загрузка...
 
А.А. Останин, О.Ю. Леплина, Е.Я. Шевела, Е.Р. Черных, В.И. Коненков ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск Оценка цитокинового профиля у больных с тяжелым сепсисом методом проточной флюориметрии  (Bio Plex анализа)
Повернутись до змісту

А.А. Останин, О.Ю. Леплина, Е.Я. Шевела, Е.Р. Черных, В.И. Коненков ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск Оценка цитокинового профиля у больных с тяжелым сепсисом методом проточной флюориметрии  (Bio Plex анализа)

Целью работы была интегральная оценка сывороточного уровня 19 цитокинов у хирургических больных  с  тяжелым  сепсисом, а  также при клинической манифестации  септического шока. При обследовании больных (n = 14) выявлены Т клеточно моноцитарные иммунные дисфункции, одним из механизмов развития которых является сдвиг баланса регуляторных сывороточных факторов в сторону иммуносупрессорных и противовоспалительных медиаторов. Оценка уровня цитокинов в сыворотке крови с использованием иммуноферментного и BioPle xанализа показала, что по сравнению со здоровыми донорами у больных сепсисом повышено содержание IL1Ra, общего  IL10,  IL6 и MIP1,  тогда как концентрация про воспалительных цитокинов (IL1  TNF, IL12, IL17) достоверно не изменялась. В отдельных случаях регистрировали высокие концентрации  IL8  (у 50 % больных), МСР/1  (28,6 %), GM/CSF  (35,7 %) и G/CSF  (21,4 %). Выявлена прямая взаимосвязь между уровнем IL1Ra, общего IL10, MIP/1 со степенью тяжести больных (APACHE/II) и выраженностью полиорганной недостаточности  (SOFA). Показано, что больные  с септическим шоком характеризуются наиболее  глубоким угнетением митогенной реактивности Т клеток, более низким уровнем экспрессии DR/молекул на моноцитах, выраженной иммуносупрессорной и противовоспалительной активностью сывороточных факторов, а также более высоким  содержанием  IL1Ra, общего  IL10,  IL6,  IL8, G/CSF, GM/CSF, MCP1 и MIP1. 

Таким образом, выявленные изменения параметров иммунного и цитокинового статуса у больных с тяжелым сепсисом свидетельствуют о преобладании у них противовоспалительных и иммуносупрессорных реакций, развитие которых «маскируется» клиническими проявлениями синдрома системного воспалительного ответа. (Цитокины и воспаление. 2004. Т. 3, № 1. С. 20–27.)

Ключевые слова: цитокины, BioPlex, сепсис, шок, полиорганная недостаточность.

Гнойносептические заболевания и осложнения представляют сферу исключительного внимания для хирургов самых разных специальностей в силу своей распространенности и высокого уровня летальности [2, 10, 21]. Как известно, возбудителем хирургических инфекций является условнопатогенная грамположительная и или грамотрицательная микрофлора [1]. Бактериальные патогены выступают в роли триггера клеток иммунного реагирования, активация которых приводит к запуску сложного каскада цитокиновых взаимодействий, лежащих в основе развития врожденных (неспецифических) и приобретенных (специфических) реакций иммунитета. Механизмам естественной резистентности, которые являются одним из компонентов воспалительной реакции, отводят доминирующую роль в защите от условнопатогенной микрофлоры. При незначительном количестве возбудителя резерва тканевых, гуморальных и клеточных факторов, как правило, хватает для эффективной инактивации и элиминации патогена посредством его опсонизации и фагоцитоза. В случае массивной бактериальной контаминации или неэффективности локального ответа происходит диссеминация инфекции, что клинически манифестирует развитием генерализованного внутрисосудистого воспаления  (сепсиса). Клиническая картина сепсиса многогранна, обусловлена токсическим поражением различных органов и тканей и может проявляться циркуляторными расстройствами, нарушениями свертывающей системы крови, кардио и нефропатией, развитием токсического гепатита, неврологическими расстройствами и острой дыхательной недостаточностью [8]. Указанные дисфункции и нарушения лежат в основе синдрома полиорганной недостаточности (ПОН) [4, 14]. За последнее десятилетие представление о патогенезе сепсиса и ПОН существенно расширилось [5, 10, 12, 13]. Стало очевидным, что ответная реакция со стороны клеток иммунной системы на бактериальную агрессию носит двухфазный характер. Первая фаза сопряжена с продукцией провоспалительных цитокинов, участвующих в организации воспалительного ответа. Вторая обусловлена выбросом противовоспалительных медиаторов и направлена на ограничение воспаления. При этом чрезмерная выраженность или продолжительность той или иной фазы может негативно сказываться на течении и исходе заболевания. Так, например, считается, что избыточная продукция про воспалительных цитокинов может индуцировать развитие шока, тогда как пролонгированные противовоспалительные реакции сопряжены с формированием  глубокой иммунодепрессии, что во многом предопределяет летальный исход на поздних этапах  гнойносептического процесса. Следует отметить, что бимодальная концепция течения септического процесса опирается преимущественно на данные экспериментальных исследований и теоретические представления о закономерностях развития системной воспалительной реакции  [12, 13]. В то же время практически полностью отсутствуют прямые доказательства взаимосвязи между характером изменений цитокинового баланса и клиническими особенностями сепсиса, в частности, связанными с манифестацией шока или формированием поли органных нарушений. До последнего времени такая ситуация являлась объективной и во многом была обусловлена уровнем развития лабораторно диагностической базы исследований. Понятно, что для корректной оценки состояния цитокинового баланса требуется одномоментная оценка содержания нескольких цитокинов из оппозитных подгрупп (Th1 и Th2, про и противовоспалительных цитокинов). Определение концентрации в крови какогото одного из них, например TNF ? или IL4, может оказаться недостаточно информативным. В современных условиях наметился определенный прорыв в области диагностической медицины, который связан с разработкой и внедрением в практику автоматизированного анализатора нового поколения производства компании BioRad  (USA). Предложенная технология позволяет проводить количественное исследование до 100 различных белков и пептидов в одном тестируемом образце [15]. В частности, в настоящее время разработаны коммерческие тест системы для определения 17 цитокинов, относящихся к различным, функционально значимым группам. Создание диагностических систем, позволяющих осуществить множественный анализ параметров цитокинового статуса человека, открывает определенные перспективы в изучении сложного каскада цитокиновых взаимодействий, вовлеченных в развитие большинства патофизиологических процессов. Целью настоящей работы явилась интегральная оценка сывороточного уровня Th1 и Th2, про и противовоспалительных цитокинов, хемокинов у хирургических больных с тяжелым сепсисом/ПОН, а также при клинической манифестации септического шока. Материалы и методы В исследование были включены 14 больных с хирургическим сепсисом (57 % мужчин и 43 % женщин, средний возраст 49,6 ± 4,0 лет), находящихся в отделении реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ). При этом 86 % (12/14) пациентов были обследованы в раннем послеоперационном периоде  (в среднем на 3 и сут.) и двое больных—в более поздние сроки (на 7 е и 10 е сут). В сформированной группе у 5 пациентов  регистрировали  абдоминальный  и  у  3 — раневой сепсис. Кроме того, было обследовано 6 больных с гнойнодеструктивными  заболеваниями бронхолегочного аппарата (абсцедирующая пневмония, пиопневмоторакс) и  средостения  (медиастенит). У подавляющего большинства больных (93 %, 13/14) регистрировался эндотоксикоз  тяжелой или крайне  тяжелой степени. При  этом в целом по  группе отмечался выраженный лейкоцитоз (20,0 ± 2,5 ? 109/л), значительное увеличение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) (45,2 ± 3,5 мм/ч) и лейкоцитарного индекса интоксикации  (ЛИИ)  (7,9 ± 1,5 расч. ед.). Диагноз  тяжелого  сепсиса определяли в  соответствии  с рекомендациями Чикагской согласительной конференции [11] по следующим критериям: 1) наличие очага инфекции; 2) клиническая манифестация  синдрома  системного воспалительного ответа (SIRS); 3) наличие синдрома полиорганной недостаточности. Степень  тяжести больных определяли по шкалам APACHE II и SAPS [19, 20]. В первом случае средний балл составил 17,7 ± 2,1 баллов, во втором—13,2 ± 1,2 баллов, что позволяло прогнозировать вероятную летальность на уровне 30 %. Для оценки  тяжести полиорганной недостаточности использовали шкалу SOFA [3], при этом средний балл в целом по  группе составил 7,3 ± 1,1. В структуре органных дисфункций чаще других регистрировались дыхательная недостаточность (86 % случаев), дисфункция ЦНС (78 %), сердечнососудистая недостаточность (43 %) и относительно реже почечная и печеночная дисфункции (35,5 и 7,5 % случаев соответственно). В  группе больных, вошедших в исследование, 6 человек было обследовано на пике клинической манифестации  септического шока. В послеоперационном периоде, в  условиях ОРИТ, всем больным проводилась антибактериальная терапия (с использованием карбапенемов, цефалоспоринов IV поколения, аминогликозидов  II поколения, фторхинолонов), а также комплексная интенсивная  терапия в необходимом объеме. При проведении иммунологических исследований из венозной цельной или гепаринизированной крови выделяли стандартными методами лейковзвесь,  сыворотку, мононуклеарные клетки  (МНК). МНК в концентрации 0,1  ? 106/лунку культивировали в 96 луночных круглодонных планшетах в полной культуральной среде RPMI 1640 (Sigma, USA) при 37 °С в СО2инкубаторе. Для стимуляции клеток использовали конканавалин А (КонA, 15 мкг/мл, Sigma) и растворимые моноклональные анти CD3 антитела  (антиCD3мАТ  ICO90) («Медбиоспектр», Москва) в концентрации 1 мкг/мл. Интенсивность пролиферации оценивали через 72 ч после включения  3Н тимидина (1 мкКи/лунку). Методом проточной цитофлюориметрии  (FACS Calibur, Becton Dickinson), используя соответствующие моноклональные антитела («Сорбентсервис», Москва), определяли содержание различных субпопуляций лимфоцитов (CD3+, CD4+ и СD8+ Т лимфоцитов, CD20+ В лимфоцитов, CD16+ NK клеток), а так же относительное количество моноцитов, высоко экспрессирующих HLADR антигены, и средний уровень экспрессии (mean fluorescence, MF) HLADRмолекул на моноцитах. Методом проточной цитофлюориметрии  среди  свежевыделенных клеток лейковзвеси определяли  также процентное содержание апоптотических лимфоцитов, нейтрофилов и моноцитов, которые вследствие фрагментации ДНК формируют характерный гиподиплоидный пик при окрашивании йодидом пропидия (50 мкг/мл) (Sigma, USA). Наличие в сыворотке больных иммуносупрессорной активности оценивали по степени снижения КонА индуцированной пролиферации МНК  здоровых доноров  (n = 2–3) при  содержании 10 %  интактной сыворотки больных (опыт—О) по сравнению с уровнем ответа при содержании 10 % интактной сыворотки доноров  (контроль — К). При  этом рассчитывали индекс супрессорной активности (ИСА) по следующей формуле: ИСА = О–К. О  суммарной активности  эндогенных медиаторов воспаления в  сыворотке больных  судили по величине индекса воспалительной активности  (ИВА). Сущность метода  заключается в том, что в лейковзвеси здоровых доноров (n = 2–3), инкубированной в  течение 45 мин  с интактной  сывороткой больных (опыт) или доноров (контроль) в объемном соотношении 1 : 1, определяют активность нейтрофилов по продукции перекиси водорода  (Н2О2). ИВА высчитывают по формуле: ИВА = О–К. Содержание в сыворотке крови 17 цитокинов  (IL1?, TNF?, IFN?, IL2, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL10, IL12 (p70), IL13, IL17, GCSF, GMCSF, МСР1, MIP1?) оценивали методом проточной флюориметрии на 2лучевом лазерном автоматизированном анализаторе  (BioPlex Protein Assay System, BioRad, USA)  с использованием коммерческих  тестсистем 17Plex  (определяемый динамический диапазон 2–32000 пкг/мл) в  соответствии с инструкцией фирмы производителя. Метод основан на специфическом связывании исследуемых цитокинов с твердой фазой, которая представляет  собой  суспензию полистироловых  гранул размером 5,5 мкм. Одновременно в анализе используется 17 типов гранул, каждый из которых различается  собственной флюоресцентной меткой и конъюгирован  с соответствующими моноклональными антицитокиновыми антителами. После  специфического  связывания  гранул  с цитокинами,  содержащимися в исследуемых образцах  сыворотки и в калибровочных пробах  с известным их количеством, в реакционную  смесь добавляют антицитокиновые антитела, конъюгированные  с биотином. Для детекции образовавшейся «сэндвичструктуры» используют взаимодействие биотина со  стрептавидином, меченным «репортерной» флюоресцентной меткой (фикоэритрином). Постановка всех реакций происходит в 96 луночном планшетном формате. Оценка результатов проводится на проточном флюориметре,  где  гранулы автоматически разделяются по  типам  с использованием их собственных  FITC меток, а количество  связавшихся  с ними цитокинов оценивается по  суммарной интенсивности флюоресценции фикоэритрина. С помощью  стандартных калибровочных разведений концентрация исследуемых 17 цитокинов в  тестируемых образцах сыворотки высчитывается автоматически на персональном компьютере  с использованием программы «BioPlex Manager». Дополнительно оценивали сывороточный уровень рецепторного антагониста  IL1  (IL1Ra) методом иммуноферментного анализа  (тест системы производства ООО  «Цитокин»,  Санкт Петербург, определяемый динамический диапазон 150–2500 пкг/мл). Кроме того, оценивали уровень общей фракции IL10 (в свободной и связанной форме)  с помощью иммуноферментных  тест систем «Accucyte Human  IL10»  (Cytimmune  Inc., USA, определяемый динамический диапазон 0,195–200 нг/мл). Математическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере  с использованием пакета программ «STATISTICA 5,0». Таблицы содержат информацию  в  виде  средних  арифметических  величин  (М)  и стандартных ошибок  средних  (SE). Сравнение вариационных рядов осуществляли  с помощью непараметрического U критерия Вилкоксона—Манна—Уитни. Корреляционный  анализ проводили методом ранговой корреляции по Спирману. Результаты и обсуждение Сравнительная оценка показателей иммунного статуса здоровых доноров и больных с тяжелым сепсисом выявила наличие у больных лабораторных признаков комбинированного Т клеточно моноцитарного иммунодефицита (табл. 1). Иммунологические нарушения проявлялись в виде снижения относительного количества CD3+ Т клеток, HLAD Rhigh моноцитов и уровня экспрессии на них DR молекул, 2 кратного увеличения доли апоптотических лимфоцитов в сочетании с достоверно более низким уровнем апоптоза свежевыделенных нейтрофилов, а также угнетения митогенной реактивности Т клеток. При этом регистрировалось снижение пролиферативного ответа Т лимфоцитов как при стимуляции анти CD3 антителами по классическому пути активации  (через мембранный комплекс CD3ТCR), так и при стимуляции Кон А по альтернативному пути активации (через адгезивные молекулы). При сравнении суммарной биологической активности сывороточных факторов было установлено, что, несмотря на наличие у больных с тяжелым сепсисом четких клинических проявлений SIRS, их сыворотки не проявляли какой либо про воспалительной активности  (ИВА  в  целом  по  группе  составлял 0,94 ± 0,07 расч. ед.). При этом важно отметить, что у 64 % больных (9/14) обнаруживалась противовоспалительная активность и их сыворотки в среднем на 23 % ингибировали продукцию активных форм кислорода клетками здоровых доноров (ИВА 0,77 ± 0,02 расч. ед.). Кроме того, в 100 % случаев сыворотки больных отличались выраженной супрессорной активностью и почти на 40 % подавляли пролиферативный ответ МНК доноров. Полученные данные свидетельствуют о сдвиге баланса регуляторных факторов преимущественно в сторону иммуносупрессорных  противовоспалительных медиаторов, который происходит у больных с тяжелым сепсисом/ ПОН и может, как было показано ранее, являться одним из механизмов развития иммунных нарушений [6, 7]. Для проверки данного предположения мы провели комплексную оценку системного уровня 19 основных цитокинов, используя традиционный иммуноферментный анализ и BioPlex технологию (табл. 2). В результате было установлено, что в отличие от здоровых доноров больные с тяжелым сепсисом характеризуются достоверно более высоким уровнем IL1Ra и повышенным содержанием общего IL10. Кроме того, у больных регистрировалось значимое увеличение концентрации мультифункционального цитокина IL6, который, как известно, на начальных этапах септического процесса вместе с IL1? выступает в качестве индуктора острофазового ответа, но в последующем в большей степени проявляет свои противовоспалительные и иммуносупрессорные свойства [22]. Важно отметить, что при тяжелом сепсисе нами не было обнаружено в системном кровотоке повышенного содержания про воспалительных цитокинов  (IL1?, TNF?,  IL12,  IL17). Средний уровень этих цитокинов находился на нижней границе чувствительности метода. Другим интересным фактом является то, что у больных содержание

Таблица  1 Сравнительная оценка показателей иммунного статуса в группах здоровых доноров и хирургических больных с тяжелым сепсисом/ПОН

 

Примечания. n — количество наблюдений; данные представлены в виде M ±  SE, где М —  средняя  арифметическая,  SE —  стандартная  ошибка; MF  (mean  fluorescence) —  средняя интенсивность флуоресценции  в усл. ед.;   достоверность различий между  группами:  pU < 0,05;  pU < 0,01,  где рU — непараметрический  критерий Вилкоксона — Манна — Уитни

в сыворотке регуляторных Th1 и Th2 цитокинов (IFN?, IL2 и IL4, IL5, IL13) также было минимальным. Отсутствие достоверного снижения IFN? и увеличения IL4, IL5 и IL13 свидетельствует о том, что выявленные нами при сепсисе изменения суммарной биологической активности сывороточных факторов не связаны напрямую с переключением Th1/Th2. Можно полагать, что механизмы развития Т клеточных дисфункций при сепсисе являются общими как для Th1, так и для Th2 лимфоцитов и связаны с пребыванием их в состоянии анергии [9]. В целом по группе обследованных больных отмечалось недостоверное увеличение колониестимулирующих факторов  (GCSF и GMCSF). Их уровень у большей части больных находился на нижней границе чувствительности метода, но, тем не менее, в отдельных случаях отчетливо регистрировался, составляя в среднем 22,5 ± 5,3 и 42,0 ± 12 пкг/мл соответственно  (GCSF—у 3 и GMCSF—у 5 из 14 больных). Учитывая лейкоцитоз, который у 87 % больных варьировал от 11 до 34,8 ? 109/л, а также выраженные изменения в лейкоцитарной формуле крови (индивидуальные

Таблица  2 Характеристика цитокинового статуса здоровых доноров и больных с тяжелым сепсисом/ПОН

 

Примечание. Достоверность различий показателей между  группами:  pU < 0,05;  pU <  0,01.

значения ЛИИ у больных составляли от 3,3 до 24 расч. ед.), можно предположить, что на момент обследования нами были выявлены «следовые» концентрации GCSF и GMCSF, пик продукции которых, вероятно, приходился на более ранние этапы септического процесса. Сравнительный анализ содержания в сыворотке крови хемокинов показал трехкратное увеличение у больных тяжелым сепсисом концентрации макрофагального белка воспаления (MIP1?, хемокин СС семейства). В отличие от MIP1?, который регистрировался у 100 % больных,  IL8  (хемокин СХС семейства) и макрофагальный хемотаксический фактор  (МСР1, хемокин СС семейства) обнаруживались не у всех пациентов. Так, например,  IL8 был выявлен в 50 %  (7/14) случаев, а МСР 1—у 28,6 % (4/14) больных, при этом содержание IL8 и МСР1 составляло в среднем 26,0 ± 11 и 282,0 ± 69 пкг/мл соответственно. Корреляционный анализ показал наличие значимых прямых взаимосвязей между уровнем цитокинов (IL1Ra, общего IL10, IL6) и хемокинов (IL8, MCP1, MIP1?) (данные не представлены). При этом сывороточная концентрация  IL1Ra, общего IL10 и MIP1? четко ассоциировалась со степенью тяжести больных (APACHEII) и выраженностью  полиорганной  недостаточности (SOFA). Значения коэффициентов корреляции между уровнем данных цитокинов  и  балльной оценкой по соответствующим шкалам варьировали от 0,44 до 0,7 (p < 0,05). Учитывая  результаты корреляционного анализа,  закономерно  было предположить взаимосвязь между исследуемыми параметрами иммунного/цитокинового статуса и клиническими особенностями септического процесса. Для проверки данной  гипотезы  были сформированы две подгруппы больных. В одну из них вошли больные, которые на момент обследования  находились  в фазе септического шока (n = 6). Оппозитную группу составили пациенты со стабильными показателями  гемодинамики (n = 8). Из данных, представленных в табл. 3, видно,  что  на  пике  шока больные с тяжелым сепсисом отличались глубоким угнетением митогенной реактивности Т клеток, более низким уровнем экспрессии DR молекул на моноцитах, выраженной иммуносупрессорной и противовоспалительной активностью сывороточных факторов. При этом в крови больных регистрировался более высокий уровень IL1Ra, общего IL10, IL6, IL8, GCSF, GMCSF, MCP1 и MIP1?. Несмотря на проводимую комплексную интенсивную и качественную антибактериальную терапию, по данным катамнеза, летальность в подгруппе пациентов с септическим шоком составила 66,7 % (умерло 4 из 6 больных). В оппозитной подгруппе все больные с тяжелым сепсисом/ПОН выжили. Для  того чтобы оценить, каким образом изменяется цитокиновый профиль в динамике развития септического процесса, двое пациентов, оппозитных по наличию шока, были обследованы повторно,  с интервалом между исследованиями 6  сут. В  табл. 4 представлены результаты лабораторного мониторинга, из которых видно, что  у больной Д. в динамике заболевания отмечается резкое падение  уровня  IL1Ra от 2500 до 529 пкг/мл, а также регистрируется двукратное снижение общего IL10 и MIP1?. Концентрация IL6, IL!8, GCSF, GMCSF и MCP1 сохранялась на минимальном уровне. На момент повторного обследования  у больной отмечалась положительная клиническая динамика. Снизился лейкоцитоз  (с 32,0 до 17,3 ? 109/л) и ЛИИ (с 24,0 до 2,2 расч. ед.), возросло абсолютное количество лимфоцитов  (с 0,64 до 3,9 ? 109/л), уменьшилась степень тяжести общего состояния (APACHE— с

Таблица  3 Показатели иммунитета у доноров и в подгруппах больных, оппозитных по наличию септического шока

 

Примечания. MF  (mean fluorescence) —  средняя интенсивность флуоресценции в  усл.  ед.; достоверность различий между подгруппами больных:    pU < 0,05; pU < 0,01.

Таблица  4 Цитокиновый статус в динамике развития септического процесса

 

Примечание. № 1 и 2 — результаты лабораторного мониторинга  сывороточного  уровня цитокинов  (интервал между исследованиями —  6  сут).

16,8 до 11, SAPS—с 15 до 9 баллов) и полиорганной недостаточности (с 7 баллов по шкале SOFA с поражением двух органных систем до 3 баллов по одной системе). По данным катамнеза, длительность пребывания больной в ОРИТ составила 18 сут, в стационаре—34 сут, после чего больная была выписана в  удовлетворительном  состоянии. Больная Ч. на момент первичного обследования в  течение 48 ч находилась в состоянии шока, что диктовало необходимость контуитивного использования инотропных препаратов для коррекции показателей  гемодинамики. Повторное исследование цитокинового  статуса проводилось через 72 ч после стабилизации гемодинамики и отмены инотропной поддержки  (длительность шока  составила 5  сут). При  этом  уровень  IL1Ra  сохранялся  стабильно высоким  (2500 пкг/мл) и отмечалось незначительное снижение общего IL10, концентрация которого,  тем не менее, более чем в 3 раза превышала средние  значения  здоровых доноров. В то же время у больной происходила нормализация уровня IL6 и GSF. Анализ содержания в  сыворотке  хемокинов показал умеренное снижение IL8, MCP1 и MIP1?, однако их концентрация попрежнему в несколько раз превышала физиологический уровень. В динамике наблюдения  состояние больной сохранялось стабильно тяжелым, хотя и отмечалось некоторое улучшение  клиниколабораторных показателей и регрессия ПОН (суммарная оценка по шкалам APACHE, SAPS и SOFA снизилась соответственно с 18 до 12, с 20 до 14 и с 15 до 8 баллов). Было отмечено снижение лейкоцитоза  (с 22,6 до 8,0 ? 109/л), в  то же время ЛИИ  сохранялся на уровне 4,3–5,2 расч. ед., а абсолютное количество лимфоцитов уменьшилось в 3 раза (с 3,16 до 1,12 ? 109/л). По  данным  катамнеза, длительность пребывания больной в ОРИТ  составила 36  сут, в стационаре— 63 сут, после чего больная была выписана в  удовлетворительном  состоянии. В  целом  полученные данные  демонстрируют выраженные изменения параметров иммунного и цитокинового  статуса  у больных с тяжелым сепсисом, что может свидетельствовать о преобладании у них противовоспалительных  иммуносупрессорных реакций, развитие которых «маскируется» клиническими проявлениями синдрома  системного воспалительного ответа(SIRS). Ранее в качестве простого, диагностического теста для оценки фазного характера течения сепсиса и интегрального параметра, отражающего состояния цитокинового баланса, нами было предложено использовать биологическую (супрессорную и воспалительную) активность сыворотки [6, 7]. Настоящее исследование подтверждает адекватность такого подхода. Так, обследованные нами больные отличались не только выраженной супрессорной (ИСА = 0,59 ± 0,04 расч. ед.), но и в ряде случаев— заметной противовоспалительной активностью сывороточных факторов  (ИВА = 0,77 ± 0,02 расч. ед. у 64 % больных). При этом комплексная оценка 18 цитокинов, выполненная с использованием иммуноферментного анализа и Bio Plex технологии, показала высокое содержание в сыворотке крови больных сепсисом именно противовоспалительных  иммуносупрессорных цитокинов, таких как IL1Ra, IL10, IL6 и MIP1? [21]. В то же время, сывороточная концентрация про воспалительных цитокинов  (IL1?, TNF?,  IL2,  IL17) была незначительной и достоверно не отличалась от показателей здоровых доноров. Парадоксально, но сдвиг баланса в сторону иммуносупрессорных  противовоспалительных медиаторов, регистрируемый как на уровне суммарной биоактивности сыворотки, так и на уровне отдельных цитокинов (IL1Ra, общего IL10, IL6, MIP1?), в наибольшей степени проявлялся в подгруппе больных с септическим шоком. Вероятно, такая картина свидетельствует о максимально напряженной работе механизмов негативного контроля, которые, тем не менее, не могут полностью блокировать избыточные проявления SIRS в виде угрожающих нарушений гемодинамики. Не исключено также, что уровень цитокинов в циркуляции отражает только «верхушку айсберга», тогда как у больных с тяжелым сепсисом/ПОН и особенно с септическим шоком патофизиологические процессы, связанные с действием различных про воспалительных медиаторов и цитокинов, разворачиваются преимущественно в органах и тканях, и, таким образом, остаются вне досягаемости для изучения. Тем не менее, схожие изменения цитокинового профиля со сдвигом баланса в сторону противовоспалительных  иммуносупрессорных медиаторов были показаны и в других работах при исследовании крови больных с тяжелым сепсисом [16], фебрильной лихорадкой  [23], а также у пациентов с септическими осложнениями после ожоговой травмы  [24] или трансплантации костного мозга [18]. При этом многими авторами отмечается четкая взаимосвязь между выраженностью цитокинового дисбаланса и характером течения и исходом заболевания. Нами также установлена прямая корреляционная связь (rs = 0,44–0,77) концентрации в крови  IL1Ra, общего  IL10 и MIP1?  со  степенью тяжести больных (APACHEII) и выраженностью полиорганной недостаточности (SOFA). Кроме того, мониторинг цитокинового статуса у отдельных больных показал, что положительная клиническая динамика септического процесса и регрессия ПОН ассоциируются с четкой тенденцией к нормализации исходно повышенного уровня цитокинов  (IL1Ra общего  IL10,  IL6) и хемокинов (MIP1?, IL8, MCP1). К сожалению, несмотря на все преимущества, которые получает исследователь при изучении цитокинов с использованием BioPlex анализа, данная технология пока не позволяет ответить наряд существующих вопросов. Так, среди разработанных в настоящее время тест систем отсутствуют наборы для определения некоторых ключевых цитокинов (например, TGF?, IL1Ra), а так же растворимых рецепторов цитокинов (sTNFR I и II типа, sIL1R II типа, sIL2R). Кроме того, Bio Plex анализ позволяет оценивать цитокины только в свободной форме, тогда как полученные нами результаты показывают, что сывороточный уровень, например, общего IL10 (т. е. в растворимой и связанной форме) значительно отличается от концентрации свободной фракции этого цитокина. Следует также выделить и другие проблемы, о которых всегда необходимо помнить при проведении исследований в области цитокиновых взаимодействий. Они связаны, например, с выраженным влиянием на активность цитокинов аллельного полиморфизма кодирующих генов, с различиями в содержании и или активности цитокинов на системном и локальном  (тканевом) уровне, с динамическими изменениями цитокинового профиля на различных этапах развития того или иного патофизиологического процесса и т. д. В заключение хотелось бы кратко обсудить еще один важный аспект. Существующие в настоящее время международные интегральные шкалы оценки степени тяжести органных нарушений (SOFA, MODS) описывают такие дисфункции, как дыхательная или сердечнососудистая недостаточность, почечнопеченочная дисфункция, дисфункция ЦНС, однако совсем не учитывают наличие и  степень тяжести нарушений в системе иммунитета  [2, 3, 8]. Нами показано, что проявлением ПОН у больных сепсисом является не только снижение витальных функций (дыхания, сосудистого тонуса и т. д.), но и развитие глубокой иммунодепрессии. Более того, можно полагать, что тяжелые иммунные дисфункции являются не просто ранним и надежным признаком развивающегося синдрома полиорганной недостаточности, но, по видимому, во многом обеспечивают его возникновение и последующее прогрессирование. К сожалению, современная иммунология еще не смогла выделить и предложить клиницистам простого и надежного лабораторного теста, эффективного в оценке степени тяжести органной дисфункции по системе иммунитета. С развитием современных технологий в области диагностической медицины исследование цитокинов, возможно, станет «рутинной» процедурой, как, например, измерение содержания билирубина или креатинина в сыворотке крови. Однако при определении степени тяжести печеночной или почечной дисфункции по шкале SOFA нельзя исключать, что анализ уровня какого либо цитокина или  группы цитокинов будет необходимым условием более полной и адекватной оценки ПОН по всем жизненно важным системам организма, включая иммунную. Авторы выражают искреннюю благодарность Е.И. Стрельцовой,  заведующей ОРИТ Новосибирской областной клинической больницы,  за высококвалифицированную помощь в клинической части исследований, Б.В. Протопопову, представителю компании BioRad в России, за консультации и необходимую техническую поддержку, а также М.И. Мусатову и И.Г. Раковой за участие в совместной работе при проведении BioPlex анализа.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бочоришвили В.Г., Бочоришвили Т.В. Новая иммунологическая концепция сепсиса и ее клиническое  значение  //  Int.  J.  Immunorehabilitation. — 1997. — № 6. — C. 20–26.

2. Гельфанд Е.Б., Гологорский В.А., Гельфанд Б.Р. Абдоминальный сепсис: интегральная оценка тяжести состояния больных и полиорганной дисфункции // Анест. реаним. — 2000. — № 3. — С. 29–33.

3. Интенсивная терапия: Пер с англ. — М.: ГЭОТАР, Медицина, 1998. — 639 с.

4. Конычев А.В. Синдром полиорганной недостаточности при сепсисе // Вестн. хирургии. — 1988. — Т. 140, № 5. — C. 139–144.

5. Лебедева P.H., Полуторнова Т.В. Hекоторые аспекты патогенеза и лечения полиорганной недостаточности // Анест. реаним. — 1995. — № 2. — C. 83–88.

6. Останин А.А., Леплина О.Ю., Тихонова М.А. и др. Хирургический сепсис. I. Иммунологические маркеры системной воспалительной реакции // Вестн. хирургии. — 2002. — Т. 161, № 3. — С. 101–107.

7. Останин А.А., Леплина О.Ю., Тихонова М.А. и др. Цитокин опосредованные механизмы развития системной иммуносупрессии у больных с гнойнохирургической патологией // Цитокины и воспаление. — 2002. — Т. 1, № 1. — С. 38–45.

8. Руднов В.А. Сепсис: терминология, патогенез, оценка тяжести и интенсивная терапия // Вестн. инт. терапии. — 1997. — № 3. — С. 33–36.

9. Черных Е.Р., Леплина О.Ю.,  Тихонова М.А. и др. Феномен  Т клеточной анергии при хирургическом сепсисе // Мед. иммунология. — 2003. — Т. 5, № 6. — С. 455.

10. Balk R.A. Sepsis and  septic  shock // Crit. Care. Cliniсs. — 2000. — Vol. 16, № 2. — P. 179–192.

11. Bone R.C., Balk R.A., Cerra F.B. et al. ACCP/SCCM consensus conference. Definitions  for sepsis and organ  failure and guidelines  for  the use of  innovative therapies in sepsis // Chest. — 1992. — Vol. 101. — P. 1644–1655.

12.Bone R.C. Sir Isaac Newton, sepsis, SIRS, and CARS // Crit. Care. Med. — 1996.   — Vol. 24. — P. 1125–1129.

13. Bone R.C., Godzin C.J., Balk R.A. Sepsis: a new hypothesis  for pathogenesis of the disease process // Chest. — 1997. — Vol. 112. — P. 235–243.

14. Carrico C.J., Meakins J.L., Marshall J.C. et al. Multiple organ failure syndrome // Arch. Surg. — 1985. — Vol. 121, № 1. — P. 196–208.

15. Carson R., Vignali D. Simultaneous quantitation of fifteen cytokines using a multiplexed  flow cytometric assay // J. Immunol. Meth. — 1999. — Vol. 227. — P. 41–52.

16. Cogos C.A., Drosou E., Bassaris H.P., Skoutelis A. Pro! versus antinflammatory cytokine profile  in patients with severe sepsis: a marker  for prognosis and  future  therapeutic options.  //  J.  Infec. Dis. — 2000. — Vol. 181, № 1. — P. 176–180.

17. Curfs J.H.A.J., Meis J.F.G.M., HoogkampKorstanje J.A.A. A primer on cytokines:  sources,  receptors, effects and  inducers  // Clin. Microbiol. Rev. — 1997. — Vol. 10, № 4. — P. 742–780.

18. Hempel L., Korholz D., Nussbaum P. et al. High  interleukin10 serum  levels are associated with fatal outcome in patients after bone marrow transplantation // Bone Marrow Transplant. — 1997. — Vol. 20, № 5. — P. 365–368.

19. Knaus W.A., Wagner D.P., Draper E.A. et al. APACHE II: a severity of disease clas! sification system // Crit. Care Med. — 1985. — Vol. 13. — P. 818–829.

20. Le Gall J.R., Lemeshow S., Saulnier F. A new simplified acute physiology score (SAPS II) based on a European/North American multicenter study // JAMA. — 1993. — Vol. 270. — P. 2957–2963.

21. Pinner R.W., Teutsch S.M., Simonson L. et al. Trends in disease mortality in the United States // JAMA. — 1996. — Vol. 275. — P. 189–193.

22.Tilg H., Dinarello C.A., Mier J.W. IL!6 and APPs: anti!inflammatory and im! munosuppressive mediators  //  Immunol. Today. — 1997. — Vol. 18, № 9. — P. 428–432.

23. Van Dissel J.T., van Langevelde P., Westendorp R.G.W. et al. Anti!inflammatory cytokine profile and mortality  in febrile patients // Lancet. — 1998. — Vol. 351. — P. 950–953.

24. Yeh F.L., Lin W.L., Shen H.D. Changes in circulating levels of an antiinflammatory cytokine interleukin 10 in burned patients // Burns. — 2000. — Vol. 26, № 5. — P. 454–459.

The assessment of cytokine pattern in patients with severe sepsis using the Bio/Plex/protein assay system A.A. Ostanin, O.Yu. Leplina, E.Ya. Shevela, E.R. Chernykh, V.I. Konenkov Institute of Clinical Immunology, Siberian Branch of RAMS, Novosibirsk

The goal of current study was  the multiplex quantitative measurement of 18 cytokines  in sera of pa/ tients with  severe  sepsis,  including  septic  shock.  The development of  combined  T/cell/monocyte  im/ mune disorders due to the cytokine balance shift following the increase of immunosupressive and anti/ inflammatory mediators was  revealed  in patients  (n = 14) with  severe  sepsis.  The measurement of cytokines using ELISA and Bio/Plex assay showed that in contrast to healthy donors the septic patients were characterized by increased serum level of IL1Ra, total IL10, IL6 and MIP1? ? ? ? ?, whereas the concentrations of pro/inflammatory cytokines (IL/1? ? ? ? ?, TNF? ? ? ? ?, IL12, IL17) were near/normal. The elevated levels of IL8 (50 % of cases), МСР/1 (28,6 %), GM/CSF (35,7 %), and G/CSF (21,4 %) were detected in some patients. The high concentrations of IL/1Ra, total IL/10 and MIP/1? ? ? ? ? were associated with se/ verity  indexes  including Acute Physiology And Chronic Health Evaluation  (APACHE/II) and Sepsis/re/ lated Organ Failure Assessment (SOFA) scores.  It was also shown  that  the septic shock patients were characterized by 1) more prominent depression of T/cell proliferative response in vitro, 2) marked de/ crease of HLA/DR expression in monocytes, 3) enhanced supressive and anti/inflammatory activities of serum  in a bioassay, and 4) higher  level of IL/1Ra, total IL/10, IL/6, IL/8, G/CSF, GM/CSF, MCP/1 and MIP/1? ? ? ? ?. Our data indicate the predominance of anti/inflammatory/immunosupressive reactions in pa/ tients with severe sepsis  that are «masked» by  the clinical signs of systemic  inflammatory  response syndrome (SIRS). (Cytokines and Inflammation. 2004. Vol. 3, № 1. P. 20–27.)

Key words: cytokines, BioPlex, sepsis, septic shock, multiorgan deficiency syndrome.



загрузка...