загрузка...
 
П.В. Пигаревский ГУ Научноисследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт Петербург Морфометрическое исследование клеток иммунорегуляторного и эффекторного звеньев иммунитета в аорте и парааортальных лимфатических узлах при атерогенезе у человека
Повернутись до змісту

П.В. Пигаревский ГУ Научноисследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт Петербург Морфометрическое исследование клеток иммунорегуляторного и эффекторного звеньев иммунитета в аорте и парааортальных лимфатических узлах при атерогенезе у человека

Целью работы явилось изучение иммунорегуляторного и  эффекторного  звеньев иммунитета в динамике атеросклероза у человека. Иммуноморфологическое и морфометрическое исследования с использованием моноклональных антител к различным субпопуляциям Т и В лимфоцитов показали, что в возрастной группе 31–60 лет по мере прогрессирования атеросклероза в интимеи адвентиции аорты, а также в Т зоне регионарных к этим участкам сосуда парааортальных лимфатических узлов резко увеличивается численность CD4+ лимфоцитов и HLADR мононуклеарных клеток при неизменном  содержании CD8+ лимфоцитов. Указанные изменения  сопровождаются увеличением численности  IgG синтезирующих В лимфоцитов в  тех же участках сосудистой стенки и в В зоне парааортальных лимфатических узлов. В селезенке, периферическом лимфоидном органе, отдаленном от аорты, отмеченные выше иммуноморфологические перестройки отсутствуют. Полученные данные указывают на возможные механизмы и новые специфические черты развития иммунного воспаления в динамике атеросклероза у человека.

Ключевые слова: атерогенез, парааортальные лимфатические узлы, Т и В лимфоциты.В начале 90х  гг. была обоснована концепция ,позволяющая рассматривать становление и развитие атеросклеротических поражений артерий с позиций развития иммунного воспаления в сосудистой стенке[2, 8].Центральным положением о возможной роли аутоиммунитета в атерогенезе является определение природы антигенов и характера клеточных взаимодействий В настоящее время установлено, что модифицированные путем перекисного окисления (оксигенации)  липопротеиды  низкой  плотности (мЛПНП) присутствуют в большом количестве в интиме артерий уже на ранних стадиях атерогенеза и активируют экспрессию лейкоцитарных адгезивных молекул [11, 12, 13]. Это является стимулом для миграции в места отложения мЛПНП  моноцитов, а также Т и В клеток и продукции антител in situ [1, 5, 7, 17]. Показано, что в атеросклеротических бляшках присутствует большое число CD4+ Т клеток и макрофагов, что послужило основанием для утверждения о важной роли клеточного иммунитета в атерогенезе  [6, 10, 16].Более того, получены факты, которые позволяют считать, что Т клетки могут выступать инициаторами иммунного воспаления при атерогенезе в ответ на мЛПНП, а их медиаторы — как растворимые, так и контакт зависимые  играть решающую роль в формировании атеросклеротических поражений артерий  [4, 18]. Вместе с тем, оставалось неясным, что вызывает активацию CD4+Т клеток (и где она происходит) и формирование эффекторных иммуноглобулин синтезирующих В лимфоцитов, которые обнаруживаются в зоне атеросклеротических поражений. Неясным оставался также вопрос, в какой степени периферические органы иммунной системы вовлечены вэтот процесс — является ли аутоиммунный ответна мЛПНП местной реакцией сосудистой стенки или он носит генерализованный характер.

Целью настоящей работы явилось изучение иммунорегуляторного и эффекторного звеньев иммунитета в динамике атеросклероза у человека. Были проведены сравнительное иммуноморфологическое и морфометрическое исследования аорты и регионарных к ней групп лимфатических узлов на разных стадиях атерогенеза.

Материалы и методы  Объектом исследования был материал 44 аутопсий, полученных от мужчин  (средний возраст 57 ± 5 лет),  умерших отострой сердечнососудистой недостаточности атеросклеротической этиологии. Возрастную  группу 31–60 лет  (48 ± 4)  составили 30 аутопсий,  группу 61–75 лет  (69 ± 5)  14  аутопсий. На основании результатов патологоанатомического вскрытия из исследования был исключен материал, взятый от людей, у которых были заболевания, способные оказать воздействие  на  иммунологическую  реактивность.  В  качестве контрольного исследован материал  судебно медицинских вскрытий по поводу смерти от острой травмы (20 случаев). Учитывая, что и в этих случаях наблюдали те или иные формы проявления атеросклероза, материал использовали при  условии отсутствия выраженных атеросклеротических поражений артерий (при площади поражения аорты не более 10 %). При этом возрастную группу 31–60 лет (44 ± 8) составили 11 аутопсий, группу 61–75 лет (64 ± 10) — 9 аутопсий.

Таблица  1 Количественное содержание субпопуляций Т и Вклеток в аорте и периферических лимфоидных органах в норме

 

Таблица  2 Количественное содержание субпопуляций Т и В клеток в аорте и периферических лимфоидных органах на начальной стадии атеросклероза

 

Таблица  3 Количественное содержание субпопуляций Т и В клеток в аорте и периферических лимфоидных органах на выраженной стадии атеросклероза

 

В каждом случае участки сосуда из  грудного отдела аорты и регионарные к ним парааортальные лимфатические  узлы изучали в качестве единого комплекса. Исследованию были подвергнуты: неизмененные участки аорты без атеросклеротических поражений, участки с начальными поражениями в виде липидных пятен и участки сосуда с выраженными поражениями в виде липидно фиброзных и фиброзных бляшек. В качестве отдаленного от аорты периферического лимфоидного органа исследована селезенка. Лимфатические узлы разрезали продольно и всегда  строго через ворота  узла. Для исследования селезенки материал брали  из  средней  ее  части  на уровне ворот. Для морфологического исследования материал фиксировали в жидкости Карнуа. Парафиновые  срезы  толщиной 3–4 мкм окрашивали метиловым  зеленым и пиронином по Браше. Иммуноморфологическое исследование проводили на криостатных  срезах  толщиной 46 мкм, которые фиксировали в 4 %ном пара формальдегидев течение 15 мин и промывали в фосфатном буфере  (рН 7,4).Иммунорегуляторные  субпопуляции Т лимфоцитов определяли непрямым методом Кунса  с помощью моноклональных антител (Dako). Использовали антитела к поверхностным антигенам:  CD4,  CD8,  HLADR.  В качестве вторых антител наносили меченные изотиоционатомфлюоресцеина  (ФИТЦ) кроличьи  антитела  к  ? глобулину мыши (Институт эпидемиологиии микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи), а  также моноклональные антитела к иммуноглобулинам мыши, меченные пероксидазойхрена (Dako). IgG в В лимфоцитах выявляли с помощью прямого метода Кунса  с использованием козлиных моноспецифических антител (Sigma, USA), меченных пероксидазой хренаи ФИТЦ. Для контроля  специфичности  свечения в качестве промежуточной наносили не иммунную сыворотку, а в качестве меченой — анти сыворотку несоответствующей  специфичности .Препараты просматривали в световом микроскопе Axiomat (Opton, Germany) и в люминесцентном микроскопе МЛ4 с входными светофильтрами ФС12 и СЗС74, запирающим фильтром ЖЗС19ЖС18. Проводили морфометрический подсчет CD4+, CD8+ и HLADR+Т клеток в паракортикальной  зоне лимфатических  узлов и в Т зоне белой пульпы селезенки, а IgG синтезирующих В лимфоцитов — в мозговых тяжах лимфатических узлов и В зоне белой пульпы селезенки, не содержащей лимфоидных фолликулов с герминативными центрами. Кроме этого, все перечисленные выше клеточные формы подсчитывали в интиме и адвентиции аорты. Численность изучаемых клеток определяли в 10 полях зрения светового микроскопа без морфометрической сетки (об. ? 100, ок. ? 10 ) и их количество выражали в абсолютных числах.  Значимость различий между изучаемыми выборками определяли с помощью t критерия Стъюдента. Результаты и обсуждение В результате проведенного исследования удалось установить, что в возрастной группе 31–60 лет в Т зоне парааортальных лимфатических узлов, контролирующих сегменты аорты с начальными изменениями, в 2 раза  (p < 0,05) по сравнению с нормой увеличивается число CD4+ Т клеток (табл.1, 2). В еще большей степени этот процесс оказывается выражен в узлах, регионарных к участку аорты с фиброзной бляшкой,  где содержание CD4+ Т лимфоцитов возрастает в 3 раза (p < 0,05)по сравнению с нормой и почти в 1,5 раза по сравнению с начальной стадией (табл. 3, рис. 1, а, б). В возрастной  группе 61–75 лет изменения численности хелперных лимфоцитов носят аналогичный характер, но выражены они в меньшей степени (см. табл. 1–3). Важно, что одновременно в Т зоне пара аортальных лимфатических узлов в обеих возрастных  группах, но особенно резко у лиц в группе 31–60 лет, увеличивается рециркуляционная и миграционная активность лимфоцитов, о чем свидетельствует появление в паракортикальной зоне многочисленных посткапиллярных венул срезко расширенными просветами, заполненными лимфоидными клетками (рис. 1, в).В отличие от хелперных лимфоцитов, достоверное изменение численности CD8+ Т клеток (цитотоксических/супрессорных) обнаруживается в Т зоне пара аортальных лимфатических узлов только на выраженной стадии атерогенеза в возрастной  группе 31–60 лет,  где их содержание более  чем  в  2  раза  (p < 0,05)  снижается  по сравнению как с нормой, так и с начальной стадией заболевания (см. табл. 1–3). В отличие от пара аортальных лимфатических узлов, в Т зоне селезенки колебания численности CD4+ и CD8+ Т клеток на разных стадиях заболевания были незначительными и практически не отличались от нормального уровня (см. табл. 1–3).Полученные данные свидетельствуют об изменении численного состава среди иммунорегуляторных субпопуляций Т лимфоцитов в регионарных к местам атеросклеротических поражений лимфатических узлах. Причиной этих изменений могут быть как мЛПНП, так и нео антигены из сосудистой стенки. Увеличение содержания CD4+Т клеток в Т зоне лимфатических узлов, как правило, связано с начальной стадией иммунного ответа и предшествует иммуноморфологическим перестройкам в В зоне [5]. Кроме этого, образующиеся в Т зоне CD4+ Т лимфоциты могут поступать в местный воспалительный очаг, способствуя развитию иммуно воспалительных реакций in situ[16]. Поэтому на следующем этапе работы важно

 

Рис. 1. CD4 лимфоциты в паракортикальной зоне пара аортальных лимфатических узлов, контролирующих нормальный участок сосудистой стенки(а) и сегмент аорты с липидно фиброзными бляшками (б). Многочисленные посткапиллярные венулы паракортикальной зоны с расширенными просветами,часть из которых заполнена лимфоцитами (в).а, б — иммунопероксидазный метод с докраской ядер гематоксилином. ? 1000; в — окраска метиловым зеленым и пиронином по Браше. ? 400.

 

 

Рис. 2. CD4  лимфоциты в интиме нормального участка аорты (а) и в основании липидно фиброзной бляшки (б).Иммунопероксидазный метод с докраской ядер гематоксилином. ? 850. а) б)

 

Рис. 3. HLADR+ мононуклеарные клетки в основании липиднофиброзной бляшки (а) и в паракортикальной зоне парааортального лимфатическогоузла (б), контролирующего участок аорты с липидными пятнами и фиброзными бляшками.Иммунопероксидазный метод с докраской ядер гематоксилином. ? 950.

было провести иммуноморфологическое исследование сосудистой стенки .Одновременно с изменениями в регионарных лимфатических узлах существенные клеточные перестройки наблюдаются в контролируемых ими участках сосудистой стенки. Так, в возрастной группе 31–60 лет на начальной стадии в интиме аорты с липидными пятнами численность CD4+Т лимфоцитов возрастает в 3,3 раза (p < 0,05) по сравнению с нормой, а на выраженной стадии, преимущественно в транзиторной зоне и в основании липиднофиброзных бляшек, — в 6 раз(p < 0,05; рис. 2, а, б). Интересно, что не только в интиме, но и в подлежащих участках адвентициина начальной стадии — в 2 раза (p < 0,05), а на выраженной — в 2,6 раза  (p < 0,05) по сравнению с нормой также увеличивается число CD4+ Т клеток (см. табл. 1–3). В возрастной группе 61–75 лет изменения выражены в меньшей степени. В отличие от хелперных лимфоцитов, достоверных изменений численности CD8+ Т клеток в стенке аорты на разных стадиях атерогенеза по сравнению с неизмененными участками сосуда установить не удалось  (см.табл. 1–3).Обнаружение Т клеток в очага хатерогенеза еще не дает основания утверждать, что они иммунологически активны. Этот вопрос может быть решен при анализе на поверхности активированных Т лимфоцитов белков, отсутствующих у клеток в норме, таких, как HLADR, DQ [15]. Выяснение этого вопроса важно, поскольку известно, что только активированным Т лимфоцитам макрофаги могут презентировать местные антигены и только активированныеТклетки могут принимать участие в эффекторном звене реакций типа ГЗТ [3]. Следует отметить, что HLADR и HLADQ антигены могут экспрессироваться не только активированными Т лимфоцитами, но и моноцитами/макрофагами, и на основании иммуногистохимических реакций их разделение не представляется возможным. Поэтому клетки, у которых были выявлены эти антигены,мы называем в дальнейшем мононуклеарными клетками. Используя моноклональные антитела против HLADR антигена, удалось установить, что в интиме и адвентиции неизмененных участков сосуда мононуклеарные клетки, экспрессирующие HLADR,  отсутствуют полностью  (см.табл. 1).По мере прогрессирования атеросклероза их удается выявить в основном только в возрастной группе 31–60 лет и только в интиме аорты(рис. 3, а; см. табл. 2, 3).Не исключено, что активация мононуклеарных клеток происходит непосредственно в сосудистой стенке, хотя вполне вероятно, что этот процесс начинается в регионарных лимфатических узлах. Результаты проведенных исследований показали,что в норме в Т зоне пара аортальных лимфатических узлов число активированных мононуклеарных клеток невелико (см. табл. 1). По мере прогрессирования атерогенеза, одновременно с ростом общего числа CD4+ Тклеток увеличиваетсясодержание активированных мононуклеаров, причем только в возрастной  группе 31–60 лет(рис. 3, б). Так, на начальной стадии количество экспрессирующих HLADR мононуклеарных клеток в Т зоне парааортальных лимфатических узлов возрастает в 3 раза (p < 0,05) по сравнению с нормой, а на выраженной стадии  в 4 раза (p < 0,05;см. табл. 1–3). В возрастной группе 61–75 лет численность этих клеток крайне мала и не подвержена количественным изменениям. В Т зоне белой пульпы селезенки колебания численности HLADR  позитивных клеток на разных стадиях заболевания практически не отличаются от нормального уровня, а в В зоне всех изученных периферических лимфоидных органов этиклетки не обнаруживаются (см. табл. 1–3).Регуляторный потенциал лимфоцитов мы рассматриваем как важное звено атерогенеза. Известно, что от функционального состояния иммунорегуляторных лимфоцитов напрямую зависит эффекторное звено иммунитета. Анализ структурныхкомпонентов Взоны парааортальных лимфатических узлов показал, что на начальной стадии заболевания в поверхностной части коры и мозговом слое число IgGпродуцирующих Вклеток возрастает в 4 раза (p < 0,05) по сравнению с нормой, а на выраженной стадии  в 5 раз  (p < 0,05)  (см. табл.1–3, рис. 4, в). В отличие от лимфатических узлов ,в В зоне белой пульпы селезенки содержание функционально активных В лимфоцитов практически не отличается от нормального уровня.В аорте функционально активные В лимфоциты обнаруживаются редко, их численность составляет в среднем менее 1 % от общего количества клеток интимы [2]. Наши морфометрические данные подтверждают этот факт, и тем не менее, прежде всего в возрастной  группе 31–60 лет, на начальной и особенно на выраженной стадиях атеросклероза в интиме аорты и подлежащих участках адвентиции IgG продуцирующие лимфоциты встречаются чаще, чем в неизмененной сосудистой стенке (см. табл. 1–3; рис. 4, а, б). В возрастной группе 61–75 лет изменения носят аналогичный характер, но проявляются в меньшей степени; исключение составляет адвентиция аорты на выраженной стадии атеросклероза (см. табл. 3).Не исключено, что увеличение численности иммуноглобулин  продуцирующих лимфоцитов в пара аортальных лимфатических узлах и стенке сосуда в самой начальной стадии атерогенеза связано с развитием иммунного ответа на образующиеся аутоантигенные формы мЛПНП. В дальнейшем, по мере формирования атеросклеротических поражений артерий, к этому процессу, повидимому, присоединяется развитие сенсибилизации к антигенам сосудистой стенки.

 

Рис .4. IgG продуцирующие лимфоциты на выраженной стадии атерогенеза в покрышке липиднофиброзной бляшки (а), в подлежащем участке адвентиции (б) и в мозговом слое парааортального лимфатического узла (в), контролирующего атеросклеротически измененные участки аорты.Иммунофлюоресцентный метод. ? 900.

Заключение

Таким образом, в результате проведенного исследования на начальной и выраженной стадиях атерогенеза выявлен сочетанный характер изменений в лимфатических узлах и контролируемыхими участках сосудистой стенки. В пара аортальных лимфатических узлах обнаружены иммуноморфологические перестройки, свидетельствующие о развитии иммунного ответа. В Тзоне узлов резко увеличивается содержание CD4+ Т лимфоцитов при одновременном росте численности активированных мононуклеарных клеток, экспрессирующих HLADR антиген, усиливается рециркуляционная и миграционная активность лимфоидных клеток, причем эти изменения происходят на фоне резкого увеличения в В зоне числа функционально активных В лимфоцитов, продуцирующих IgG. Одновременно в интиме и адвентиции аорты в зоне атеросклеротических поражений обнаружено достоверное увеличение численности CD4+Тклеток, активированных мононуклеаров, экспрессирующих HLADR, и  IgG синтезирующихВлимфоцитов при неизменном содержании CD8+Т клеток. Как в аорте, так и в парааортальных лимфатических узлах в наибольшей степени иммуноморфологические перестройки были выражены в возрастной группе 31–60 лет. Такой характер изменений может свидетельствовать в пользугипотезы, высказанной G.K. Hansson и S. Stemme[9, 14], о том, что В клеточный ответ зависит от Т клеточной реакции и присутствующие в атеросклеротических очагах CD4+ лимфоциты могут инициировать аутоиммунный ответ к мЛПНП. До сих пор было неясно,  где конкретно происходит активация CD4+ Т клеток и где образуются IgG синтезирующие В лимфоциты при атерогенезе. После изучения участков аорты и регионарных к ним групп лимфатических узлов можно предполагать, что после контакта с антигеном, наряду с другими мононуклеарами, активация Т клеток, и, скорее всего CD4+ Т лимфоцитов,происходит в Т зоне именно пара ортальных лимфатических узлов. Учитывая высокую рециркуляционную активность этих узлов на начальной и выраженной стадиях атерогенеза, вполне вероятно, что активированные и неактивированные CD4+ Т клетки из Т зоны, а также IgG продуцирующие В лимфоциты из В зоны мигрируют в соответствующие участки сосудистой стенки. На основании изложенного можно заключить,что наиболее выраженные и существенные клеточные перестройки происходят в регионарных каорте лимфатических узлах и коррелируют с тяжестью атеросклеротических поражений интимы сосуда. Можно полагать, что эти реакции тесно связаны с особенностями развития иммунного воспаления в липидных пятнах и атеросклеротических бляшках.

ЛИТЕРАТУРА

1. Климов А.Н., Нагорнев В.А. О необычном пути выведения клеткой синтезированного белка // Бюл. эксперим. биол.  1996.  № 9. С. 268–270.

2. Нагорнев В.А. Атерогенез и иммунное воспаление // Бюл. эксперим. биол.96.  № 7.  С. 4–8.

3. Нагорнев В.А., Анестиади В.Х.,  Зота Е.Г. Атерогенез  (аспекты патобиологии).  Кишинев–СанктПетербург, 2001.  330 с.

4. Нагорнев В.А., Кетлинский С.А. Клеточномолекулярные механизмы становления и развития атерогенеза (CD40CD40Lиммунорегуляторный сигнал) //Бюл. эксперим. биол.  1999.  № 10. С. 364–371.

5. Пигаревский П.В. Функциональная морфология лимфоидных органов и иммунорегуляторных лимфоцитов человека в норме и при атеросклерозе: Автореф. дис. . . . дра биол.наук.  СанктПетербург, 1991.  41 с.

6. Пигаревский П.В., Нагорнев В.А. Функциональная морфология лимфатических узлов и селезенки при атерогенезе // Арх. патол. — 1995. — № 3. С. 44–49.

7. BevIL-acqua M.P. Endothelialleukocyte adhesion molecules // Annu. Rev. Immunol.  1993. — Vol. 11.  P. 767–804.

8. Hansson G.K.  Immune and  inflammatory mechanisms  in  the development ofatherosclerosis // Br. Heart. J.  1993.  Vol. 69 ( Suppl. 1).  P. 38–41.

9. Hansson G.K., Stemme S. Immunity, inflammation, and the role of T lymphocytes  in  atherosclerosis. —  Jn:Atherosclerosis  X  /  Eds.  byF.P. Woodford,  J. Davignon and S. Sniderman.  Elsevier Sci. B.V. 1995.  P.61–65.

10. Jonasson L., Holm J., Skalli O. et al. Regional accumulation of T  cells, macrophages and smooth muscle cells in the human atherosclerotic plaque // Arteriosclerosis.  1986.  Vol. 6.  P. 131–138.

11. Jurgens G., Chen Q., Esterbauer H. et al.  Immunostaining of human autopsyaortas with antibodies to modified apolipoprotein B and apolipoprotein (a) //Arterioscler. Thromb.  1993.  Vol. 13.  P. 1689–1699.

12. Ku G., Thomas C.E., Akeson A.L. et al. Induction of interleukin 1 expression fromhuman peripheral blood monocytederivied macrophages by 9hydroxyoctadecadienoic acid // J. Biol. Chem.  1992.  Vol. 267.  P. 14183–14188.

13. Steinberg D. Lipoprotein modification and atherogenesis //Atheroscler. Rev. 1991.  Vol. 23.  P. 115–121.

14. Stemme S., Hansson G.K. Immune mechanisms in atherogenesis // Ann. Med. 1994.  Vol. 26.  P. 141–146.

15. Stemme S., Holm J., Hansson G. T lymphocytes in human atherosclerotic plaquesare memory  cells expressing CD4+R and  the  integrin VLA1  // Arterioscler.Thromb.  1992.  Vol. 12.  P. 206–211.

16. Watanabe T., Shimokama T., Haraoka S. et al. T lymphocytes in atheroscleroticlesions // Ann. N.Y. Acad. Sci.  1995.  Vol. 748.  P. 40–45.

17. Wick G., Xu Q. Atherosclerosis an autoimmune disease // Exp. Gerontology. 1999.  Vol. 34.  P. 559–566.

18. Zhou X., Stemme S., Hansson G.K. Evidence  for a  local  immune  response  inatherosclerosis. CD4+ T cells infIL-trate lesions of apoproteinEdeficient mice //Am. J. Pathol.  1996.  Vol. 149.  P. 359–366.



загрузка...