загрузка...
 
Н.А. Маянский, Д. Роос, Т. Кайперс Sanquin Research at CLB, and Landsteiner Laboratory, Академический медицинский центр Амстердамского университета, Нидерланды Каспазонезависимый путь клеточной гибели нейтрофилов человека, индуцированный TNF?
Повернутись до змісту

Н.А. Маянский, Д. Роос, Т. Кайперс Sanquin Research at CLB, and Landsteiner Laboratory, Академический медицинский центр Амстердамского университета, Нидерланды Каспазонезависимый путь клеточной гибели нейтрофилов человека, индуцированный TNF?

Цель — изучить механизмы клеточной гибели нейтрофилов, индуцированной TNF?. Материалы и методы. Клеточную гибель нейтрофилов, вызванную TNF? при отсутствии или добавлении ингибитора каспаз zVADfmk и ряда антиоксидантов, исследовали при помощи проточной цитофлуориметрии клеток, окрашенных аннексиномV/PI, и анализа цитоспинов. Активацию каспаз 8 и 3 регистрировали путем иммуноблоттинга, ДНК«лестницу» выявляли при  электрофорезе ДНК в агарозном геле, анализ митохондрий и белка Вах проводили c помощью флуоресцентной микроскопии. Цитопласты нейтрофилов получали при ультрацентрифугировании в прерывистом  градиенте плотности. Результаты. TNF? вызывал апоптозную гибель нейтрофилов в 6 часовых культурах, которая сопровождалась активацией каспаз 8 и 3. Вместе с тем при ингибировании каспаз zVADfmk воздействие TNF? попрежнему вызывало клеточную гибель нейтрофилов. Данный тип клеточной гибели не обнаруживал типичных для апоптоза ядерных изменений и перераспределения Вах, но демонстрировал кластеризацию митохондрий и изменения цитоплазматической мембраны, схожие с апоптозными. Эксперименты с утилизатором активных форм кислорода (АФК) и специфическим ингибитором митохондриального дыхания, а также с цитопластами нейтрофилов, лишенными митохондрий, показали, что клеточная гибель нейтрофилов после воздействия TNF? zVADfmk опосредуется через АФК митохондриального происхождения. Заключение. Воздействуя на нейтрофилы человека,  TNF?  способен индуцировать два пути клеточной  гибели: «классический» каспазозависимый апоптоз и «неклассическую» каспазонезависимую клеточную гибель. Ключевые слова: нейтрофилы, апоптоз, TNF?, каспазы, ингибиторы каспаз, антиоксиданты. Туморонекротический фактор ? (TNF?) обеспечивает широкий спектр биологических сигналов, участвующих в регуляции иммунного гомеостаза [23], в том числе и через управление клеточной гибелью. Будучи одним из важнейших провоспалительных цитокинов, TNF? в ряде экспериментальных моделей обнаруживал антивоспалительный эффект [11, 14], который может быть частично обусловлен индукцией апоптоза нейтрофилов. Этот вид клеточной гибели позволяет удалять потенциально опасные нейтрофилы из очагов воспаления и способствует их ограничению, поскольку фагоцитоз апоптозных клеток резидентными макрофагами оказывает иммуносупрессивный эффект  [20]. Апоптозное действие TNF? связано с активацией каскада апоптозных протеаз, называемых каспазами. Сигнал гибели передается с рецептора TNF? внутрь клетки через ряд адапторных белков, которые организуют комплекс с одной из инициаторных каспаз — каспазой , что ведет к активации последней. Активная каспаза способствует включению эффекторных каспаз, завершающих апоптозную программу [3]. В связи с этим вполне логичными представляются данные, показывающие, что ингибирование каспаз значительно повышает выживаемость различных типов клеток, в том числе и нейтрофилов, за счет задержки апоптоза [13]. Исследуя влияние TNF? на апоптоз нейтрофилов, мы столкнулись с неожиданным феноменом. Было обнаружено, что, несмотря на то что каспазы играют центральную роль в апоптозе нейтрофилов, ингибрование каспаз в присутствии TNF? не предотвращало гибель клеток, а, напротив, уси

 

Рис. 1. Клеточная гибель нейтрофилов.

Нейтрофилы культивировали в течение 6 ч без добавлений (контроль), в присутствии 20 нг/мл TNF?, 150 ммоль/л zVADBfmk или их комбинации, после чего клеточную гибель оценивали при помощи (а) проточной цитофлуориметрии клеток, меченных аннексином BVBФИТЦ и пропидиум иодидом  (PI), и  (б) световой микроскопии цитоспинов, окрашенных по Май  Грюнвальду B Гимза. Количественные данные представлены на рис. 3. Вершины стрелок указывают на нейB трофилы, подвергнувшиеся  спонтанному  (контроль) или TNF? индуцированному апоптозу и имеющие  типичную апоптозную морфологию; закрытая и открытая  стрелки отмечают нейтрофилы  с аберрантной морфологией, появляющейся при воздействии TNF? zVADBfmk  (см. детали в тексте). Результаты 6–8 независимых экспериментов.

 ливало ее. В настоящей работе описывается этот каспазонезависимый путь клеточной гибели нейтрофилов, отличающийся от «классического» апоптоза по ряду признаков, а также предлагаются его вероятные механизмы. Материалы и методы Реактивы:  TNF? — Calbiochem  (Германия);  zVADBfmk — Alexis Biochemicals  (США); аннексинBV — Bender Medsystems (Австрия); MitoTracker Green  FM — Molecular Probes  (США). Антитела (Ат): противах и каспазы — Pharmingen (США); каспазы — Cell Signaling  (США). Другие реактивы, если не указано иное, были приобретены  у Sigma  (США). Методики выделения и культивирования нейтрофилов и цитопластов, определения  уровня апоптоза, иммуноблоттинга, конфокальной лазерной  сканирующей микроскопии  (КЛСМ) детально описаны ранее  [1, 2, 13]. Электрофорез ДНК, выделенной из5?106  нейтрофилов при помощи набора PureGene DNA isolation kit  (Gentra Systems, США) в  соответствии  с рекомендациями производителя, проводили в 1,2 % ном агарозном геле, содержащем  этидиум бромид, после чего  гель фотографировали в ультрафиолетовом свете. Статистическую обработку результатов выполняли при помощи ANOVA (oneway analysis of variance) с последующим посттестом Бонферрони, используя компьютерную программу GraphPad Prism  v. 3.0.  Статистически  значимыми различия считали при р < 0,05.

 

Рис. 2. Расщепление каспазы и каспазы в нейтрофилах.

Клеточные лизаты свежевыделенных нейтрофилов (1), нейтрофилов, культивированных в течение 6 ч без добавлений (2), в присутствии zVADBfmk (3), TNF? (4) или их комбинации (5) были подвергнуты электрофорезу и иммуноблоттингу с использованием МоАт против каспазы  (а). После этого мембраны были обработаны поликлональными Ат против каспазы (б). Дозировки TNF? и zVADB fmk — как на рис. 1. Результат 4 независимых экспериментов.

Результаты и обсуждение

Культивируемые in vitro нейтрофилы подвергались спонтанному апоптозу, и уже через 6 ч инкубации 31,9 ± 2,5 % клеток связывали аннексин  (рис. 1, а, контроль), а 34,2 ± 2,0 % нейтрофилов приобретали типичную апоптозную морфологию (сморщивание клеток, округление ядер, выраженная конденсация хроматина; рис. 1, б, контроль, вершины стрелок). При инкубации нейтрофилов на протяжении 6 ч в присутствии TNF? количество аннексинпозитивных клеток увеличивалось до 40,0 ± 4,3 % (см. рис. 1, а, TNF?), в то время как морфологически апоптозными становились 74,0 ± 4,3 % клеток  (см. рис. 1, б, TNF?). Эти результаты согласуются с предыдущими сообщениями о способности TNF? индуцировать апоптоз нейтрофилов в краткосрочных (6–8 ч) культурах [16]. Далее с помощью иммуноблоттинга был исследован процесс активации инициаторной каспазы и эффекторной каспазы (рис. 2). В свежевыделенных нейтрофилах обе каспазы присутствовали только в виде проферментов: прокаспазы (молекулярная масса 57/55 кДа; см. рис. 2, а,

 

Рис. 3. Количественные данные о клеточной гибели нейтрофилов после 6 ч инкубации в указанных условиях, полученные при проточной цитофлуориметрии и анализе цитоспинов (см. рис. 1).

Дозировки: TNF? и zVADBfmk — как на рис. 1; ацетилцистеин (NBАЦ) — 5 ммоль/л; ротенон — 100 ммоль/л. — p < 0,05; — р < 0,05 относительно  соответствующего  столбца в TNF? zVADBfmk. Результаты (М ± m) 6 независимых экспериментов.

 

Рис. 4. Электрофорез ДНК нейтрофилов. ДНК, выделенная из свежеизолированных нейтрофилов, а также из нейтрофилов, культивированных в течение 6 ч в указанных условиях (дозировки TNF? и zVADBfmk — как на рис. 1), была подвергнута электрофорезу в агарозном геле. Оценивалась межнуклеосомальная фрагментация ДНК («лестница»). Результаты 3 независимых экспериментов.

 

Рис. 5. Окрашивание митохондрий в нейтрофилах. Нейтрофилы инкубировали в  течение 6 ч в указанных условиях  (дозиB ровки TNF? и  zVADBfmk —  как на рис. 1).  Затем клетки окрашивали MitoTracker GreenFM и анализировали при помощи КЛСМ. Отрезок — 5 мм. Результат 4 независимых экспериментов.

 

Рис. 6. Субклеточное перераспределение белках в нейтрофилах.

 

Рис. 7. Клеточная гибель цитопластов.

Цитопласты культивировали в  течение 16 ч в  указанных  условиях  (дозировки TNF? и  zVADBfmk — как на рис. 1). Затем клетки метили аннексином BVBФИТЦ и анализировали при помощи проточной цитофлуориметрии. Цитопласты, окрасившиеся аннексином,  считали погибшими  (нижний правый квадрант на диаграммах).  —р < 0,05 относительно контроля и TNF?. Результаты (М ± m) 5 независимых экспериментов. Нейтрофилы культивировали в течение 6 ч в указанных условиях (дозировки TNF? и zVADBfmk — как на рис. 1). После этого клетки окрашивали MitoTracker GreenFM, фиксировали, метили поликлональными Ат противах и анализировали при помощи КЛСМ.  (В связи с фиксацией клеток митохондриальное окрашивание —  зеленая флуоресценция — обнаруживает более диффузное цитоплазматиB ческое распределение по сравнению с тубулярными структурами, представленными на рис. 4, левые микрофото). Отрезок — 5мм. Результат 4 независимых экспериментов.

линия 1) и прокаспазы3  (молекулярная масса 32 кДа; см. рис. 2, б, линия 1). Нейтрофилы, апоптировавшие спонтанно в культуре без добавлений, демонстрировали начальную активацию каспазы8, на которую указывало появление большого, 43/41 кДа, фрагмента (см. рис. 2, а, линия 2). Каспаза3 в этих условиях частично расщеплялась до фрагмента 17 кДа (см. рис. 2, б, линия 2). Присутствие в инкубационной среде TNF? приводило к более выраженной активации каспазы8 и каспазы3. Как показано на рис. 2, а, линия 4, каспаза8 полностью фрагментировалась с образованием активного продукта с молекулярной массой 18 кДа, а каспаза3 целиком расщеплялась, превращаясь в активный фрагмент (см. рис. 2, б, линия 4). Следующим этапом работы стала проверка возможности задержки апоптоза нейтрофилов, индуцированного TNF?, с помощью ингибитора каспаз широкого спектра zVADfmk. Пептидкетоны, потих ферментов [7]. Наличие в инкубационной среде zVADfmk значительно снижало уровень апоптоза нейтрофилов (18,6 ± 2,0 % аннексинVпозитивных клеток и 9,4 ± 2,5 % клеток с апоптозной морфологией, см. рис. 1, а и б, zVADfmk) по сравнению с культурами без добавлений. Кроме того, zVADfmk полностью ингибировал активацию каспазы8 и каспазы3, поскольку при иммуноблоттинге не выявлялось продуктов их расщепления (см. рис. 2, а и б, линия 3).  Неожиданной находкой явилось следующее наблюдение. При инкубации нейтрофилов в присутствии комбинации TNF? zVADfmk ингибитор каспаз не предотвращал гибель клеток и после воздействия указанной комбинации 52,4 ± 4,7 % нейтрофилов становились аннексинпозитивными (см. рис. 1, а, TNF?   zVADfmk). При этом нейтрофилы обнаруживали необычную «аберрантную» морфологию (см. рис. 1, б, TNF?   zVADfmk): некоторые клетки были увеличены в размерах, имели разреженный дезинтегрированный хроматин и вакуолизацию (открытая стрелка), другие демонстрировали  гиперлобуляцию ядра и умеренную конденсацию хроматина  (закрытая стрелка). Следует обратить внимание на то, что описанная морфологическая картина совершенно не похожа на картину «классического» апоптоза, представленную на рис.1, б, TNF?. Число нейтрофилов с указанной аберрантной морфологией в культурах, обработанных TNF?   zVADfmk, достигало 40,0 ± 6,2 %. Вместе с тем типичная апоптозная морфология в этих же условиях была выявлена у 9,4 ± 4,3 % нейтрофилов. Последний показатель совпадает с уровнем морфологического апоптоза, обнаруженного после инкубации в присутствии только zVADfmk, что отражено на рис. 3, суммирующем количественные данные. Примечательно, что фракция аберрантных клеток была ничтожно мала среди нейтрофилов, культивированных без добавлений или с добавлением только TNF?, и незначительна  (< 3 %) при инкубации только с zVADfmk. При исследовании состояния каспаз в нейтрофилах, инкубированных с TNF? zVADfmk, оказалось, что необычная  гибель клеток, вызванная этой комбинацией, происходила без активации каспазы8 и каспазы3 (см. рис. 2, а и б, линия 5).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что TNF? способен вызывать два различных типа гибели нейтрофилов: каспазозависимый («классический» апоптоз) и каспазонезависимый. Следующая серия экспериментов позволила более детально охарактеризовать каспазонезависимую  гибель нейтрофилов. При исследовании интернуклеосомальной деградации ДНК, которая является характерным признаком апоптоза, было обнаружено, что ДНК нейтрофилов, инкубированных в присутствии только TNF?, давала типичную картину апоптозной «лестницы» при электрофорезе (рис. 4). В то же время, ДНК, выделенная из нейтрофилов, обработанных TNF?   zVADfmk, не выявляла признаков апоптозной фрагментации и электрофоретически практически не отличалась от ДНК свежевыделенных нейтрофилов, а также нейтрофилов, культивированных без добавлений или только с zVADfmk (см. рис. 4). Следовательно, гибель нейтрофилов, индуцированная комбинацией TNF?   zVADfmk, отличалась от «классического» апоптоза и по этому признаку. В наших недавних публикациях было показано, что нейтрофилы содержат митохондрии, которые играют важную роль в регуляции апоптоза этих клеток [2, 13]. В связи с этим мы проверили, участвуют ли митохондрии в каспазонезависимой гибели нейтрофилов. В свежевыделенных нейтрофилах [2, 13], а также в большинстве клеток, инкубированных в течение 6 ч без добавлений (контроль) или в присутствии zVADfmk  (рис. 5), окрашенные специфическим флуоресцентным красителем митохондрии имели трубчатую структуру. В нейтрофилах, обработанных TNF?, митохондрии изменяли форму, образуя крупные, большей частью перинуклеарные конгломераты (см. рис. 5, TNF?), типичные для апоптоза [2, 13]. Культивирование нейтрофилов с комбинацией TNF?   zVADfmk также изменяло морфологию митохондрий, приводя к агрегации и деградации этих органелл (см. рис. 5, TNF?   zVADfmk). Затем был исследован апоптозный белок Вах, который участвует в регуляции митохондриальнозависимого пути апоптоза нейтрофилов [2, 13]. После 6 ч инкубации Вах имел точечную локализацию и флуоресцировал отдельно от митохондрий в большинстве нейтрофилов из культур без добавлений (рис. 6, контроль) и в клетках, обработанных zVADfmk (фото не представлено). Описанная картина характерна и для свежевыделенных нейтрофилов [2, 13]. Инкубация с TNF? вызывала характерные апоптозные изменения Вах, а именно его перераспределние в крупные конгломераты флуоресценции, которые колокализовались с митохондриями  (см. рис. 6, TNF?; желтый цвет отражает колокализацию). В нейтрофилах, культивированных в присутствии TNF?   zVADfmk, Вах сохранял точечное распределение и практически не был локализован с митохондриальным окрашиванием (см. рис. 6, TNF? zVADfmk). Таким образом, проведенные исследования показали, что в обычных условиях TNF? действует через «классический» каспазозависимый механизм апоптоза, включающий в себя субклеточное перераспределение и его слияние с митохондриями. В то же время, стимуляция TNF? в ситуации, когда каспазы неактивны, вскрывает способность этого цитокина вызывать каспазонезависимую клеточную гибель нейтрофилов, отличающуюся от апоптоза и протекающую без изменений Вах, но с участием митохондрий. Для того чтобы прояснить роль митохондрий в феномене  гибели нейтрофилов, индуцированной TNF?   zVADfmk, были использованы цитопласты нейтрофилов, которые представляют собой цитоплазматические пузырьки, лишенные ядра, гранул и органнелл, в том числе митохондрий [13]. Как показало окрашивание аннексином, цитопласты  (подобно интактным нейтрофилам) экспрессировали остатки фосфатидилсерина на внешней стороне клеточной мембраны после культивирования без добавлений (контроль) или в присутствии TNF? (рис. 7). zVADfmk значительно снижал количество цитопластов, связывающих аннексин (см. рис. 7, zVADfmk). Схожие показатели были получены в экспериментах с нейтрофилами  (см. рис. 3). Однако, в противоположность нейтрофилам, цитопласты, обработанные TNF?   zVADfmk, не погибали, и только 11,0 ± 1,3 % из них становились аннексинVпозитивными  (см. рис. 7, TNF?   zVADfmk). Иными словами, добавление TNF? к  zVADfmk не имело влияния на выживаемость цитопластов и ингибитор каспаз сохранял способность блокировать их гибель. Это говорит о том, что в отсутствие митохондрий TNF? не мог вызывать каспазонезависимую гибель цитопластов. Приведенные результаты вновь указывают на участие митохондрий в процессе необычной гибели нейтрофилов после стимуляции TNF?   zVADfmk. Каков вклад этих органелл в данный феномен? Известно, что в ответ на стимуляцию клетки TNF? митохондрии могут продуцировать активные формы кислорода  (АФК), которые опосредуют, по крайней мере частично, его цитотоксические эффекты  [21, 8]. Действительно, утилизатор АФК Nацетилцистеин (NАЦ) почти полностью отменял  гибельное действие TNF?   zVADfmk  (см. рис. 3). Этот агент значительно снижал число аннексинVпозитивных нейтрофилов и предотвращал появление клеток с аберрантной морфологией. Митохондриальное происхождение АФК было подтверждено с помощью ротенона — ингибитора цепи транспорта электронов  (дыхательной цепи) митохондрий, т.е. специфического блокатора продукции АФК в митохондриях. Как показано на рис. 3, ротенон имел схожий с NАЦ эффект, предотвращая изменения клеточной мембраны и морфологическую перестройку нейтрофилов в ответ на воздействие комбинации TNF?   zVADfmk. В настоящей работе исследована особая форма гибели нейтрофилов, не описанная ранее, которая индуцируется TNF? в условиях, когда имеется блок активации каспаз. Стимуляция нейтрофилов только TNF? запускает механизм «классического» апоптоза, который сопровождается включением инициаторных и эффекторных каспаз, слиянием и митохондрий, агрегацией митохондрий, интернуклеосомальной фрагментацией ДНК и типичными апоптозными изменениями цитоплазматической мембраны и морфологии клеток. При ингибировании активации каспаз нейтрофилы, обработанные TNF?, не обнаруживают перераспределения  и фрагментации ДНК. Несмотря на это, клетки погибают, экспрессируя фосфатидилсерин на внешней стороне клеточной мембраны и приобретая аберрантную морфологию  (гиперсегментированное ядро и разреженный дезинтегрированный хроматин). Очевидно, что в условиях блока активации каспаз TNF? индуцирует альтернативный «неклассический» каспазонезависимый путь клеточной  гибели нейтрофилов. Следует отметить, что этот путь специфичен для TNF? рецептора, т.к. Fas зависимый  (данные не представлены) и спонтанный апоптоз нейтрофилов полностью ингибировались zVADfmk. Дальнейшие эксперименты показали, что в реализации клеточной гибели, вызываемой TNF?   zVADfmk, участвуют АФК. В течение последних лет физиологическая роль АФК была постепенно переоценена, и АФК переместились из категории нежелательных побочных продуктов окислительного метаболизма в  группу важных сигнальных молекул передатчиков  [6]. Внутриклеточные источники АФК представлены  главным образом процессами транспорта электронов в митохондриях, а также ферментативным окислением, обеспечиваемым различными оксидазами. Система НАДФ•Ноксидазы является одним из наиболее мощных  генераторов АФК и используется нейтрофилами для уничтожения фагоцитированных микроорганизмов [19]. Вместе с тем исследованные нами нейтрофилы больных хронической грануломатозной болезнью, которые имеют дефектную НАДФ Ноксидазу [19], при воздействии TNF?   zVADfmk погибали так же, как и «здоровые» нейтрофилы (данные не представлены). Это наблюдение позволило исключить участие АФК, образованных НАДФ Ноксидазой, в «неклассической» каспазонезависимой гибели. Опыты с цитопластами нейтрофилов ясно показали митохондриальное происхождение этих АФК, поскольку цитопласты, не имеющие митохондрий, не погибали после воздействия TNF?   zVADfmk, в отличие от интактных нейтрофилов. Кроме того, ингибитор митохондриальной цепи транспорта электронов ротенон также предотвращал клеточную  гибель, индуцированную TNF?   zVADfmk, подтверждая, что митохондрии являются основным источником АФК, задействованных в этом процессе. Избыток АФК может как вызывать прямое окислительное повреждение нуклеиновых кислот, белков и липидов, так и снижать устойчивость белков к протеолизу  [5, 18]. Вероятно, подобные события происходят при  гибели нейтрофилов, вызванной TNF?   zVADfmk, обусловливая появление наблюдавшихся клеточных изменений, которые предотвращали ингибиторы АФК. Важно отметить, что митохондрии являются не только источником, но и мишенью АФК и митохондриальные АФК способны повреждать сами митохондрии, вызывая апоптоз или некроз [10, 18]. Это может объяснить обнаруженные нами независимые изменения митохондрий нейтрофилов после воздействия TNF?   zVADfmk. Несомненно, что продукция АФК находится под строгим контролем, и наши данные свидетельствуют о том, что каспазы могут участвовать в этой регуляции. Предполагается, что митохондриальные белки, вовлеченные в транспорт электронов и синтезирующие избыточные АФК, могут служить непосредственными субстратами каспаз, поскольку описаны митохондриальные каспазы с пока неизвестными внутримитохондриальными функциями [4]. В обычных условиях каспазы инактивируют эту систему, предотвращая накопление АФК. По другому сценарию каспазы могут играть роль в элиминации определенных белков и липидов, которые, представляя собой естественный канал «стока» (natural sink) излишков АФК, повреждаются и накапливаются в клетке после стимуляции TNF? [25]. Недавно был опубликован ряд работ, показавших, что ингибирование каспаз повышает чувствительность некоторых клеточных линий к цитотоксическому эффекту TNF? [9, 12, 25]. Авторы характеризовали этот тип клеточной гибели как некроз [25], «неапоптозную» гибель клеток [9], а также «переходную стадию между апоптозом и некрозом» [12]. Подобные разночтения подчеркивают сложную природу этого феномена, но в то же время диктуют необходимость применения адекватного набора методов для регистрации клеточной  гибели. Например, использование только пропидиум иодида [25] (в качестве витального красителя) представляется недостаточным для дифференцировки между некрозом и апоптозом, потому что эти фундаментально различные типы клеточной гибели в финале имеют схожее событие — разрыв цитоплазматической мембраны. Далее, уровень гибели нейтрофилов после воздействия TNF? в комбинации с ингибиторами каспаз в работах  [27, 28] был, очевидно, недооценен, т.к. для выявления клеточной гибели авторы использовали только определение фрагментации ДНК, в то время как наши результаты показали, что данный маркер апоптоза в этих условиях не обнаруживается.

Результаты, представленные в настоящей работе, затрагивают и следующую важную тему. Каспазы являются привлекательными мишенями для фармакологических вмешательств  in vivo при состояниях, ассоциируемых с усилением апоптоза [17]. Ингибиторы каспаз, преимущественно подобные  zVADfmk пептидкетоны, широко используются для «лечения» моделированных на животных заболеваний человека. Так, указанные ингибиторы оказывали положительный эффект на течение различных типов ишемическое перфузионных повреждений, а также инфекционных процессов, включая бактериальный менингит и сепсис  [17]. Тем не менее этот многообещающий подход использования ингибиторов каспаз в качестве противовоспалительных агентов должен рассматриваться с учетом вероятных побочных эффектов. Например, при ишемическореперфузионных нарушениях, и особенно при  генерализованных инфекциях, происходит значительная активация нейтрофилов и массивный выброс воспалительных цитокинов. В подобных условиях TNF?, индуцируя апоптоз нейтрофилов путем активации каспаз, обеспечивает «тихий уход» этих потенциально опасных клеток, что ведет к подавлению воспаления [20]. Напротив, ингибирование каспаз может привести к усугублению поврежедения за счет атипичной гибели нейтрофилов, описанной в настоящей работе, которая, вероятно, сопровождается высвобождением их биоагрессивного содержимого  (в противоположность апоптозной гибели). Кроме того, очевидно, что при одновременном ингибировании каспаз и воздейтвии TNF?  гибель нейтрофилов значительно усиливается, поэтому механизмы «очищения» могут стать недостаточными, чтобы удалить погибшие клетки и свести к минимуму связанное с ними повреждение. К настоящему времени возможность каспазонезависимой клеточной гибели описана для нескольких нетрансформированных типов клеток, включая Т лимфоциты  [24], нейроны  [26], эритропоэтические клетки  [22] и фибробласты  [15]. Большинство авторов воздерживается называть этот тип клеточной гибели «апоптозом» в связи с отсутствием некоторых типичных апоптозных признаков. Наши данные по нейтрофилам поддерживают эту точку зрения. Определение биологического значения и физиологической роли, а также выявление тонких механизмов этого феномена требуют дальнейших исследований.

ЛИТЕРАТУРА

1. Маянский Н.А. Состояние каспазы при подавлении апоптоза нейтрофилов  гранулоцитарномакрофагальным колониеобразующим фактором  // Иммунология. — 2001. — № 2. — С. 22–25.

2. Маянский Н.А. Субклеточное перераспределение и его слияние с митохондриями при  спонтанном апоптозе нейтрофилов  // Иммунология. — 2001. — № 6. — С. 29–32.

3. Ashkenazi A., Dixit V.M. Death  receptors:  signaling and modulation  // Science. — 1998. — Vol. 281. — P. 1305–1308. 4. Costantini P., Bruey J.M., Castedo M. et al. Preprocessed caspaseB9 contained in mitochondria participates  in apoptosis  // Cell. Death Differ. — 2002. — Vol. 9. — P. 82–88.

5. Davies K.J., Lin S.W., Pacifici R.E. Protein damage and degradation by oxygen radicals. IV. Degradation of denatured protein // J. Biol. Chem. — 1987. — Vol. 262. — P. 9914–9920.

6. Finkel T. Oxygen  radicals and signaling // Curr. Opin. Cell. Biol. — 1998. — Vol. 10. — P. 248–253.

7. GarciaCalvo M., Peterson E.P., Leiting . et al. Inhibition of human caspases by peptidebased and macromolecular inhibitors // J. Biol. Chem. — 1998.— Vol. 273. — P. 32608–32613.

8. Goossens V., Grooten J., De Vos K., Fiers W. Direct evidence for tumor necrosis facB torBinduced mitochondrial reactive oxygen intermediates and their involvement in cytotoxicity // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. — 1995. — Vol. 92. — P. 8115–8119.

9. Khwaja A., Tatton L. Resistance to the cytotoxic effects of tumor necrosis fac tor alpha can be overcome by inhibition of a FADD/caspasedependent signal ing pathway // J. Biol. Chem. — 1999. — Vol. 274. — P. 36817–36823.

10. Lee H.C., Wei Y.H. Mitochondrial role in life and death of the cell // J. Biomed. Sci. — 2000. — Vol. 7. — P. 2–15.

11. Liu J., Marino M.W., Wong G. et al. TNF is a potent antiBinflammatory cytokine in autoimmune mediated demyelination // Nat. Med. — 1998. — Vol. 4. — P. 78–83.

12. Luschen S., Ussat S., Scherer G. et al. Sensitization to death receptor cytotoxB icity by inhibition of fasBassociated death domain protein (FADD)/caspase sigB naling. Requirement of  cell  cycle progression  //  J. Biol. Chem. — 2000. — Vol. 275. — P. 24670–24678.

13. Maianski N.A., Mul F.P.J., van Buul J.D. et al. Granulocyte colonystimulating factor  inhibits  the mitochondriaBdependent activation of  caspase  in neuB trophIL-s // Blood. — 2002. — Vol. 99. — P. 672–679.

14. Marino M.W., Dunn A., GraIL- D. et al. Characterization of  tumor necrosis  fac tordeficient mice  // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. — 1997. — Vol. 94. — P. 8093–8098.

15. Miyazaki K., Yoshida H., Sasaki M. et al. Caspaseindependent cell death and mitochondrial disruptions observed in the Apaf1deficient cells // J. Biochem (Tokyo). — 2001. — Vol. 129. — P. 963–969.

16. Murray J., Barbara J.A., Dunkley S.A. et al. Regulation of neutroph IL- apoptosis by  tumor necrosis  factorBalpha:  requirement  for TNFR55 and TNFR75  for  inB duction of apoptosis in vitro // Blood. — 1997. — Vol. 90. — P. 2772–2783.

17. Nicholson D.W. From bench to clinic with apoptosisBbased therapeutic agents // Nature. — 2000. — Vol. 407. — P. 810–816.

18. Richter C., Gogvadze V.,  Laffranchi R. et al. Oxidants  in mitochondria:  from physiology to diseases // Biochim. Biophys. Acta. — 1995. — Vol. 1271. — P. 67–74.

19. Roos D., Curnutte  J.T. Chronic granulomatous disease.  In: Primary approach immunodeficiency diseases. A molecular and genetic / Ed. by H.D. Ochs, C.I.E. Smith, J.M. Puck. — New York: Oxford Univ Press, 1999. — P. 353–374.

20. SavIL-l J., Fadok V. Corpse clearance defines the meaning of cell death // Nature. — 2000. — Vol. 407. — P. 784–788.

21. SchulzeBOsthoff K., Bakker A.C., Vanhaesebroeck . et al. Cytotoxic activity of tumor necrosis factor is mediated by early damage of mitochondrial functions. Evidence  for the  involvement of mitochondrial  radical generation // J. Biol. Chem. — 1992. — Vol. 267. — P. 5317–5323.

22. Somerva IL-le T.C., Linch D.C., Khwaja A. Growth factor withdrawal from primary human erythroid progenitors induces apoptosis through a pathway involving glyco gen synthase kinase and // Blood. — 2001. — Vol. 98. — P. 1374–1381.

23. Tracey K.J., Cerami A. Tumor necrosis  factor, other  cytokines  and disease  // Annu. Rev. Cell. Bioll. — 1993. — Vol. 9. — P. 317–343.

24. Uzzo R.G., Dulin N., Bloom T. et al. Inhibition of NFkappaB  induces caspaseB independent  cell death  in human T  lymphocytes  // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2001. — Vol. 287. — P. 895–899.

25. Vercammen D., Beyaert R., Denecker G. et al. Inhibition of caspases increases the sensitivity of L929 cells to necrosis mediated by tumor necrosis factor // J. Exp. Med. — 1998. — Vol. 187. — P. 1477–1485.

26. Volbracht C.,  Leist M., Kolb S.A., Nicotera P. Apoptosis  in  caspaseinhibited neurons // Mol. Med. — 2001. — Vol. 7. — P. 36–48.

27. Weinmann P., Gaehtgens P., Walzog . BclBXLB and B?mediated regulation of apoptosis of human neutrophIL-s  via  caspaseB3  // Blood. — 1999. — Vol. 99.— P. 3106–3115.

28. Yamashita K., Takahashi A., Kobayashi  et al. Caspases mediate tumor necrosis factorBalphaBinduced neutroph IL- apoptosis and downregulation of reactive oxygen production // Blood. — 1999. — Vol. 93. — P. 674–685.

Caspaseindependent cell death in human neutrophIL-s induced by TNF? N.A. Maianski, D. Roos, T.W. Kuijpers Sanquin Research at CLB, and Landsteiner Laboratory, Academic Medical Centre, University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands

 Objectives:  To  study mechanisms of  TNF?induced neutroph IL- cell death. Materials and Methods: Hu man neutroph IL-  cell death  induced by  TNF?  in  the presence or absence of general  caspase  inhibitor zVADfmk and several antioxidants was studied by means of AnnexinV/PI staining and morphological examination of  the  cytospin preparations. Activation of  caspase8 and  3 was monitored by Western blotting, DNA laddering was investigated by agarose gel electrophoresis, mitochondria and Bax protein were analyzed by confocal microscopy. NeutrophIL-derived cytoplast were prepared by discontinuos gra dient ultracentrifugation. Results: TNF? alone induced apoptotic cell death in neutrophIL-s within 6 hours of culturing with characteristic apoptotic features, which coincided with activation of caspase8 and 3. However, when  caspases were  inhibited by  zVADfmk,  stimulation with  TNF?  stIL-l  caused neutrophIL- cell death. This type of cell death lacked nuclear features of apoptosis and demonstrated no Bax redis tribution, but did  show mitochondria  clustering and plasma membrane  changes. Experiments with a scavenger of reactive oxygen species (ROS) and with an inhibitor of mitochondrial respiration and with neutrophIL-derived cytoplasts (which lack mitochondria) indicated that TNF?   zVAD*fmkinduced cell death depends on mitochondriaderived ROS. Conclusion:  TNF?  can  induce a «classical»  caspasede pendent apoptosis and a «nonclassical» caspaseindependent cell death in human neutrophIL-s.

Key words: neutrophIL-s, apoptosis, TNF?, caspases, caspase inhibitors, antioxidants.



загрузка...