Получение рекомбинантного IL318 человека в клетках E. coli Е.А. Храпов , Е.Н. Воронина , А.И. Закабунин , Ю.А. Лопатникова , Е.В. Якушенко , С.В. Сенников, Н.М. Пустошилова , В.А. Козлов , М.Л. Филипенко Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН; OOO «Центр инженерной иммунологии», г. Новосибирск
В настоящее время рекомбинантные цитокины широко используются в медицинской практике для лечения и коррекции различных патологий. IL18 является важным регулятором врожденного и приобретенного иммунного ответа. Благодаря его биологическим свойствам IL18 является весьма перспективным препаратом при терапии ряда серьезных заболеваний. Целью данной работы являлось создание бактериального продуцента IL18 на основе экспрессирующей системы E. coli. Для выполнения этой задачи нами было проведено клонирование фрагмента кДНК кодирующего IL18 человека (nIL18). Кроме этого, нами был синтезирован и клонирован синтетический ген IL18 (sIL18), оптимизованный под экспрессию в E. сoli. Клонированные последовательности перенесли в плазмиду pET15b(+), позволяющую проводить экспрессию IL18 в виде гибридного белка, несущего N терминальный HIS6 тракт и в плазмиду pET23b(+) для синтеза белка без дополнительных аминокислот, максимально приближенного к природному. Для проведения экспрессии IL18 трансформировали штамм E. coli BL21(DE) полученными рекомбинантными плазмидами. Для сравнения процентного содержания рекомбинантного белка при экспрессии sIL18 и nIL18 генов использовали плазмиды pET15b(+)sIL18, pET15b(+)nIL18, pET23b(+)sIL18, pET23b(+)nIL18. Полученные электрофореграммы оцифровывали и обсчитывали. При экспрессии pET23b(+)sIL18 нарабатывается около 34 % рекомбинантного белка IL18 (от суммарного белка), тогда как в pET23b(+)nIL18 только 19 % (различия статистически достоверны). Не получено различий в уровне экспрессии «синтетического» и «природного» генов при использовании pET15b(+). Это можно объяснить наличием N терминального гистидинового домена, который уже оптимизован под экспрессию в E. coli, а также доминирующим влиянием именно трансляции именно N!конца белка. Также мы проводили сравнение уровня экспрессии IL18 в pET23b(+) совместно с плазмидой, кодирующей редкие для E. coli тРНК. При этом в pET23b(+)sIL18 количество рекомбинантного белка упало до 22 %, тогда как в pET23b(+)nIL18 выросло до 23 %, т. е. выравнялось. Рекомбинантный IL18 в клетках E. coli в основном накапливался в виде телец включения. Белок выделяли из телец включения после их отмывки и растворения в 10 М мочевине с помощью ионообменной и гидрофобной хроматографии. Далее рекомбинантный белок подвергали рефолдингу путем диализа с последовательным уменьшением концентрации денатурирующего агента с применением окисленного и восстановленного глутатиона или путем разбавления в буфере без денатурирующего агента. Препарат рекомбинантного IL18, как несущий N терминальный HIS6 тракт, так и без дополнительных аминокислот обладал иммунохимической и биологической активностью.