена эритробластов (АГЭБ; моноклональные антитела получали из асцитной жидкости гибридомы НАЕ9, предоставленной проф. Е.Б. Мечетнером), после чего их отмывали в среде RPMI1640 с 1 % ЭТС. Затем клетки переносили в предварительно приготовленные чашки, покрытые кроличьими антимышиными антителами (ООО «Биосан»,
Рис. 1. Влияние ЕРО (5 ед/мл) на продукцию GM'CSF (а) и IFN? (б) эритроидными ядросодержащими клетками (1?106 /мл), выделенными из селезенок новорожденных мышей и селезенок мышей после воздействия фенилгидразина.
г. Новосибирск), для позитивной селекции на 1 ч 50 мин при 4 °С. Собирали прилипшие клетки и использовали для последующих исследований после предварительной оценки их жизне' способности. Для получения кондиционной среды обогащенную популяцию ЭЯК, GlA+и АГ'ЭБ+ клетки в концентрации 1?106/мл куль' тивировали 24 ч в среде Искова, содержащей 4 Mм L'глутамина, 5?105М меркаптоэтанола, 30 мкг/мл гентамицина, 20 мМ HEPES с наличием и без 10 %ной лошадиной сыворотки, в 24луночном планшете (Linbro) при 37 °С во влажной атмосфере с 5 % СО2 . Часть выделенных ЭЯК помещали в культуральную среду Искова, содержащую 2 ед/мл ЕРО (Recormon, Boehringer Mannheim, Germany), и культивировали 24 ч при 37°С во влажной атмосфере с 5% СО2 .
Метод выделения ЭЯК из селезенок мышей и получение кондиционной среды от ЭЯК
Ядросодержащие клетки селезенки выделяли центрифугированием на градиенте плотности фиколлверографина (1,082 г/см3 , 1200 об/мин, 30 мин) [4]. Клетки, составляющие интерфазное кольцо, собирали, трижды отмывали в среде RPMI'1640 с 1 % ЭТС и инкубировали (при 4 °С, 50 мин) в при' сутствии антиThy 1,2 моноклональных АТ (Cedarlane Lab.) в концентрации 10?106/мл в бессывороточной среде RPMI1640. После инкубации клетки вновь отмывали и ресуспендировали в среде RPMI'1640, содержащей 5 % ЭТС. Зрелые макрофаги, Тлимфоциты и Влимфоциты удаляли последующей процедурой «пэннинга», подробно описанной ранее [2, 4]. По окончании инкубации собирали неприлипшие клетки (ЭЯК), трижды отмывали средой RPMI1640 c 1 % ЭТС и использовали в последующих экспериментах после предварительной оценки их жизнеспособности. Для получения кондиционной среды от ЭЯК клетки в концентрации 1?106 /мл культивировали 24 ч в бессывороточной среде Искова, содержащей 4 mM Lглутамина, 5?105М 2?меркаптоэтанола, 30 мкг/мл гентамицина, 20 мМ HEPES в 24луночном планшете (Linbro) при 37 °С во влажной атмосфере с 5% СО2 . Часть ЭЯК культивировали в среде с добавлением ЕРО (5 ед/мл) 24 ч. Оценку жизнеспособности ЭЯК проводили методом вклю' чения трипанового синего или эритрозина В. Контроль чистоты выделения ЭЯК осуществляли окрашиванием мазков полученных клеток по методу Нохта Максимова и окрашиванием гемоглобина в клетках бензидином.
Электрохемилюминесцентный метод (ЭХЛ) количественного определения содержания цитокинов
Подготовку реактивов и определение каждого цитокина проводили, как описано ранее [3]. Использовали моноспецифические поликлональные (Peprotech Inc., UK) и моноклональные (R&D System, UK) антитела против рекомбинантных мышиных цитокинов GMCSF и IFN?, а также поликлональные и моноклональные антитела (R&D System, UK) против рекомбинантных человеческих цитокинов IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF?, IFN?, TGF?1, IL-1?. В работе использованы антитела, неспособные перекрестно связывать другие цитокины. Для построения калибровочных кривых применяли следующие рекомбинантные цитокины: мышиные GMCSF (Peprotech Inc., UK) и IFN? (R&D System, UK), человеческие TNF?, TGF?1, IL-1?, IL-2, IL-4, IL-6, (R&D System, UK), IFN? (Thomae'Biberach/Riss, Germany), IL-10 (Peprotech Inc., Rocky Hill, NJ). Концентрации цитокинов (в пг/мл) представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (М ± m) приp < 0,05. Достоверность полученных результатов оценивали непараметрическими критериями.
Статистическая обработка данных проводилась при помощи программы «Statistica 5.0». Результаты и обсуждение
На пролиферативную и дифференцировочную активность ЭЯК могут оказывать влияние цитокины и ростовые факторы. В ряду этих факторов наиболее известным активатором клеточной кинетики ЭЯК является ЕРО. ЕРО экзогенного происхождения наиболее часто используется в экспериментах как фактор, изменяющий пролиферативную и дифференцировочную активность ЭЯК [15, 7]. В наших экспериментах мы изучали влияние ЕРО на цитокинсинтезирующую активность ЭЯК КМ. На рис. 1 показано, что ЭЯК, выделенные из селезенок новорожденных мышей, а также из селезенкок взрослых мышей после воздействия фенилгидразина, при культивировании с ЕРО продуцировали достоверно меньше GM CSF, чем ЭЯК, культивированные без ЕРО. Продукция IFN? этими же популяциями клеток после воздействия ЕРО также была достоверно снижена (см. рис. 1). Известно, что связывание EPO с EPO рецептором усиливает пролиферацию ЭЯК, а также предотвращает апоптоз эритроидных предшественников и поддерживает их жизнеспособность [7]. Снижение продукции ингибитора пролиферации ранних эритроидных предшественников, которым и является IFN?, возможно, отражает один из моментов саморегуляции эритроидных клеток, запускаемых воздействием ЕРО. Снижение продукции GMCSF ЭЯК под влиянием ЕРО можно объяснить тем, что GMCSF является специфическим фактором роста для предшественников клеток гранулоцитарно макрофагального ряда [9], и при стимуляции эритропоэза ЕРО ЭЯК снижают продукцию GMCSF, поддерживающего гранулопоэз. Далее мы исследовали влияние ЕРО на продукцию других цитокинов ЭЯК КМ человека. Результаты исследования показали, что продукция таких цитокинов, как: IL-1?, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF?, IFN? и TGF?1 при добавлении ЕРО в культуру клеток не изменялась. Известно, что чувствительность эритроидных клеток к ЕРО изменяется в ходе дифференцировки. Она постепенно снижается с возрастанием степени зрелости этих клеток после стадии эритробласта, когда клетки снижают экспрессию рецепторов ЕРО и уже не зависят от эритропоэтина [15, 6]. Исходя из этого, мы сочли важным изучить, как влияет ЕРО на уровень продукции цитокинов АГЭБ+ и GlA+популяциями ЭЯК КМ. На рис. 2 показано, что добавление ЕРО к АГЭБ+клеткам приводило к достоверному
Рис. 2. Влияние ЕРО на продукцию цитокинов АГЭБ+позитивными эритроидными ядросодержащими клетками костного мозга (1 ? 106 кл/мл). * — р < 0,05.
снижению продукции ими IL-2 и IFN?. На продукцию цитокинов IL-1?, IL-4, IL-6, IL-10, TNF? и TGF?1 клетками АГЭБ+ ЕРО не оказывал влияния. Что касается популяции GlA+клеток, то достоверных различий в продукции ими цитокинов после воздействия ЕРО найдено не было. Однако тенденция к снижению продукции цитокинов наблюдалась для таких медиаторов, как IL-4, IL-6, TNF?, и к увеличению — для IL-1?, IL-2, IL-10, IFN? и TGF?1. Таким образом, значимое влияние ЕРО оказывал только на менее зрелые клетки, не воздействуя на более зрелую популяцию. В результате обработки ЕРО АГЭБ+клеток в 100 раз снижалась продукция IFN? и более чем в 2 раза — продукция IL-2. Эти два цитокина являются ингибиторами пролиферации эритроидных клеток. Снижение продукции этих цитокинов эритроидными клетками может свидетельствовать об усилении пролиферативной активности АГЭБ+ ЭЯК и отражать реализацию обратной связи посредством снижения аутокринной секреции части ингибиторов пролиферации ЭЯК. Полученные данные по изменению продукции цитокинов АГЭБ+ популяцией ЭЯК в ответ на ЕРО весьма интересны, так как именно эти клетки несут основное количество рецепторов к EPO. Известно, что рецептор к ЕРО экспрессируется на более ранних эритроидных предшественниках, так называемых BFUE и CFUE (эритроидных бурстобразующих и колониеобразующих единицах; BFUE — burst forming unit, erythroid; CFUE — colony forming unit, erythroid), но на эритробластах эксп рессия этого рецептора снижается и прекращается по мере их созревания [6]. В этот же момент происходит исчезновение с клеточной поверхности ЭЯК АГЭБ [8]. Экспрессия GlA, наоборот, усиливается с дифференцировкой эритроидных клеток и достигает максимума на ретикулоцитах [10]. Повидимому, рецепторы к ЕРО выражены на АГЭБ+ ЭЯК в большей мере, нежели на GlA+ ЭЯК. Наши эксперименты действительно показали способность АГЭБ+ ЭЯК изменять цитокинсинтезирующую активность в результате обработки ЕРО, тогда как GlA+ ЭЯК не изменяли уровня продукции цитокинов после обработки ЕРО. Таким образом, ЕРО является не только фактором роста и дифференцировки для клеток эритроидного ряда, но и обладает модулирующими свойствами в отношении цитокинсинтезирующей активности ЭЯК. Действие ЕРО направлено на снижение продукции цитокинов, оказывающих ингибирующее действие на пролиферативную активность эритроидных клеток.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. — Томск: Изд-во Томск. ун'та, 1992. — 272 с.
2. Инжелевская Т.В. Продукция гемоиммунорегуляторных цитокинов клетками эритроидного ряда мыши и человека: Автореф. дис. … канд. мед. наук.— Новосибирск, 2001. — 19 с.
3. Крысов С.В., Курамшин Д.Х., Силков С.А. и др. Использование электрохемилюминесцентного метода для количественного определения цитокинов в различных средах // Клин. лаб. диагностика. — 2000. — № 12. — С. 39–43.
4. Лимфоциты. Методы: Пер. с англ. / Под ред. Дж. Клауса. — М.: Мир, 1990.— 305 с.
5. Павлов А.Д. Эритроидная дифференциация и механизмы действия эритропоэтина // Успехи соврем. биол. — 1988. — Т. 105, № 1. — С. 117–133.
6. Broudy V.C., Lin N., Brice M. et al. Erythropoietin receptor characteristics on primary human erythroid cells // Blood. — 1991. — Vol. 77, № 12. — P. 2583– 2590.
7. Liboi E., Carroll M., D’Andrea A., Mahtey'Prevot B. Erythropoietin receptor signals both proliferation and erythroid'specific differentiation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1993. — Vol. 90, № 23. — P. 11351–11355.
8. Mechetner E.B., Tonevitsky A.G., Ievleva E.S. et al. Identification of a human erythroid cell surface antigen by monoclonal antibody HAE9 // Exp. Hema' tol.— 1987. — Vol. 15, № 4. — P. 355–359.
9. Metcalf D. The granulocyte'macrophage colony stimulating factors // Cell. — 1985. — Vol. 43, № 1. — P. 5–6.
10. Robinson J., Sieff C., Delia D. et al. Expression of cell'surface HLA'DR, HLA' ABC and glycophorin during erythroid differentiation // Nature. — 1981. — Vol. 289. — P. 68–71.
11. Sennikov S.V., Eremina L.V., Injelevskaya T.V. et al. Cytokine'synthesizing activity of erythroid cells // Rus. J. Immunol. — 2001. — Vol. 6, № 2. — P. 193– 202.
12. Sennikov S.V., Krysov S.V., Injelevskaya T.V. et al. Production of cytokines by erythroid cells of human embryonal liver // Eur. Cytocine Netw. — 2001. — Vol. 12, № 2. — P. 274–279.
13. Sennikov S.V., Krysov S.V., Silkov A.N. et al. Production of IL-10, TNF'?, IFN'?, TGF?1 by different populations of erythroid cells derived from human embryo' nal liver // Cytokine. — 2002. — Vol. 17 (in press).
14. Thiele D.L., Lypsky P.E. Regulation of cellular function by products of lysosomal enzyme activity: elimination of human natural killer cells by a dipeptide methyl ester generated from L'leucine methyl ester by monocytes or polymor' phonuclear leukocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA — 1985. — Vol. 82.— P. 2468–2474.
15. Wickrema A., Krantz S.B., Winkelmann J.C., Bondurant M.C. Differentiation and erythropoietin receptor gene expression in human erythroid progenitor cells // Blood. — 1992. — Vol. 80, № 8. — P. 1940–1949.
Erythropoietin as a modulator of cytokinesynthesizing activity of erythroid cells Sennikov S.V., Injelevskaya T.V., Krysov S.V., Kozlov V.A.
Institute of Clinical Immunology of SB RAMS
As we have demonstrated earlier, human and mouse erythroid nuclear cells have cytokinesynthesizing activity. Erythropoietin (ЕРО) is a specific factor regulating survival, proliferation and differentiation of erythroid cells. Our aim was to study ЕРО influence on cytokinesynthesizing activity of erythroid cells. As a source of erythroid nuclear cells (ENC) we used the cells of human bone marrow (BM), spleen cells of newborn (DBA?C57Bl/6)F1 mice and spleen cells of adult mice of the same strain after in vivo treatment by phenylhydrazine. ENC were isolated by positive and negative selection procedures using monoclonal antibodies. Erythroid cells (106 cell/ml) were cultivated for 24 h with and without ЕРО (5 U/ml for mouse and 2 U/ml for human cells). Quantitative determination of cytokines was performed by electrochemiluminescent methodusing ORIGEN Analyzer (IGEN Inc., USA). It was shown, that ENC isolated from spleens of either newborn or adult mice produce significantly lower levels of GMCSF and IFN? at cultivation with ЕРО than do ENC cultivated without ЕРО. ЕРО showed significant influence on immature bone marrow cells only, i.e. on human АGEB+cells. EPO reduced significantly IL-2 and TFNg production by these cells. Thus, ЕРО is the modulator of ENC cytokinesynthesizing activity and inhibits production of these cytokines by ENC. The above mentioned cytokines inhibit erythroid cells proliferation.
