Н.А. Хонина , И.В. Айзикович , Е.Я. Шевела , М.А. Тихонова , Е.А. Ладыгина , А.Е. Белова , М.А. Дегтярев , Н.М. Пасман , А.А. Останин , Е.Р. Черных ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск; Медицинский центр «Авиценна», г. Новосибирск Регуляторные факторы и цитокины в сыворотке и фолликулярной жидкости у женщин при контролируемой овариальной гиперстимуляции
Известно, что течение беременности ассоциировано с преобладанием Th2/Th3 цитокинов. Однако остается неясным, на каком этапе гестационного периода инициируются изменения цитокинового баланса. Исходя из этого, целью работы было исследование биологической активности фолликулярной жидкости (ФЖ) и сыворотки крови, а также оценка содержания ряда цитокинов в ФЖ женщин на этапе стимуляции гиперовуляции по программе экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Обследовано 30 женщин, которым проводили процедуру ЭКО, а также 10 здоровых женщин с физиологичным менструальным циклом. Установлено, что в первые дни менструального цикла сыворотки крови женщин по характеру активности регуляторных факторов значимо не отличались от референтных значений здоровых доноров. В то же время в период овуляции регистрировалось появление иммуносупрессорной и противовоспалительной активности. Сыворотки женщин с овариальной гиперстимуляцией обладали супрессорным, более выраженным противо воспалительным и апоптоз стимулирующим действием. Выявленные изменения биологической активности регуляторных факторов регистрировались как на системном (в сыворотке крови), так и на местном (в ФЖ) уровне. При оценке уровня цитокинов в ФЖ, тем не менее, были выявлены цитокины как с провоспалительной/иммуностимулирующей (IL1? TNF?, IL8, IL2), так и противовоспалительной/иммуносупрессорной активностью (IL4, IL(1Ra). При этом отмечалась ин( дивидуальная вариабельность исследуемых параметров. Корреляционный анализ выявил прямую связь количества зрелых ооцитов и формирующихся эмбрионов с уровнем IL2 в ФЖ (rS = 0,48 и rS = 0,55; p < 0,05, соответственно). Однако высокое содержание IL2 в ФЖ было сопряжено также с развитием осложнения ЭКО в виде синдрома гиперстимуляции яичников. В то же время, выявлена четкая зависимость между иммуносупрессорной и противовоспалительной активностью ФЖ и биохимическим маркером наступившей беременности уровнем хорионического гонадотропина. Полученные данные позволяют предположить, что цитокины с провоспалительной/иммуностимулирующей активностью участвуют в регуляции созревания яйцеклетки, тогда как формирующийся на пике овуляции сдвиг баланса регуляторных факторов в сторону медиаторов с иммуносупрессорной/противовоспалительной активностью определяет эффективность имплантации эмбриона и, повидимому, способствует дальнейшему развитию беременности. (Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 2. С. 38–44.)
Ключевые слова: цитокины человека, сыворотка крови, фолликулярная жидкость, экстракорпоральное оплодотворение.
Согласно современным представлениям, этапы созревания яйцеклетки, имплантации и развития эмбриона являются цитокинзависимыми процессами и контролируются иммунной системой. Основные продуценты цитокинов—иммунокомпетентные клетки (ИКК) локализованы во всех органах генитального тракта женщины—яичниках, эндометрии матки, влагалище [11, 20, 21]. В настоящее время клеткам иммунной системы и продуцируемым ими цитокинам уделяется особое внимание, поскольку признается, что нормальное течение гестационного периода во многом зависит от эффективности иммунных механизмов поддержания толерантности к аллоантигенам плода. Среди них наиболее исследованной является неспецифическая супрессия, обусловленная действием иммуносупрессорных цитокинов. Так, установлено, что развитие нормальной беременности ассоциировано с Th1/Th2,Th3 переключением на местном (децидуальные лимфоциты) и системном (периферические лимфоциты) уровнях, что приводит к смещению баланса в сторону им муносупрессорных цитокинов (IL4, IL10, TGF?) [17, 18]. Th2/Th3 цитокины ингибируют реакции клеточного иммунитета и стимулируют выработку антител, способных разрушать циркулирующие аллоантигены, что способствует нормальному течению беременности [8, 12]. Однако остается неясным, на каком этапе происходит изменение цитокинового баланса—к моменту имплантации эмбриона или на более поздних этапах беременности. Таким образом, иммунная регуляция ранних этапов, включая созревание фолликулов и имплантацию оплодотворенной яйцеклетки, остается практически не изученной. Известно, что ИКК, локализованные в зоне фолликула, способны продуцировать широкий спектр цитокинов, посредством которых могут осуществлять местный контроль за созреванием фолликула и, возможно, определять функциональные свойства яйцеклетки. Развитие и внедрение в клиническую практику современных репродуктивных технологий, в частности, методов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) сделало возможным исследование фолликулярной жидкости (ФЖ). В результате, появились данные о присутствии в ФЖ цитокинов как с иммуностимулирующими провоспалительными (IL1? и IL1?, IL2, IL6, TNF?, IFN?), так и иммуносуп рессорными/противовоспалительными (TGF?, IL1Ra, IL10, IL4) свойствами [4, 6, 8, 15, 19]. Предполагается, что некоторые цитокины с провоспалительной активностью, например IL1? и TNF? участвуют в регуляции созревания яйцеклетки. В свою очередь, цитокины с противовоспалительной/иммуносупрессорной активностью, повидимому, обеспечивают имплантацию эмбриона и способствуют его нормальному развитию в ранние сроки беременности [17, 18]. Несмотря на интерес к данной проблеме, проявления локальной и системной иммуносупрессии на самых ранних этапах гестационного периода— в период имплантации—остаются во многом неисследованными. При этом определение уровня отдельных цитокинов в ФЖ или сыворотке без учета их биологической активности не всегда позволяет корректно оценить доминирующую направленность действия той или иной группы регуляторных факторов. Интерес к вопросам цитокиновой регуляции на начальных этапах репродуктивного процесса не является чисто теоретическим и во многом связан с клиническими запросами. Эффективность ЭКО в настоящее время не превышает 35 %, и околотрети всех беременностей прерывается на ранних сроках. Поэтому исследование уровня цитокинов и их интегральной биологической активности представляет несомненный интерес в плане обоснования новых подходов к прогнозу имплантации и успешного течения беременности при ЭКО. Следует также указать, что проводимая на этапе подготовки к ЭКО стимуляция гиперовуляции имеет в 5–10 % случаев ятрогенное осложнение в виде последующего развития синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ), патогенез которого во многом обусловлен действием провоспалительных цитокинов [2, 13]. Следовательно, анализ уровня цитокинов и биологической активности регуляторных факторов ФЖ может послужить так же основой для прогноза развития СГЯ. Таким образом, целью настоящей работы явилось исследование биологической активности ФЖ и сыворотки крови, а также оценка содержания ряда цитокинов в ФЖ у женщин на этапе контролируемой стимуляции гиперовуляции с учетом исхода ЭКО и развития СГЯ. Материалы и методы В исследование были включены 30 женщин после завершения этапа контролируемой овариальной гиперстимуляции по программе ЭКО, а также 10 здоровых женщин с физиологичным менструальным циклом. Обследованные женщины были сопоставимы по возрасту, при этом в основной группе возраст пациенток варьировал от 24 лет до 41 года (32,3 ± 3 года), длительность бесплодия в среднем составила 5,3 года. У 80 % женщин (24/30) был выявлен сочетанный характер бесплодия, включающий трубно:перитонеальный и эндокринный факторы. Исследования сыворотки крови и фолликулярной жидкости были проведены на пике овуляции, в день пункции яичников по программе ЭКО. У 8 из 30 женщин в начале лютеиновой фазы был диагностирован СГЯ легкой степени, проявляющийся наличием жидкости в перитонеальной полости и умеренным болевым синдромом. В контрольной группе анализ биологической активности сыворотки крови проводили на 2–4:е сутки и в середине менструального цикла, соответствующего периоду овуляции. Все исследования выполнялись после получения информированного согласия обследуемых женщин. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из периферической крови стандартно в градиенте плотности фиколлаве рографина. Клетки в концентрации 0,1 ? 106/лунку культивировали в 96:луночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований в среде RPMI:1640 (Sigma, USA), дополненной 0,3 мг/мл L:глютамина, 5 мМ буфера HEPES, 100 мкг/мл гентамицина и 10 % инактивированной сыворотки доноров АВ(IV) группы. Для стимуляции клеток использовали конканавалин А (КонА, Sigma, USA) в концентрации 15 мкг/мл. Интенсивность пролиферации оценивали радиометрически по включению 3H:тимидина (1 мкКи/лун: ку), вносимого за 18 ч до окончания культивирования. Наличие в сыворотке или ФЖ супрессорной активности определяли по степени снижения КонА:индуцированной пролиферации МНК здоровых доноров (n = 3) в присутствии 10 % интактной сыворотки или ФЖ обследуемых женщин (опыт) в сравнении с уровнем митогенного ответа в присутствии 10 %интактной сыворотки доноров (контроль). Полученные результаты выражали в виде индекса влияния (ИВ1), рассчитанного по следующей формуле: ИВ1 =О ? К. Значения ИВ1 менее 0,85 расч. ед. свидетельствовали об иммуносупрессорной активности регуляторных факторов. О суммарной активности медиаторов, контролирующих воспалительную реакцию, судили по способности исследуемых образцов (сыворотка или ФЖ женщин) стимулировать (воспалительная активность) или ингибировать (противовоспалительная активность) интенсивность продукции перекиси водорода нейтрофилами здоровых доноров. Для этого клетки лейковзвеси доноров (n = 3) инкубировали в течение 45 мин при 37 °С с исследуемыми образцами (опыт) или сывороткой здоровых доноров (контроль) в объемном соотношении 1:1 и определяли активность нейтрофилов по продукции Н2О2. Индекс влияния (ИВ2) рассчитывали по формуле: ИВ2 =О ? К. Значения ИВ2 более 1,56 расч. ед. свидетельствовали о наличии воспалительной активности в тестируемых образцах. ИВ2 менее 0,94 расч. ед. расценивался как проявление противо: воспалительной активности регуляторных факторов. Апоптоз:модулирующую активность сыворотки крови исследовали по степени изменения уровня апоптоза лимфоцитов здоровых доноров (n = 3), культивированных в течение 18 ч в присутствии 20 % интактной сыворотки или ФЖ обследуемых женщин (опыт) в сравнении с уровнем апоптоза в присутствии 20 % интактной сыворотки доноров (контроль). Полученные результаты выражали в виде индекса влияния (ИВ3), рассчитанного по формуле: ИВ3 =О ? К. Значения ИВ3 более 1,38 расч. ед. свидетельствовали об апоптоз:стимулирующей активности, менее 0,90 расч. ед.—об апоптоз:ингибирующей активности регуляторных факторов в исследуемых образцах. Уровень апоптоза лимфоцитов определяли методом ПЦР на лазерном клеточном сортере:анализаторе FACSCalibur (Becton Dickinson, USA) с помощью окрашивания клеток иодидом пропидия (Sigma, USA) в конечной концентрации 50 мкг/мл. Процентное содержание апоптотических клеток рассчитывалось по одномерной гистограмме оранжевой флуоресценции клеток (FL2:A), отнесенных к лимфоцитарному региону. Апоптоти: ческие клетки, ДНК которых подвергалась фрагментации, формировали характерный гиподиплоидный пик. Концентрацию цитокинов (TNF?, IL:1?, IL:8, IL:4, IL:1Ra) вфолликулярной жидкости женщин и сыворотках здоровых доноров определяли с помощью иммуноферментных тест:систем (ООО «Цитокин», СПб.) в соответствии с инструкцией фирмы:производителя. Содержание IL:2 оценивали в биотесте по интенсивности пролиферации лимфобластных клеток здоровых доноров (n = 3), полученных в результате 6:дневного культивирования МНК доноров с фитогемагглюти: нином в дозе 10 мкг/мл. После культивирования клетки отмывали, ре: суспендировали в культуральной среде и использовали в качестве IL2:чувствительных мишеней. К лимфобластам (0,1 ? 106/лунку в 0,1 мл) добавляли по 0,05 мл исследуемых образцов и параллельно—рекомбинантный IL:2 («Ронколейкин», Биотех, СПб.) в серийных разведениях. Активность IL:2, выраженную в ЕД/мл, оценивали по усилению пролиферативного ответа лимфобластов через 72 ч культивирования. Полученные результаты соотносили с активностью рекомбинантного IL:2 с помощью калибровочной кривой. В качестве референтных, нормативных показателей био: логической активности сыворотки и уровня циркулирующих цитокинов использовали значения, полученные при обследовании здоровых доноров крови в возрасте от 18 до 45 лет. Математическую обработку полученных результатов проводили методами описательной и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы «Statistica 5.0». Результаты и обсуждение Первоначально было проведено сравнительное исследование биологической активности сыворотки крови здоровых доноров и женщин в различные периоды физиологического менструального цикла и на пике овуляции после проведения контролируемой гиперстимуляции яичников по программе ЭКО. Из данных табл. 1 видно, что в первые дни физиологического менструального цикла сыворотки крови женщин не оказывали существенного влияния на пролиферативный ответ лимфоцитов и продукцию нейтрофилами перекиси водорода и по характеру активности регуляторных факторов значимо не отличались от соответствующих референтных значений здоровых доноров. В то же время, в период овуляции в сыворотках крови женщин регистрировалось появление супрессорной и противовоспалительной активности, о чем свидетельствует достоверное снижение ИВ1 и ИВ2, соответственно. При этом у
Таблица 1 Биологическая активность сыворотки крови доноров и женщин в различные фазы менструального цикла и при контролируемой овариальной гиперстимуляции
Примечание. Данные представлены в виде средних значений ± стандартная ошибка. LQ–UQ — диапазон квартильных отклонений. достоверность различий по сравнению с доно: рами и группой женщин в начальной фазе физиологического менструального цикла; по сравнению с овуляторным периодом физиологического цикла (рU < 0,05, U — критерий Вилкоксона—Манна—Уитни). Н.д. — нет данных.
подавляющего большинства обследованных женщин индивидуальные значения этих показателей выходили за нижнюю границу нормативных диапазонов (ИВ1 < 0,85 и ИВ2 < 0,94 расч. ед. в 100 % и 80 % случаев). Выраженная супрессорная активность сыворотки отмечалась также в подгруппе женщин при проведении контролируемой овариальной гиперстимуляции, однако в этом случае дополнительно регистрировалось значимое усиление противовоспалительной активности регуляторных факторов (ИВ2 0,42 ± 0,03 vs 0,77 ± 0,06 расч. ед., pu < 0,05). Таким образом, полученные данные свидетельствуют об изменении у женщин баланса сывороточных факторов в сторону доминирования медиаторов/цитокинов с иммуносупрессорной/противовоспалительной активностью в овуляторный период менструального цикла, особенно после проведения контролируемой гиперстимуляции яичников по программе ЭКО. Известно, что баланс цитокинов в значительной степени определяет чувствительность клеток крови (лимфоцитов, нейтрофилов) к апоптозу [5, 10, 16]. В частности, цитокины с провоспалительной иммуностимулирующей активностью обладают протективным действием, тогда как противовоспалительные/иммуносупрессорные цитокины усиливают апоптоз лимфоцитов нейтрофилов [3]. Сравнение апоптозмодулирующей активности регуляторных факторов показало, что в отличие от здоровых доноров сыворотки женщин на пике стимулированной гиперовуляции отличались выраженным проапоптогенным действием (ИВ3 1,61 ± 0,16 vs 1,18 ± 0,06 расч. ед., р < 0,05). При этом индивидуальные значения ИВ3 в группе обследованных женщин варьировали от 0,9 до 3,0 расч. ед., выходя за верхнюю границу нормативного диапазона в 56 % случаев. Полученный факт дополнительно свидетельствует о сдвиге баланса цитокинов в сторону медиаторов с иммуносупрессорной противовоспалительной активностью, который происходит у женщин в овуляторный период при контролируемой гиперстимуляции яичников по программе ЭКО. Наряду с сывороткой крови также была исследована биологическая активность образцов фолликулярной жидкости, полученной при пункции яичников и выделении яйцеклеток у женщин, которым проводилась процедура ЭКО. Следует особо отметить, что в 100 % случаев тестируемые образцы ФЖ обладали ингибирующей активностью и подавляли как интенсивность пролиферации, так и продукции Н2О2 в культурах клеток здоровых доноров (рисунок). В группе обследованных женщин индивидуальные значения ИВ1 не превышали 0,85, а показатели ИВ2 были ниже 0,94 расч. ед. Помимо супрессорной и противовоспалительной активности исследуемые образцы ФЖ в 90 % случаев (у 27 из 30 женщин) отличались выраженным проапоптогенным действием (ИВ3 > 1,38 расч. ед). Таким образом, изменение биологической активности регуляторных факторов в сторону доминирования медиаторов цитокинов с иммуносупрессорной и противовоспалительной активностью у женщин при проведении контролируемой овариальной гиперстимуляции наблюдается не только на системном, но и на местном уровне. Согласно данным литературы, характер биологической активности сыворотки крови отражает состояние цитокинового баланса. Так, например, нами показано, что преобладание в сыворотке больных сепсисом воспалительной или супрессорной активности проявляется увеличением соотношения TNF?/IL4 или IL1Ra/TNF?, соответственно [1]. В настоящее время постулируется, что развитие нормальной беременности ассоциировано с Th1/Th2,3 переключением [17, 18], что также может сопровождаться изменением суммарной биологической активности регуляторных факторов как на местном, так и на системном уровне. Не исключено, что такое переключение может происходить на самых ранних этапах—в момент овуляции. Поэтому помимо оценки биологической активности фолликулярной жидкости в отдельной серии экспериментов была исследована концентрация в ФЖ ряда цитокинов, оппозитных по своим функциональным характеристикам (TNF?, IL1?, IL8, IL2 vs IL4, IL1Ra). Как следует из данных табл. 2, все 6 анализируемых цитокинов выявлялись в образцах ФЖ. При этом обращал на себя внимание большой разброс индивидуальных значений исследуемых параметров.
Рисунок. Биологическая активность сыворотки крови и фолликулярной жидкости у женщин при контролируемой овариальной гиперстимуляции
Примечание. Данные представлены в виде средних значений (n = 30) индексов влияния сывороток и образцов фолликулярной жидкости на интенсивность про: лиферации (ИВ1 ), продукции перекиси водорода (ИВ2 ) и уровень апоптоза (ИВ3 ) в культурах клеток здоровых доноров (см. «Материалы и методы»).
Таблица 2 Содержание цитокинов в сыворотке здоровых доноров и фолликулярной жидкости женщин при контролируемой овариальной гиперстимуляции
Примечание.рU <0,05; достоверность различий по сравнению с сыворотками крови по непараметрическому критерию Вил:
Концентрация IL2, IL1? и IL8 была сопоставима с уровнем содержания этих цитокинов в сыворотке крови здоровых доноров. Вместе с тем, в образцах ФЖ отмечалось достоверно более высокий уровень TNF?. По сравнению с сывороткой крови здоровых доноров достоверных различий в содержании в ФЖ иммуносупрессорных цитокинов (IL4, IL1Ra) выявлено не было. Так, концентрация IL4 в ФЖ у большинства женщин не превышала 8 пкг/мл, и только в одном случае составила 172 пкг/мл. Умеренное увеличение уровня IL1Ra было статистически недостоверным. Можно полагать, что выявленная нами супрессорная активность ФЖ обусловлена действием других цитокинов, например, IL10, TGF? или каких-либо еще не исследованных нами регуляторных факторов. Учитывая вариабельность концентрации различных цитокинов в ФЖ у женщин, включенных в программу ЭКО, на следующем этапе была предпринята попытка проанализировать, имеется ли сопряженность между уровнем отдельных цитокинов и биологической активностью ФЖ с эффективностью оплодотворения и имплантации эмбрионов, а также развитием осложнений ЭКО в виде СГЯ. Известно, что способность яйцеклетки к оплодотворению зависит от степени зрелости ооцитов. Поскольку данный процесс контролируется гормонами и цитокинами, эффективность оплодотворения может ассоциироваться с уровнем содержания различных цитокинов в ФЖ. Исходя из этого, был проведен корреляционный анализ между концентрацией в ФЖ исследованных нами цитокинов и количеством ооцитов и оплодотворенных яйцеклеток, который выявил прямую взаимосвязь этих показателей с уровнем IL2 в ФЖ (rs = 0,48 и rs = 0,55; p < 0,05, соответственно с количеством зрелых ооцитов и формирующихся эмбрионов). Сопоставление исследуемых параметров биоактивности ФЖ с биохимическим маркером ранней беременности—уровнем хорионического гонадотропина человека (ХГЧ)—выявило корреляционную взаимосвязь с противовоспалительной и иммуносупрессорной активностью регуляторных факторов (rs = –0,74; p < 0,01 и rs = –0,64; p < 0,05). Следовательно, можно полагать, что формирующийся на пике овуляции сдвиг баланса регуляторных факторов в сторону цитокинов медиаторов с иммуносупрессорной противовоспалительной активностью определяет эффективность последующей имплантации эмбриона и во многом способствует успешному развитию беременности. Достоверных взаимосвязей между уровнем содержания в ФЖ других исследуемых цитокинов и эффективностью ЭКО выявлено не было, что, повидимому, обусловлено недостаточным числом наблюдений (n = 8). В дальнейшем мы планируем продолжить исследования спектра регуляторных факторов в ФЖ у женщин, которым проводятся вспомогательные репродуктивные технологии, с помощью разработанного компанией BioRad автоматизированного анализатора нового поколения, который позволяет одновременно тестировать в одном образце до 17 основных цитокинов. Ретроспективный анализ содержания цитокинов в ФЖ у женщин, оппозитных по развитию синдрома гиперстимуляции яичников, выявил достоверные различия лишь в уровне активности IL2. Так, в подгруппе 8 женщин с диагностированным СГЯ содержание IL2 в ФЖ варьировало от 2,5 до 10 ЕД/мл, составляя в среднем 5,1 ± 1,2 ЕД/мл. В то же время в оппозитной подгруппе (n = 9) средний уровень IL2 составил 2,6 ± 0,3 ЕД/мл (pu < 0,05), а индивидуальные значения активности IL2 не превышали 4 ЕД/мл. Суммируя полученные в целом данные можно заключить, что созревание фолликулов у женщин при контролируемой овариальной гиперстимуля коксона—Манна—Уитни. ного количества наблюдений нам пока не удалось связать уровень отдельных цитокинов с супрессорной, противовоспалительной или проапоптогенной активностями ФЖ. Тем не менее, была выявлена достоверная корреляционная взаимосвязь между супрессорной противовоспалительной активностью ФЖ и биохимическим маркером наступившей беременности—уровнем ХГЧ. Следовательно, можно полагать, что регуляторные факторы с супрессорной противовоспалительной активностью имеют принципиальное значение для успешной имплантации эмбриона и начального периода беременности. Полученные данные согласуются с исследованиями M. Dirnteld et al. [7], в которых показано, что ФЖ обладает супрессорной активностью, причем в успешных циклах ЭКО ФЖ характеризовалась более выраженным иммуносупрессорным потенциалом. В отношении роли цитокинов с провоспалительной/иммуностимулирующей активностью можно полагать, что они участвуют в регуляции созревания яйцеклетки. Так, имеются сведения о вовлеченности в этот процесс IL1 и TNF? [14]. Однако при избыточной продукции указанные цитокины могут приводить к преждевременной лютеинизации фолликулов, что коррелирует с низкими показателями фертилизации и повышает вероятность преждевременного прерывания беременности [6]. Развитие СГЯ является трудно прогнозируемым осложнением при проведении контролируемой овариальной гиперстимуляции. Литературные данные указывают на возможную роль иммунорегуляторных цитокинов в развитии СГЯ. Так, имеются сообщения о повышении уровня TNF? и IL2 в перитонеальной жидкости при развитии СГЯ, концентрация которых снижается при улучшении клинических показателей и симптомов заболевания. [13]. Полученные нами данные свидетельствуют, что высокое содержание IL2 в ФЖ ассоциировано с развитием синдрома гиперстимуляции яичников в ходе проведения процедуры ЭКО. Высокая активность IL2 может быть связана с созреванием большого количества ооцитов, что часто встречается при развитии СГЯ. Нами впервые была обнаружена позитивная корреляционная связь между уровнем IL2 и количеством эмбрионов, что также указывает на возможную роль IL2 в созревании яйцеклеток. Таким образом, баланс цитокинов как на системном, так и на местном уровне оказывает существенное влияние на течение беременности, начиная с самых ранних этапов ее развития. Соответственно дальнейшие исследования локальной и системной продукции цитокинов открывают перспективы для обоснования новых подходов к прогнозу и повышению эффективности вспомогательных репродуктивных технологий.
ЛИТЕРАТУРА
1. Останин А.А., Леплина О.Ю., Тихонова М.А. и др. Цитокин:опосредованные механизмы развития системной иммунодепрессии у больных с гнойно:хи: рургической инфекцией // Цитокины и воспаление. — 2002. — Т. 1, № 1. — С. 38–45.
2. Abramov Y., Schenker J.G., Lewin A. Plasma inflammatory cytokines correlate to the ovarian hyperstimulation syndrome // Hum. Reprod. — 1996. — Vol. 11. — P. 1381–1386.
3. Ayala A., Chung C.:S., Song G.Y. IL:10 mediation of activation:induced Th1 cell apoptosis and lymphoid dysfunction in polymicrobial sepsis // Cytokine. — 2001. — Vol. 14. — P. 37–48.
4. Buscher U., Chen F.C., Kentenich H., Schiady H. Cytokines in the follicular flu: id of stimulated and nonstimulated human ovaries; is ovulation a suppressed inflammatory reaction // Hum. Reprod. — 1999. — Vol. 14. — P. 162–166.
5. Colotta F., Re F., Polentarutti N., Sozzani S., Mantovani A. Modulation of gran: ulocyte survival and programmed cell death by cytokines and bacterial prod: ucts // Blood. — 1992. — Vol. 80. — P. 2012–2020.
6. Chen H.F., Ho H.N., Chen S.U. IL:1beta is increased in the follicular fluids of patients with premature luteinization // Am. J. Reprod. Immunol. — 1995. — Vol. 34. — P. 356–362.
7. Dirnteld M., Lahat N., Daniel:Spiegel E. Immunosupressive properties of follicu: lar fluid and media conditioned by zygotes correlate with subsequent concep: tion in IVF // Am. J. Reprod. Immunol. — 2002. — Vol. 48. — P. 329–333.
8. Hammadeh M.E., Ertan A.K., Zeppezauer M., Baltes S. Immunoglobulins and cy: tokines level in follicular fluid in relation to etiology of infertility and their relevance to IVF outcome // Am. J. Reprod. Immunol. — 2002. — Vol. 47. — P. 82–90.
9. Kelemen K., Pardi A. Tinneberg H. Early recognition of pregnancy by immune system // Am. J. Reprod. Immunol. — 1998. — Vol. 39. — P. 351–355.
10. Lee A., Whyte M.K., Haslett C. Inhibition of apoptosis and prolongation of neu: trophil functional longevity by inflammatory mediators // J. Leuk. Biol. — 1993. — Vol. 54. — P. 283–288.
11. Maccio A., Vantovani G., Turnu E. et al. Evidence that granulosa cells inhibit IL:1a and IL2 production from follicular lymphomonocytes // Assist. Reprod. Genet. — 1993. — Vol. 10. — P. 517–522.
12. Margni R.A., Zenclussen A.C. During pregnancy, in the context of Th2:type cytokine profile, serum IL6 levels might condition the quality of the synthesized antibodies // Am. J. Reprod. Immunol. — 2001. — Vol. 46. — P. 181–187.
13. Mathur R.S., Jenkins J.M., Bansal A.S. The possible role of the immune system in the aetiopathogenesis of ovarium hyperstimulation syndrom // Hum. Re: prod. — 1997. — Vol. 12. — P. 2629–2634.
14. Mendoza C., Cremades N., Ruiz:Requena E., Martinez F. Relationship between fertilization results after ICSI, and intrafollicular steroid, pituitary hormone and cytokine concentrations // Hum. Reprod. — 1999. — Vol. 14. — P. 628–635.
15. Moncayo H.E., Penz:Koza A., Marth C. VEGF in serum and in the follicular fluid of patients undergoing hormonal stimulation for invitro fertilization // Hum. Reprod. — 1998. — Vol. 13. — P. 3310–3314.
16. Moulding D.A., Walter C., Hart C.A., Edwards S.W. Effects of staphylococcal enterotoxins on human neutrophil functions and apoptosis // Infect. Immun. — 1999. — Vol. 67. — P. 2312–2138.
17. Piccini M.P., Scaletti C., Vultaggio A., Maggi E. Defective production of LIF, M:CSM and Th2:type cytokines by T cells at fetomaternal interface is associated with pregnancy loss // J. Reprod. Immunol. — 2001. — Vol. 52. — P. 35–43.
18. Raghupathy R. Pregnancysuccess and failure within the Th1/Th2/Th3 para: digm // Semin. Immunol. — 2001. — Vol. 13. — P. 219–227.
19.Runesson E., Bostrom E.K., Janson P.O., Branstrom M. The human preovu: latory follicleis a source of the chemotactic cytokine IL:8 // Mol. Hum. Reprod. — 1996. — Vol. 2. — P. 245–250.
20. Vassiliadou N., Bulmer J.N. Characterization of endometrial T lymphocyte subpopulations in spontaneous early pregnancy loss // Hum. Reprod. — 1998. — Vol. 13. — P. 44–47.
21. Vassiliadou N., Bulmer J.N. Quantitative analysis of T lymphocyte subsets in pregnant and nonpregnant human endometrium // Biol. Reprod. — 1996. — Vol. 55. — P. 1017–1022.
22. Wu M.Y., Chen H.F., Chen S.U. Increase of the production of IL10 early after implantation is related to the success of pregnancy // Am. J. Reprod. Immu: nol. — 2001. — Vol. 49. — P. 386–392.
Regulatory factors and cytokines in serum and follicular fluid in women with controlled ovarian hyperstimulation N.A. Khonina1 , I.V. Aizikovich2 , E.Ya. Shevela1 , M.A. Tihonova1 , E.A. Ladygina2 , A.E. Belova2 , M.A. Degtyaryov2 , N.M. Pasman1 , A.A. Ostanin1 , E.R. Chernykh1 1 Institute of Clinical Immunology Siberian Branch of RAMS, Novosibirsk; 2 «Avicenna» Medical Center, Novosibirsk Pregnancy is associated with predominance of Th2/Th3 cytokines. However, it is still debatable whether the shift of cytokine balance is triggered during initialfor example, during embryo implantation) or late stages of pregnancy. The aim of the study was to evaluate the biological activity of follicular fluid (FF) and serum with the measurement of cytokines in FF, in women with controlled ovarian hyperstimulation following invitro fertilization (IVF). 30 IVF patients and 10 healthy women with regular menstrual cycle were examined. Biological activity of the womens sera at the beginning of natural menstrual cycle was similar to that in healthy donors, whereas in ovulation phase sera exhibited significantly enhanced immunosuppressive and antiinflammatory activities. Suppressive, marked antiinflammatory, and apoptosis(stimulating activity was also revealed in IVF patients with controlled ovarian hyperstimulation both on systemic (in blood serum), and on local (in follicular fluid) levels. Nevertheless, the pro(inflammatory/immunostimulatory (IL1?, TNF?, IL8, IL2) as well the antiinflammatory/immunosuppressive (IL4, IL1Ra) cytokines were detected in FF from women undergoing IVF. In individual cases the remarkable scatter of cytokines content was noted. However, IL(2 values correlated positively with the number of mature oocytes and embryo quantity (rS = 0,48 и rS = 0,55; p < 0,05 respectively). High level of IL2 in FF was also associated with complicated course of IVF due to ovarian hyperstimulation syndrome. On the other hand, we found that the concentration of human gonadotropin – the early marker for successful embryo implantation and maturity — significantly cor( related with enhanced immunosuppressive and antiinflammatory activities of regulatory factors in FF. Obtained data suggest that the proinflammatory/immunostimulatory cytokines participate in maturation of oocytes and may be important for human preembryo development, whereas the following shift of regulatory balance toward the antiinflammatory/immunosuppressive cytokines contribute to successful embryo implantation and may be necessary for the establishment of pregnancy in women undergoing IVF. (Cytokines and Inflammation. 2005. Vol. 4, № 2. P. 38–44.)
Key words: human cytokines, blood serum, follicular fluid, in:vitro fertilization.
