Е.Р. Черных, Е.В. Курганова, В.В. Сенюков, Е.Я. Шевела, Е.И. Стрельцова, В.С. Кожевников, А.А Останин, В.А. Козлов ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск Цитокин зависимые механизмы Т клеточных дисфункций при хирургическом сепсисе
Проведен сравнительный анализ продукции Th1 и Th2 цитокинов (TNF?, IFN?, IL2,IL 4,IL5, IL10,IL13, GM CSF), а также количества CD4 и CD8 Т лимфоцитов, внутриклеточно экспресси рующих IFN? и/или IL4, в группах здоровых доноров и больных сепсисом, включая пациентов со сниженной (более чем на 50 %) и сохранной пролиферацией Т клеток в ответ на стимуляцию анти CD3 антителами. Показано, что у больных со сниженной пролиферативной активностью Т клеток имеется угнетение продукции IL2, IFN?и IL4, которое ассоциировано со снижением относительного количества IFN? и IL 4 позитивных CD4 Т клеток и, таким образом, является проявлением анергии Th1 и Th2. Увеличение у данной категории больных продукции IL 10, возможно, отражает накопление регуляторных Т клеток с супрессорной активностью (Tr1). В свою очередь, у больных с сохранной пролиферативной активностью наблюдается усиление продукции TNF?, GM CSF, IL4,IL5 IL13 и IL10, что сопровождается смещением цитокинового баланса в сторону Th2. Поскольку дисбаланс Th1 /Th2 цитокинов сопряжен со снижением количества IFN?+CD8+ Т клеток и увеличением доли IL4+CD8+ Т лимфоцитов, выявленные изменения отра жают феномен переключения Ts1 ?Ts2. (Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 2. С. 45–53.)
Ключевые слова: анергия Т клеток, Th1/Th2, Ts1/Ts2, цитокины, сепсис.
Т клеточная недостаточность при системном воспалительном ответе (SIRS) инфекционного и неинфекционного генеза признается большинством авторов и расценивается в качестве неблагоприятного прогностического фактора [4, 19]. Дефект Т клеточного иммунитета при сепсисе (инфекционный SIRS) во многом связывают с повышенной гибелью лимфоцитов по механизму апоптоза [6, 29]. В качестве другой причины Т клеточных дисфункций при сепсисе и тяжелой травме (неинфекционный SIRS) рассматривается активная супрессия вследствие смещения цитокинового баланса в сторону противовоспалительных медиаторов в популяции моноцитов/макрофагов и переключения Th1?Тh2 [2, 7, 19, 23, 26]. Недавними исследованиями показано, что еще одним механизмом дефекта при тяжелой травме Т клеток может быть пребывание их в состоянии анергии [14]. Аналогичные данные были нами получены при хирургическом сепсисе. В частности, четкие признаки анергии Т лимфоцитов в виде глубокого угнетения пролиферативной активности Т клеток, ассоциированного с блоком клеточного цикла и снижением продукции IL2, были выявлены нами у 40 % больных сепсисом. Причем индукция анергии была сопряжена с накоплением естественных регуляторных клеток с супрессорной активностью (CD4+CD25+ Т лимфоцитов) и снижением пролиферативного ответа Т клеток на различные стимулы [1, 5]. Несмотря на определенные успехи в изучении феноменологии Т клеточных дисфункций при системном воспалительном ответе инфекционного и неинфекционного генеза, данные, характеризующие механизмы их развития, остаются немного численными и достаточно разноречивыми, особенно касательно больных сепсисом. Так, например, угнетение пролиферативной активности и снижение продукции Th1цитокинов в качестве проявлений иммунной недостаточности выявляется не у всех больных и не на все стимулы. Что касается продукции Th2цитокинов, то описываютсявсе возможные варианты, включая неизмененную продукцию, ее усиление или глубокое угнетение. При этом целый ряд вопросов остается открытым. Действительно ли глубокое угнетение пролиферации Тклеток при их стимуляции через Тклеточный рецептор связано с анергией Тклеток, и какая из субпопопуляций CD4 Тклеток подвержена анергии—Th1, Th2 (или и та, и другая); каковы особенности спектра цитокинов, продуцируемых анергичными Тклетками при хирургическом сепсисе; у какой категории больных имеет место Th1?Тh2 переключение и в каких субпопуляциях Тклеток (CD4, CD8 или обеих) это происходит? Остается неисследованным вопрос о возможном сочетании различных механизмов развития Тклеточных дисфункций и их удельном весе у различных пациентов. С целью выяснения этих вопросов нами был проведен анализ продукции широкого спектра Th1/Th2 цитокинов (TNF?, IFN?, IL2, IL4, IL5, IL10, IL13, GM[1]CSF) у больных с хирургическим сепсисом, в том числе в группах пациентов с сохранной и сниженной пролиферативной активностью Тклеток. Для идентификации Тклеточных субпопуляций, причастных к изменению цитокинового баланса, наряду с анализом продукции цитокинов, также исследовалось относительное количество лимфоцитов с внутриклеточной экспрессией IFN?, IL4 или обоих цитокинов в субпопуляциях CD4 и CD8 Тклеток. Материалы и методы В исследование были включены 24 больных с хирургическим сепсисом (54 % мужчин и 46 % женщин, средний возраст 43,0 ± 3,1 года), находящихся в отделении реанимации и интенсивной терапии. В 62,5 % случаев сепсис был вызван гнойновоспалительными заболеваниями органов брюшной полости и в 20,8 % — нагноительными заболеваниями органов грудной полости. В остальных случаях (16,7 %) регистрировался ангиогенный сепсис. Диагностика сепсиса в соответствии с рекомендациями Чикагской согласительной конференции основывалась на выявлении двух и более признаков синдрома системного воспалительного ответа (SIRS) при наличии очага инфекции [9]. Тяжелый сепсис, сопровождающийся развитием синдрома полиорганной недостаточности (СПОН), в структуре обследованных больных составил 54,2 %. Обследование всех пациентов проводилось при получении информированного согласия. Контрольная группа была представлена 35 здоровыми донорами крови, сопоставимыми по полу и возрасту. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из периферической крови стандартно в градиенте плотности фикколаверографина. Клетки в концентрации 0,1 ? 106/лунку культивировали в 96 луночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований в среде RPMI1640 (Sigma, США), дополненной 0,3 мг/мл L лутамина, 5 мМ HEPES, 100 мкг/мл гентамицина и 10 % инактивированной сыворотки доноров АВ(IV) группы. Для стимуляции Т клеток использовали моноклональные антиCD3 антитела ICO90 (антиCD3, «Медбиоспектр», Москва) в концентрации 1 мкг/мл. Интенсивность пролиферации оценивали радиометрически по включению 3H тимидина (1 мкКи/лунку), вносимого за 18 ч до окончания культивирования. Методом проточной флюориметрии [3, 12] на двулучевом лазерном автоматизированном анализаторе (BioPlex Protein Assay System, BioRad, США) с использованием коммерческих тест систем и в соответствии с инструкцией фирмыпроизводителя оценивали продукцию Th1/Th2 цитокинов (TNF?, IFN?, IL2, IL4, IL5, IL10, IL13, GMCSF, определяемый динамический диапазон 2–32000 пкг/мл) в 48часовых супернатантах МНК в отсутствие (спонтанная продукция) и присутствии анти CD3 антител (стимулированная продукция). Определение экспрессии внутриклеточных цитокинов в МНК периферической крови проводили методом трехцветной проточной цитометрии (FACSCalibur, Becton Dickinson). С целью селективной активации Т клеток и индукции синтеза цитокинов МНК культивировали в 24луночных планшетах в течение 4 ч в присутствии форболмиристатацетата (30 нг/мл, ICN) и иономицина (2 мкМ, ICN), а также брефелдина А (10 мкг/мл, ICN, блокатора транспорта протеинов из аппарата Гольджи). Затем клетки инкубировали с моноклональными антителами к поверхностным маркерам (CD4PerCP, CD8PerCP, Becton Dickinson). После пермеабилизации клеток c помощью 0,2%ного раствора Твин 20 их инкубировали с моноклональными антиIFN? антителами, конъюгированными с FITC, и антиIL4 антителами, мечеными фикоэритрином (Becton Dickinson). Образцы анализировали на проточном цитометре с использованием программы Cellquest. Цитокин экспрессирующие клетки, отнесенные к лимфоцитарному региону, оценивали по параметрам прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния. Математическую обработку полученных результатов проводили методами описательной, параметрической и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы «Statistica 5.0». Таблицы содержат информацию в виде средних арифметических величин (М) и стандартных ошибок средних (SE). Сравнение вариационных рядов осуществляли с помощью непараметрического критерия Вилкоксона—Манна—Уитни (U). Корреляционный анализ проводили методом ранговой корреляции по Спирмену. Результаты и обсуждение Продукция Th1/Th2 цитокинов у больных с хирургическим сепсисом Для оценки особенностей продукции Th1/Th2цитокинов был проведен сравнительный анализ содержания TNF?, IFN?, IL2, IL4, IL5, IL10, IL13 и GMCSF в 48часовых супернатантах МНК здоровых доноров и больных с хирургическим сепсисом. Согласно данным литературы, продукция IFN? и IL2 характерна для Th1клеток, а IL4, IL5, IL10, IL13 — для Th2клеток. TNF? и GMCSF могут продуцироваться как теми, так и другими клетками, однако уровень продукции GMCSF выше в популяции Th1 [13, 27]. В табл. 1 приведены средние значения концентрации цито[1] кинов, диапазоны минимальных и максимальных величин, а также частота встречаемости больных со сниженным, сохранным и повышенным уровнем антиCD3стимулированной продукции ис
Таблица 1 Продукция Th1/Th2 цитокинов в культурах МНК здоровых доноров и больных сепсисом
Примечание. Концентрацию цитокинов определяли в супернатантах МНК, культивированных в течение 48 ч в отсутствие (0) и в присутствии анти CD3антител (анти CD3). В скобках приведены диапазоны минимальных и максимальных значений. Представлена частота больных со сниженным , сохранным (N) и повышенным (?) уровнем антиCD3 стимулированной продукции цитокинов. pu < 0,05 — достоверность различий по сравнению с группой доноров (U критерий Вилкоксона — Манна—Уитни).
следуемых цитокинов (т.е. соответственно ниже, в пределах или выше границ нормативного диапазона здоровых доноров). В группе доноров спонтанная продукция большинства анализируемых цитокинов (за исключением TNF? и IFN?) была минимальной и регистрировалась в «следовых» концентрациях. Спонтанная продукция IFN? не превышала 245 пг/мл. В то же время выявлялся относительно высокий уровень спонтанной продукции TNF?. Стимуляция МНК aнти[1]CD3[1]антителами сопровождалась существенным усилением продукции цитокинов. При этом наиболее высокий уровень продукции был выявлен для IFN? и TNF?. По сравнению с донорами у больных сепсисом отмечалось достоверное увеличение спонтанной и индуцированной продукции IL10. Кроме того, у больных регистрировалась тенденция к возрастанию среднего уровня антиCD3 стимулированной продукции как Th1/иммуностимуляторных цитокинов (IL2, TNF? и GMCSF), так и Th2цитокинов (IL4, IL5 и IL13) за счет существенного увеличения случаев выявления максимальных значений продукции исследуемых цитокинов. Так, при анализе индивидуальных показателей в группе больных сепсисом обращала внимание поляризация уровня цитокинов в области низких либо высоких значений. Например, по уровню IL2, TNF? и GMCSF отмечалось либо снижение, либо повышение их продукции. И только у 18,8 % больныхпоказатели IL2 и TNF? находились в границах диапазона нормативных значений. Относительно IFN? —у 43,7 % больных отмечалось снижение продукции, в остальных случаях—сохранный (50,0 %) или повышенный (6,3 %) уровень. Что касается Th2цитокинов, продукция IL4 была либо минимальной, либо повышенной (в 56,3 и 43,7 % случаев, соответственно). Уровень IL5, IL13 и IL10 в половине случаев оставался в пределах номы, а в половине—повышен. Эти факты явно свидетельствовали о разнонаправленном характере изменения цитокинов при сепсисе и гетерогенности обследованных пациентов. Особенности продукции цитокинов у больных с различным уровнем пролиферативного ответа Т клеток Важно отметить, что обследованные больные существенно различались по уровню пролиферативной активности Т клеток. Учитывая этот факт, выявленная разнородность показателей цитокинов могла отражать различное функциональное состояние Т лимфоцитов у больных со сниженной и сохранной пролиферативной активностью Т клеток. Поэтому на следующем этапе анализ продукции цитокинов был проведен отдельно в подгруппах пациентов с сохранной и сниженной пролиферацией Т клеток, которых мы условно обозначили как «реактивных» и «анергичных» больных, соответственно. Критерием отнесения в группу «анергичных» больных служило более чем двукратное снижение пролиферации в культурах антиCD3 стимулирвоанных МНК больных по сравнению со средним нормативным уровнем здоровых доноров (34730 ± 1950 имп./мин, n = 50). Таким образом, индивидуальные значения aнти CD3 индуцированного пролиферативного ответа в группе «анергичных» пациентов варьировали в диапазоне 83016636 имп./мин, составляя в среднем 13008 ± 1821 имп./мин (n = 11), в подгруппе «реактивных» больных—от 23599 до 70401 имп./мин (40125 ± 3883 имп./мин, n = 13). Из данных табл. 2 видно, что у «анергичных» больных стимулированная продукция IL2, IFN?, TNF?, GMCSF и IL4 была значимо снижена, в то время как уровень IL10 был повышен почти в 2 раза. Угнетение продукции IL2 на фоне пролиферативной ареактивности является классическим признаком Т клеточной анергии [33]. Поэтому выявленное сочетанное снижение пролиферации и продукции IL2 означало, что Th1клетки в исследуемой группе больных сепсисом подвержены анергии. В литературе описаны различные модели индукции анергии, при которых пролиферация Тклеток и продукция IL2 блокируются, в то время как уровень IL4 не изменяется, либо усиливается [11, 32]. В наших исследованиях наряду с угнетением продукции IL2 также выявлялось значимое снижение IL4. Этот факт явно указывал на то, что анергии у пациентов с дефектом aнтиСD3индуцированного пролиферативного ответа подвержены как Th1, так и Th2. Важно отметить, что состояние анергии, в зависимости от условий индукции, может иметь различные проявления. Так, в некоторых моделях Th1 анергии продукция IFN? не меняется или снижается незначительно [32]. В то же время у обследованных нами больных анергия Th1 проявлялась не только дефектом продукции IL2, но и угнетением других цитокинов с иммуностимулирующей активностью—IFN?, TNF? и GMCSF, что, по[1]видимому, отражает глубину Т клеточных нарушений при септическом процессе [16]. В противоположность универсальному снижению Th1/иммуностимулирующих цитокинов, изменение Th2цитокинов не было столь однонаправленным. Несмотря на снижение IL4, стимулированная продукция IL5 и IL13 оставалась в пределах нормативного диапазона. На этом фоне несколько неожиданным было увеличение продукции IL10. Известно, что продуцентами IL10 среди Тклеток являются не только Th2, но и охарактеризованные в последние годы анергичные CD4 Тклетки с регуляторной активностью, т. н. регуляторные Тклетки I типа (Tr1) [17, 22]. С этой точки зрения увеличение уровня IL10 может отражать активность Tr1клеток, опосредующих свое действие через продукцию IL10, и не быть связано непосредственно с функционированием Th2клеток. Действительно, проведенный корреляционный анализ между уровнями IL10 и Th2цитокинами (IL5 и IL13) не выявил значимой взаимосвязи между анализируемыми параметрами (r = 0,32; p = 0,48 и r = 0,29; p = 0,53, соответственно). Таким образом, у больных сепсисом дефект антиCD3индуцированного пролиферативного ответа Т клеток ассоциирован со снижением как Th1/иммуностимуляторных цитокинов, так и Th2продуцируемого IL4. При этом индукция анергии сопряжена с увеличением уровня IL10, что, повидимому, отражает накопление регуляторных Тклеток с супрессорной активностью. В группе больных с сохранным уровнем анти CD3 индуцированного пролиферативного ответа
Таблица 2 Продукция Th1/Th2 цитокинов(пкг/мл) в группах больных сепсисом, различающихся по состоянию анергии Т клеток
Примечание. pu < 0,05; pu < 0,01; достоверность различий по сравнению с группой доноров (U критерий Вилкоксона — Манна—Уитни).
продукция Th1/Th2 цитокинов имела совершенно иной характер. Так, по сравнению с донорами концентрация TNF? и GMCSF в стимулированных культурах МНК «реактивных» больных была значимо выше, в то время как умеренное возрастание IL2 и IFN? было статистически недостоверным. Одновременно отмечалось существенное усиление продукции всех Th2 цитокинов (IL4, IL5, IL13 и IL10). Значительный прирост Th2 цитокинов может быть обусловлен либо стимуляцией Th0 клеток, способных продуцировать цитокины как первого, так и второго типа, либо активацией обеих популяций Т хелперных клеток, либо переключением Th1?Th2. В исследованиях при тяжелой травме A.K. De et al. показали, что у больных с сохранной пролиферативной реактивностью имеется усиление продукции как IL 4 и IL10, так и IFN?, расцениваемое как активация Th1 и Th2 [14]. С другой стороны, в литературе имеются данные о доминировании Th2 при травме [26]. При анализе полученных нами данных обращало на себя внимание то, что увеличение Th1 и Th2 цитокинов было неравнозначным. Так, если средние значения IFN? у реактивных больных превышали таковые у доноров в 1,8 раза, то уро[1] вень продукции IL4 и IL13—в 9 раз, IL5— в 14 раз, что указывало на явное смещение баланса в сторону Th2[1]цитокинов. Чтобы более точно оценить состояние цитокинового баланса, были сравнены индексы соотношения некоторых Th1/Th2цитокинов в исследуемой группе с таковыми у здоровых доноров. По сравнению со здоровыми донорами у пациентов из группы «реактивных» больных отмечалось достоверное снижение индексов IL2/IL4 (1,6 ± 0,27 vs 5,1 ± 1,6; pu < 0,05), IL2/IL5 (0,6 ± 0,16 vs 2,6 ± 1,6; pu < 0,05) и IFN?/IL4 (85 ± 23 vs 403 ± 1,6; pu < 0,05), что позволяло предполагать наличие у них Th1?Th2 переключения. Для сравнения, у «анергичных» пациентов соотношения IL2/IL4 и IL2/ IL5 значимо не изменялись, однако индекс IFN?/IL4 был также достоверно снижен (98 ± 3 vs 403 ± 1,6; pu < 0,05), что не исключает изменения баланса Т клеток I и II типа и у больных со сниженной пролиферативной активностью. Внутриклеточная экспрессия цитокинов CD4 и CD8 Т лимфоцитами у больных сепсисом Следует отметить, что использование культур МНК, стимулированных через Т клеточный рецептор антиCD3 антителами, для анализа продукции Th1/Th2 цитокинов не позволяет в строгом смысле утверждать, что секреция цитокинов вэтих условиях опосредована исключительно популяцией T хелперных клеток. Как известно, сходный спектр цитокинов способны продуцировать и CD8 Тлимфоциты. При этом, по аналогии с Th1/Th2 CD8, Тклетки также характеризуются дихотомией, и, в зависимости от профиля продуцируемых цитокинов среди них выделяют цитотоксические/супрессорные CD8 Тклетки I и II типа (Ts1/Ts2) [27, 31]. Чтобы исследовать субпопуляционную принадлежность клеток, причастных к дефекту Th1/Th2цитокинов у «анергичных» больных и доминированию Th2/иммуносупрессорных цитокинов в группе «реактивных» пациентов, на следующем этапе было проведено исследование содержания Th0, Th1 и Th2 клеток путем определения CD4, лимфоцитов с внутриклеточной экспрессией IL4+IFN?, IFN? или IL4, соответствен[1] но. Аналогичным образом (по наличию внутриклеточного IFN?, IL4 или их комбинации) были идентифицированы субпопуляции CD8 Тклеток, включающие Ts1, Ts2 или их предшественники (Ts0). Как видно из данных табл. 3, у здоровых доноров приблизительно четвертая часть CD4 Тклеток и половина CD8 Тклеток экспрессировала внутриклеточный IFN?, в то время как количество IL4 позитивных клеток в популяции CD4 и CD8лимфоцитов составило всего 3 и 2 %, соответственно. Таким образом, количество Тклеток с внутриклеточной экспрессией IFN? существенно преобладало над численностью Тлимфоцитов, экспрессирующих внутриклеточный IL4, что полностью согласуется с данными об уровне спонтанной продукции соответствующих цитокинов в культуре in vitro (см. табл. 1). Причем преобладание IFN? позитивных клеток над IL4содержащими лимфоцитами в популяции CD8 цитотоксических/супрессорных клеток было более выра[1] жено, чем в популяции CD4 Tхелперных клеток
Таблица 3 Относительное содержание Th0 , Th1 , Th2 и Ts0 , Ts1 , Ts2 клеток в крови здоровых доноров и больных сепсисом
Примечание. pu < 0,05; pu < 0,01 — достоверность различий по сравнению с группой доноров (U критерий Вилкоксона — Манна—Уитни).
(соотношение Ts1/Ts2 и Th1/Th2 составляло 45,9 ± 11 и 8,5 ± 0,98, соответственно). В группе «анергичных» больных регистрировалось одновременное снижение как IFN?, так и IL4содержащих СD4 Тклеток. В совокупности с полученными данными о снижении продукции IFN? и IL4 этот факт однозначно свидетельствовал о том, что у больных с дефектом пролиферативного ответа Т лимфоцитов на антиCD3стимуляцию анергии подвержены обе субпопуляции Тхелперных клеток (Th1 и Th2). Характерно, что соотношение Th1/Th2 в этой группе больных не только не снижалось, а наоборот, возрастало за счет более выраженного дефицита Th2. Таким образом, подверженные анергии Тклетки не имели признаков смещения баланса в сторону Th2. Изменения в популяции CD8+ Тклеток имели несколько иной характер. Снижение IFN? позитивных клеток было сопряжено с увеличением IL4содержащих лимфоцитов и выраженным уменьшением соотношения Ts1/Ts2клеток, что указывало на Ts1?Ts2 переключение. Возможно, этим феноменом объясняется и выявленное у «анергичных» больных снижение уровня продукции и индекса соотношения IFN?/IL4. В группе «реактивных» больных относительное содержание IFN? и IL4содержащих CD4 Тклеток и их соотношение оставалось сохранным. В то же время в популяции CD8 Тклеток наблюдалось достоверное снижение соотношения Ts1/Ts2 за счет уменьшения IFN?+ и увеличения IL4+CD8 Тклеток. Количество Ts0 при этом значимо не менялось. В совокупности с данными о повышенной продукции IL4, IL5, IL13 и IL10 полученные результаты свидетельствуют о преобладании активности T2клеток в подгруппе «реактивных» больных сепсисом. Таким образом, у больных с дефектом пролиферативной активности Тклеток снижение продукции IL2, IFN? и IL4 обусловлено анергией Th1 и Th2, в то время как усиление продукции Th2/иммуносупрессорных цитокинов у больных с сохранной пролиферацией—Ts1?Ts2 переключением. Нарушение функций Тклеток у больных сепсисом в виде снижения продукции IL2 впервые было описано в 1984 г. J. Wood [38]. Впоследствии дефект продукции IL2 и пролиферативной активности Тклеток при системном воспалительном ответе инфекционного и неинфекционного генеза был выявлен многими авторами, однако, как отмечалось, не у всех больных и не на все активирующие стимулы [6, 28]. Неоднозначно интерпретировались и механизмы угнетения функциональной активности Тклеток. Так, рядом авторов было продемонстрировано, что при тяжелой травме и сепсисе наблюдается снижение уровня Th1 и увеличение Th2цитокинов, причем нормализация цитокинового баланса у больных сепсисом ассоциируется с благоприятным прогнозом [19, 23, 26, 39]. Данные изменения интерпретируются как результат Th1?Th2 переключения. В то же время J. Muret et al. выявили у больных сепсисом одновременное снижение КонА стимулированной продукции IL2, IL5 и IL10 и расценили это как состояние анергии Th1 и Th2 [28]. Аналогичное заключение было сделано при исследо[1] вании больных с тяжелой травмой. Дефект пролиферативного ответа Т клеток у этой категории больных также ассоциировался с подавлением продукции IL2 и IL4, что позволило авторам сделать предположение об анергии Тклеток в качестве ведущей причины Т клеточных нарушений [14]. Состояние анергии Тклеток было так же выявлено C.D. Heidecke et al. у больных с абдоминальным сепсисом, однако снижение продукции Th1[1]цитокинов было изолированным и не сопровождалось изменением уровня Th2 цитокинов [18]. Важно отметить, что в подавляющем большинстве этих работ удельный вклад CD4 и CD8 Тклеток в нарушение цитокинового баланса зачастую оставался не изученным. Изменение профиля цитокинов традиционно связывалось исключительно с Th1/Th2клетками, хотя хорошо известно, что СD8 Тлимфоциты также включают оппозитные по спектру цитокинов субпопуляции (Ts1/Ts2) и могут существенно влиять на баланс цитокинов. В настоящей работе мы впервые провели одновременное исследование продукции Th1/Th2цитокинов (TNF?, IFN?, IL2, IL4, IL5, IL10, IL13, GMCSF) и относительного содержания Th1/Th2 и Ts1/T2клеток у больных с хирургическим сепсисом, в том числе в подгруппах пациентов со сниженным и сохранным уровнем антиCD3индуцированного пролиферативного ответа Тклеток. Полученные данные позволили сделать ряд важных заключений и частично объяснить имеющиеся в литературе противоречия по поводу механизмов Тклеточных дисфункций у больных сепсисом. В частности, нами установлено, что выраженные изменения продукции Th1 и Th2цитокинов имеются у всех больных с хирургическим сепсисом. Однако у больных со сниженным и сохранным уровнем пролиферации Тклеток эти изменения носят принципиально различный характер. Больные со сниженным антиCD3индуцированным пролиферативным ответом характеризуются низким уровнем продукции Th1/иммуностимуляторных цитокинов (IL2, IFN?, TNF? и GMCSF) и Th2 ассоциированного IL4, что свидетельствует об анергии Тклеток, продуцирующих цитокины I и II типа. Ранее нами было показано, что угнетение пролиферации Тклеток у больных сепсисом сопряжено со снижением продукции IL2, не коррелирует с повышенным апоптозом и ассоциировано с блоком клеточного цикла, что позволило предположить важную роль анергии в развитии Т клеточного дефекта при сепсисе [5, 6]. Кроме того, выявление блока клеточного цикла именно в популяции CD4, но не CD8 Т клеток указывало на то, что анергии при сепсисе подвержены преимущественно СD4 Тлимфоциты [5]. Поэтому выявленное снижение уровня IL2, IFN? и IL4 мы расценили как анергию Th1 и Th2. Прямым подтверждением тому послужили результаты исследования количества IL4 и IFN?экспрессирующих клеток, согласно которым у больных исследуемой группы отмечалось одновременные снижение относительного содержания CD4 Тклеток, экспрессирующих как IL4, так и IFN?. Развитие анергии при сепсисе представляется теоретически вполне обоснованным. Неполноценность костимуляторного сигнала как причина анергии может быть обусловлено, например, многократной рестимуляцией клеток антигеном или представлением антигена «непрофессиональными» антигенпрезентирующими клетками [32]. Дефект костимуляторных молекул на моноцитах/макрофагах может быть индуцирован повышенным апоптозом [1, 20]. Так, апоптотические клетки продуцируют иммуносупрессорные факторы [37] и после фагоцитоза макрофагами способны ингибировать экспрессию и продукцию костимуляторных молекул антигенпрезентирующими клетками [15]. Наконец, состояние анергии может быть индуцировано активацией Т клеток измененными пептидами, образующимися в результате деградации собственных белков в процессе апоптоза [19, 30]. При этом, в зависимости от особенностей индукции (тип презентирующих клеток, дозы антигена, экспериментальные условия), анергия может развиваться в различных субпопуляциях Тклеток и характеризоваться фенотипическим и функциональным разнообразием [11, 16, 32, 35]. Особенностью выявленной нами у больных сепсисом анергии является, прежде всего, то, что она носит распространенный характер, т.е. анергии подвержены как Th1, так и Th2клетки. При этом Th1анергия проявляется снижением не только IL2, но и других цитокинов—IFN?, TNF?, GMCSF, что свидетельствует о большей выраженности Тклеточного дефекта [16]. Это имеет принципиальное значение, поскольку TNF? и GM[1]CSF играют важную роль в дифференцировке и созревании дендритных клеток, инициирующих запуск специфического иммунного ответа, а также в поддержании жизнеспособности и функциональной активности нейтрофилов, опосредующих реакции врожденного иммунитета [24, 34]. В то же время анергия Th2 проявляется исключительно в снижении IL4 при сохранной продукции других Th2цитокинов—IL5 и IL13. Болеетого, несмотря на сниженную продукцию IL4, уровень IL10 у больных с анергией оказался повышенным. Характерно, что продукция IL10 не коррелировала с другими Th2цитокинами (IL5, IL13) и, т. о., вряд ли была связана с функционированием Th2 или T2. Поэтому данную ситуацию мы расценили как еще одну особенность анергии при сепсисе, связанную с накоплением в циркуляции регуляторных CD4 Тклеток с супрессорной активностью (Tr1). Действительно, индукция анергии, по данным ряда авторов, сопровождается приобретением анергичными клетками супрессорной активности [11, 25, 36]. Причем генерация Tr1 не является чисто витральным феноменом. Накопление Tr1клеток и их причастность к иммунной недостаточности описаны при ряде хронических инфекций бактериальной и вирусной природы [8, 10, 21]. Не исключено, что именно присутствие IL10 продуцирующих регуляторных клеток определяет своеобразие Th1[1]анергии, детерминируя снижение не только IL2, но и других Th1/иммуностимуляторных цитокинов (IFN?, TNF?, GM[1]CSF). В отличие от CD4 Тклеток, интерпретация изменений в субпопуляции CD8 Тлимфоцитов у больных со сниженным пролиферативным ответом остается достаточно проблематичной. Выявленное снижение количества IFN? позитивных клеток в популяции CD8 лимфоцитов ассоциировалось с увеличением содержания IL4 эксперссирующих лимфоцитов и, вследствие этого, со снижением соотношения CD8+IFN?/ CD8+IL4, что указывало на возможность переключения Ts1?Ts2. Учитывая также данные о снижении уровня продукции и индекса соотношения IFN?/IL4, а также более ранние результаты об отсутствии блока клеточного цикла в популяции CD8 Тклеток у «анергичных» больных [5], возможность переключения Ts1?Ts2 представляется вполне вероятной. Однако тогда остается не ясным, почему доминирование T2 клеток не приводит к усилению продукции IL4 или IL5/IL13.
Таким образом, вопрос о том, что же происходит в популяции CD8 Тклеток— T1?T2 переключение или индукция анергии, остается открытым. Возможно, определенный вклад в изменение функциональной активности Т клеток, включая и популяцию CD8 Тлимфоцитов, вносят регуляторные Т клетки. Увеличение количества естественных регуляторных Тклеток с фенотипом CD4+CD25+ у больных с анергией было продемонстрировано нами в предшествующих исследованиях [5]. Из настоящей работы следует, что это, повидимому, не единственный тип регуляторных Тклеток с супрессорной активностью, который имеет отношение к патогенезу иммунной недостаточности при сепсисе. Пациенты с сохранной пролиферацией отличались повышенной продукцией TNF?, GMCSF и всей группы Th2цитокинов (IL4, IL5, IL13 и IL10). Причем возрастание продукции цитокинов ассоциировалось со смещением баланса в сторону Th2, о чем свидетельствовало снижение индексов соотношения Th1/Th2цитокинов (IL2/IL4, IL2/IL5 и IFN?/IL4). При этом анализ внутриклеточной экспрессии IFN? и IL4 показал, что увеличение продукции цитокинов не связано с активацией предшественников Th1/Th2 или Ts1/Ts2, поскольку увеличения Th0 и Ts0 не наблюдалось, а обусловлено Ts1?Ts2 переключением. Таким образом, даже при сохранном пролиферативном ответе Тклеток у больных с хирургическим сепсисом имеется смещение баланса в сторону Th2/Ts2/иммуносупрессорных цитокинов. Невозможно полностью исключить роль в этом CD4 Тклеток, поскольку отсутствие достоверных изменений в количестве и соотношении IFN? и IL4экспрессирующих CD4 Тклеток еще не означает отсутствия изменений в уровне продукции цитокинов. Однако можно с уверенностью утверждать, что в смещении цитокинового баланса значительную роль играют CD8 Тклетки. Полученные результаты согласуется с данными S. Zedler [39], который показал, что именно за счет IL4продуцирующих CD8 Тклеток происходитсмещение баланса в сторону доминирования IL4 при ожоговой травме [39]. Какой из выявленных дефектов (Th1/Th2анергия или Ts1?Ts2) является более тяжелым нарушением при сепсисе Согласно полученным нами данным при сепсисе [1, 5] и данным A.К. De et al. при травме [14], развитие анергии у больных со сниженным пролиферативным ответом Тклеток ассоциировано с большей тяжестью системного воспалительного ответа, в частности, с развитием СПОН и более высоким уровнем летальности. Проспективные наблюдения в подгруппах «анергичных» и «реактивных» больных в настоящем исследовании выявили сходные тенденции. Так, при всех прочих сопоставимых параметрах (возраст, пол, локализация очага инфекции, сроки обследования, качество и объем интенсивной и антибактериальной терапии) частота выявления тяжелого сепсиса/СПОН у «анергичных» больных была выше, чем у «реактивных» пациентов (72,7 vs 38,5 %). Кроме того, уровень 28суточной летальности в группе «анергичных» больных практически в 2 раза превысил таковой в оппозитной подгруппе (27,3 vs 15,4 %).
ЛИТЕРАТУРА
1. Норкин М.Н., Леплина О.Ю., Тихонова М.А. и др. Роль апоптоза и анергии Тклеток в патогенезе гнойносептических заболеваний // Мед. иммунол. — 2000. — Т. 2, № 1. — С. 35–42.
2. Останин А.А., Леплина О.Ю., Тихонова М.А. и др. Цитокинопосредованные механизмы развития системной иммуносупрессии у больных с гнойнохирургической патологией // Цитокины и воспаление. — 2002. — Т. 1, № 1. — С. 38–45.
3. Останин А.А., Леплина О.Ю., Шевела Е.Я. и др. Оценка цитокинового профиля у больных с тяжелым сепсисом методом проточной флюориметрии (Bio Plex анализа) // Цитокины и воспаление. — 2004. — Т. 3, № 1. — С. 20–27.
4. Пинегин Б.В., Андронова Т.М., Юдина Т.И. Иммунодиагностика и иммунотерапия хирургических инфекций // Int. J. Immunorehabilitation. — 1998. — № 10. — С. 86–99.
5. Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Тихонова М.А. и др. Феномен Тклеточной анергии при хирургическом сепсисе // Мед. иммунол. — 2003. — Т. 5, № 5–6. — С. 529–538.
6. Черных Е.Р., Норкин М.Н., Леплина О.Ю. и др. Апоптоз и анергия периферических Тлимфоцитов при гнойносептической патологии // Мед. иммунол. — 1999. — Т. 1, № 5. — С. 45–51.
7. Ayala A., Deol Z.K., Lehman D.L. et al. Polymicrobial sepsis but not lowdose endotoxin infusion causes decreased splenocyte IL2/IFN g release while increasing IL4/IL10 production // J. Surg. Res. — 1994. — Vol. 56. — P. 579–585.
8. Bluestone J.A., Abbas A.K. Natural versus adaptive regulatory T cells // Nat. Rev. Immunol. — 2003. — Vol. 3. — P. 253–257.
9. Bone R.C., Balk R.A., Cerra F.B. et al. ACCP/SCCM consensus conference. Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis // Chest. — 1992. — Vol. 101. — P. 1644–1655.
10. Boussiotis V.A., Tsai E.Y., Yunis E.J. et al. IL10producing T cells suppress im mune responses in anergic tuberculosis patients // J. Clin. Invest. — 2000. — Vol. 105. — P. 1317–1325.
11. Buer J., Lanoue A., Franzke A. et al. Interleukin 10 secretion and impaired effector function of major histocompatibility complex class IIrestricted T cells anergized in vivo // J. Exp. Med. — 1998. — Vol. 187. — P. 177–183.
12. Carson R., Vignali D. Simultaneous quantitation of fifteen cytokines using a mul tiplexed flow cytometric assay // J. Immunol. Meth. — 1999. — Vol. 227. — P. 41–52.
13. Curfs J.H.A.J., Meis J.F.G.M., HoogkampKorstanje J.A.A. A primer on cytokines: sources, receptors, effects and inducers // Clin. Microbiol. Rev. — 1997. — Vol. 10, № 4. — P. 742–780.
14. De A.K., Kodys K.M., Pellegrini J. et al. Induction of global anergy rather than inhibitory Th2 lymphokines mediates posttrauma Tcell immunodepression // Clin. Immunol. — 2000. — Vol. 96. — P. 52–66.
15.Fadok V.A., Bratton D.L., Rose D.M. et al. A receptor for phosphatidylserinespecific clearance of apoptotic cells // Nature. — 2000. — Vol. 405. — P. 85–90.
16. Groux H., Bigler M., de Vries J.E., Roncarolo M.G. Interleukin10 induces a longterm antigenspecific anergic state in human CD4 T cells // J. Exp. Med. — 1996. — Vol. 184. — P. 19–29.
17. Groux H., O’Garra A., Bigler M. et al. Generation of a novel regulatory CD4 Tcell population, which inhibits antigenspecific Tcell responses // Nature. — 1997. — Vol. 389. — P. 737–742.
18. Heidecke C.D., Hensler T., Weighardt H. et al. Selective defects of T lymphocyte function in patients with lethal intraabdominal infection // Am. J. Surg. — 1999. — Vol. 178. — P. 288–292.
19. Hotchkiss R.S., Karl I.E. The pathophysiology and treatment of sepsis // N. Engl. J. Med. — 2003. — Vol. 348, № 2. — P. 138–150.
20. Hotchkiss R.S., Tinsley K.W., Swanson P.E. Sepsisinduced apoptosis causes progressive profound depletion of B and CD4+ T Lymphocytes in humans // J. Immunol. — 2001. — Vol. 166. — P. 6952–6963.
21. Iwashiro M., Messer R.J., Peterson K.E. et al. Immunosuppression by CD4 regulatory T cells induced by chronic retroviral infection // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2001. — Vol. 98. — P. 9226–9231.
22. Jonuleit H., Schmitt E., Schuler G., Knop J., Enk A.H. Induction of interleukin 10producing, nonproliferating CD4 T cells with regulatory properties by repetitive stimulation with allogeneic immature human dendritic cells // J. Exp. Med. — 2000. — Vol. 192. — P. 1213–1222.
23. Lederer J.A., Rodrick M.L, Mannick J.A. The effects of injury on the adaptive immune response // Shock. — 1999. — Vol. 11. — P. 153–159.
24. Lee A., Whyte M.K.B., Haslett C. Inhibition of apoptosis and prolongation of neutrophil functional longevity by inflammatory mediators // J. Leukoc. Biol. — 1993. — Vol. 54. — P. 283–288.
25. Lombardi G., Sidhu S., Batchelor R., Lechler R. Anergic T cells as suppressor cells in vitro // Science. — 1994. — Vol. 264. — P. 1587–1592.
26. Mack V.E., McCarter M.D., Naama H.A., Calvano S.E., Daly J.M. Dominance of T helper 2 type cytokines after severe injury // Arch. Surg. — 1996. — Vol. 131, № 12. — P. 1303–1308.
27. Mosmann T.R., Sad S. The expanding universe of Tcell subsets: Th1, Th2 and more // Immunol. Today. — 1996. — Vol. 17, № 3. — P. 138–146.
28. Muret J., Marie C., Fitting C., Payen D., Cavaillon J M. Ex vivo Tlymphocyte de rived cytokine production in SIRS patients is influenced by experimental procedures // Shock — 2000. — Vol. 13. — P. 169–174.
29. Oberholzer A., Oberholzer C., Moldawer L.L. Sepsis syndromes: understanding the role of innate and acquired immunity // Shock. — 2001. — Vol. 16. — P. 83–96.
30. Pellegrini J.D., De A.K., Kodys K. et al. Relationships between T lymphocyte apoptosis and anergy following trauma // J. Surg. Res. — 2000. — Vol. 88. — P. 200–206.
31.Salgame P., Abrams J.S., Clayberger C. et al. Differing lymphokine profiles of functional subsets of human CD4 and CD8 T cell clones // Science. — 1991. — Vol. 254. — P. 279–282.
32. Schwartz R.H. Models of T cell anergy: is there a common molecular mechanism? // J. Exp. Med. — 1996. — Vol. 184. — P. 1–8.
33. Schwartz R.H. Т cell anergy // Annu. Rev. Immunol. — 2003. — Vol. 21. — P. 305–334.
35. Taams L.S., van Eden W., Wauben M.H.M. Dosedependent induction of distinct anergic phenotypes: multiple levels of Tcell anergy // J. Immunol. — 1999. — Vol. 162. — P. 1974–1981. 36. Taams L.S., Wauben M.H.M. Anergic T cells as active regulators of the immune response // Hum. Immunol. — 2000. — Vol. 61. — P. 633–639.
37. Voll R.E., Herrmann M., Roth E.A. et al. Immunosuppressive effects of apoptotic cells // Nature. — 1997. — Vol. 390. — P. 350–351.
38. Wood J., Rodrick M., O’Mahony J. et al. Inadequate interleukin production. A fundamental immunological deficiency in patients with major burns // Ann. Surg. — 1984. — Vol. 200. — P. 311–320.
39. Zedler S., Bone R.C., Baue A.E., Donnersmarck G.H., Faist E. Tcell reactivity and its predictive role in immunosupression after burns // Crit. Care Med. — 1999. — Vol. 27, № 1. — P. 66–73.
Cytokine dependent mechanisms of T cell dysfunctions in surgical sepsis E.R. Chernykh, E.V. Kurganova, V.V. Senukov, E.Ya. Shevela, E.I. Streltsova, V.S. Kozhevnikov, A.A. Ostanin, V.A. Kozlov Institute of Clinical Immunology, Siberian Branch of RAMS, Novosibirsk Comparative analysis of Th1 and Th2 cytokine production (TNF?, IFN?IL2, IL 4, IL 5, IL 10, IL 13, GM CSF) and percentage of IFN? and/or IL 4 positive CD4 and CD8 T cells in healthy donors and septic patients, including those who had > 50 % depressed vs normal anti CD3 induced Т cell proliferation, has been performed. The patients with diminished T cell proliferation were characterized by depressed IL 2, IFN? and IL 4 production and decreased percentage of both IFN? and IL 4 positive CD4 T cells evidencing for global Th1/Th2 anergy. Elevated IL10 production in these patients was suggested to be a result of regulatory T cell (Tr1) accumulation. On the other hand, the patients with normal T cell proliferation showed enhanced TNF?, GMCSF, IL4, IL5, IL13, IL10 levels and concomitant shift to a Th2 cytokine profile. Since the imbalance between Th1 and Th2 cytokines was associated with the decrease of IFN? CD8+ Т cells and increase of IL 4+ CD8+ Т lymphocytes, these data strongly suggest the Ts1?Ts2 switch. (Cytokines and Inflammation. 2005. Vol. 4, № 2. P. 45–53.)
