А.И. Аутеншлюс, А.Н. Шкунов, Г.Г. Иванова, А.В. Проскура, Е.С. Михайлова, Ю.В. Седова, Н.Б. Кузнецова, Д.В. Морозов, А.В. Клименков, С.В. Сидоров Институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, г. Новосибирск Содержание цитокинов IL1?, TNF? и уровни антител к TNF? у больных с онкологическими и воспалительными заболеваниями
А.И. Аутеншлюс, А.Н. Шкунов, Г.Г. Иванова, А.В. Проскура, Е.С. Михайлова, Ю.В. Седова, Н.Б. Кузнецова, Д.В. Морозов, А.В. Клименков, С.В. Сидоров Институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, г. Новосибирск Содержание цитокинов IL1?, TNF? и уровни антител к TNF? у больных с онкологическими и воспалительными заболеваниями
Проведено изучение уровней IL1 ? и TNF ?, а также антител (АТ) к TNF ? у больных раком легкого, раком молочной железы, фиброаденоматозом и туберкулезом легких различной степени активности.
Материалом исследования служила сыворотка крови больных и здоровых лиц. Содержание цитокинов и уровней антител определяли с помощью иммуноферментного анализа. Установлено, что для правильной интерпретации клинического значения содержания цитокинов в крови необходимо учитывать: у онкологических больных — вариант дифференцировки опухоли, ее локализацию и степень злокачественности, у больных туберкулезом легких — форму туберкулезного процесса, степень активности и уровни АТ к TNF ?, обусловливающие характер исхода заболевания. (Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 3. C. 11–15.)
Ключевые слова: цитокины, антитела к TNF?, опухолевые и воспалительные заболевания.
В соответствии с современными представлениями, цитокины, выполняя функции медиаторов, регулируют интенсивность и продолжительность иммунного ответа при многих заболеваниях у человека, включая процессы опухолевой и воспалительной природы [2, 6]. По данным ряда авторов, повышенные и высокие уровни IL1? и TNF? обнаруживаются в сыворотке крови больных раком легкого (РЛ), пневмонией и туберкулезом [4, 8], а чрезмерно высокие уровни IL1? и TNF? в сыворотке крови больных туберкулезом легких (ТЛ) в большинстве случаев соответствуют неблагоприятной динамике процесса, обширности поражения легочной ткани и наличию полостей распада [3]. Концентрация TNF? в крови коррелирует с тяжестью и исходом воспалительного процесса и поэтому может служить маркером активности заболевания [9]. В то же время, есть данные о снижении способности к их синтезу при ТЛ, а также об отсутствии значимых различий в их уровнях у пациентов с туберкулезом на разных стадиях развития заболевания [5]. Таким образом, данные литературы о содержании провоспалительных цитокинов IL1? и TNF? в кровибольных с различными заболеваниями и клиническом значении их уровней достаточно противоречивы, что, скорее всего, связано как с состоянием иммунной системы исследуемых пациентов, так и с отсутствием сопоставления уровней того или иного цитокина с наиболее значимыми признаками заболевания, о которых можно судить по патоморфологической картине, объективно отражающей патологический процесс. Кроме того, на уровни цитокинов оказывают влияние и антитела к ним, являющиеся специфическими ингибиторами (регуляторами активности цитокинов) и присутствующие в крови пациентов, получавших цитокиновую терапию [7]. Однако антитела к цитокинам могут продуцироваться организмом и вне цитокиновой терапии. Так, в работе, выполненной в нашем институте, было показано наличие высоких уровней антител к TNF? у больных раком молочной железы (РМЖ) [1], что, возможно, наблюдается и при других патологических процессах. Исходя из вышеизложенного, целью настоящего исследования явилось изучение уровней IL1? и TNF?, а также антител (АТ) к TNF? у больных РЛ, РМЖ, фиброаденоматозом (ФАМ) и ТЛ различной степени активности.
Материалы и методы
Материалом для исследования служила сыворотка крови 285 человек, среди них 56 — больных РЛ, 86 — РМЖ, 42 — ФАМ, 63 пациентов с различными формами ТЛ (с низкой степенью активности процесса — 19, умеренной — 18, высокой—26) и 38 здоровых донора, не имеющих в анамнезе указаний на онкологические заболевания и перенесенный в прошлом ТЛ. После хирургического вмешательства у больных со злокачественными новообразованиями проводили тщательное гистологическое исследование препаратов, при этом учитывали характер границ опухоли с окружающей тканью, выраженность инфильтрации, наличие опухолевых клеток в сосудах, число митозов, в том числе атипических. Кроме того, определяли в опухоли клеточные элементы различной степени зрелости (в %) — низкодифференцированные (НД), умеренно дифференцированные (УД), высокодифференцированные (ВД) клетки. По общепринятым критериям оценивали степень злокачественности и гистологический тип опухоли. У оперированных больных ТЛ гистологическим признакам, отражающим степень активности специфического процесса в легких (казеозный некроз, инфильтрация легочной ткани, полостные изменения, очаговые образования и фиброзно-склеротические процессы) была дана балльная оценка, согласно значимости того или иного признака. Средний балл при низкой степени активности составил 4,43 ± 0,43, умеренной—10,38 ± 0,53, высокой—19,06 ± 0,94. Такой подход дает возможность выявить корреляционные связи между уровнями исследуемых провоспалительных цитокинов и АТ к TNF? с данными патоморфологического исследования операционного материала. Содержание цитокинов определяли ИФА с использованием реагентов для количественного определения IL1? и TNF? производства предприятия «Протеиновый контур» (Санкт Петербург). Определение АТ класса IgG к TNF? также проводили с помощью твердофазного ИФА. Использовали TNF?, предоставленный НИКТИБАВ НПО «Вектор» (г. Новосибирск) в концентрации 40 мкг/мл. Уровни АТ класса IgG к TNF? определяли по коэффициенту (К), который представлял собой отношение оптической плотности продукта реакции в лунках с опытной сывороткой к оптической плотности продукта реакции в лунках с серонегативной сывороткой. Значения коэффициента, равные 1,20 или более высокие, считали положительными.
Результаты исследования обработаны статистически с использованием критериев Стьюдента (t), Вилкоксона—Манна—Уитни (U), метода углового преобразования Фишера (?) и коэффициента корреляции (r) по программе Statgraphics Plus. На основании анализа содержания того или иного цитокина и уровней АТ к TNF? больные и здоровые лица были рас/ пределены (в %) согласно градации (таблица 1).
Таблица 1 Градация содержания цитокинов (пкг/мл)
Результаты и обсуждение
Содержание IL1?, TNF? и уровни АТ к TNF? у больных и здоровых лиц представлены в таблице 2. Как видно из таблицы, наиболее низкий уровень IL1? отмечался в сыворотке крови здоровых лиц, а наиболее высокий—у больных РЛ. У больных РМЖ содержание IL1? было ниже, чем у больных ФАМ, но достоверно выше по сравнению со здоровыми лицами. У пациентов, страдающих различными формами ТЛ, содержание этого цитокина было достоверно выше по сравнению с группой доноров, причем это было характерно для больных
Таблица 2 Содержание IL1 ?, TNF ? и уровни АТ к TNF ? у больных и здоровых лиц
как с низкой, так и с умеренной и высокой степенями активности специфического процесса. Кроме того, внутри этой группы достоверные различия по содержанию IL1? были выявлены между больными с низкой и высокой степенями активности заболевания. Следовательно, содержание IL1? в сыворотке крови больных достоверно превосходило таковое у здоровых лиц и не зависело от нозологической формы заболевания. У больных РМЖ и РЛ также отмечено достоверное повышение содержания TNF? и уровней антител к нему по сравнению с донорами. У лиц с ФАМ содержание TNF? и АТ к TNF? было выше, чем в группе здоровых женщин, однако различия не были статистически значимыми. При ТЛ, по мере нарастания активности процесса, одновременно происходило повышение содержания этого цитокина и АТ к нему, достигая наибольших величин при высокой степени активности заболевания. Достоверные различия были получены между группами больных с низкой и высокой степенями активности специфического процесса. Так как содержание IL1? у больных и здоровых лиц колебалось в широких пределах, был проведен сравнительный анализ частоты встречаемости (%) их содержания в соответствии с вышеуказанной градацией (рис. 1, а, б). Анализ показал, что в диапазоне от 0 до 100 пкг/мл не наблюдалось достоверных различий в частоте встречаемости между донорами и больными с онкологической патологией. В диапазоне 101—200 пкг/мл частота встречаемости у доноров была более чем в два раза выше по сравнению с больными опухолевыми процессами. Главной отличительной особенностью явилось отсутствие в группе доноров, в отличие от больных, наиболее высоких показателей содержания IL1? (более 201 пкг/мл). У больных ТЛ, также как и у лиц с опухолевыми процессами, достоверные различия были получены только по частоте встречаемости IL1? в диапазоне 101–200 пкг/мл между донорами и больными с умеренной и высокой степенями активности процесса. Наиболее существенным признаком у больных со специфическим процессом явилось достоверно более высокая частота встречаемости IL1? в диапазоне содержания более 201 пкг/мл по сравнению со здоровыми лицами. Следовательно, как у доноров, так и у больных, за исключением лиц с ФАМ, доминирует высокая частота встречаемости низких уровней (от 0 до 100 пкг/мл) IL1? в сыворотке крови. Отличительной особенностью доноров явилось отсутствие в этой группе лиц с высоким (более 201 пкг/мл) содержанием IL1?. Что же касается больных, то анализ полученных данных показал наиболее высокий уровень IL1? при ФАМ и у больных ТЛ с высокой степенью активности процесса, преимущественно инфильтративной формой. В то же время, и низкие уровни IL1? значительно чаще встречались у больных с высокой степенью активности, но в основном при фиброзно-кавернозном ТЛ. Содержание TNF? в сыворотке крови больных и доноров также имело большой диапазон колебаний. Эти данные представлены на рис. 2, а, б. Как видно, в группах больных РЛ и особенно РМЖ достоверно чаще по сравнению с донорами встречались высокие уровни TNF?. У больных ТЛ с различными степенями активности процесса доминировала высокая частота встречаемости уровней TNF? в наиболее низком диапазоне (I — 0–50 пкг/мл). У лиц с низкой степенью активности эти данные можно объяснить слабовыраженными воспалительными изменениями в легких.
Рис. 1. Распределение (%) содержания IL/1? (пкг/мл) у больных и доноров
У больных с умеренной и высокой степенями активности довольно высокие частоты встречаемости низких уровней TNF? могли быть следствием наличия АТ к TNF? (рис. 3, а, б). При онкологической патологии, по сравнению со здоровыми лицами, достоверно чаще встречались высокие уровни АТ к TNF? (1,61 и более), особенно у больных РМЖ и ФАМ. При РЛ частота встречаемости высоких уровней АТ к TNF? была более чем в два раза ниже, чем у больных РМЖ и ФАМ. Таким образом, значительные различия в уровнях АТ к TNF?, по-видимому, связаны с локализацией опухоли и, вероятно, со степенью ее злокачественности. Выработка организмом АТ к TNF? может быть расценена как защитный механизм, направленный на нейтрализацию действия TNF? как на опухоль, так и на прилегающие к ней нормальные ткани. У больных ТЛ прослеживается некоторая закономерность: частоты встречаемости наиболее высоких уровней АТ к TNF? связаны со степенью активности процесса, возрастая от низкой к высокой. Изучение корреляционных связей между содержанием в крови провоспалительных цитокинов показало, что прямая корреляционная зависимость отмечается между уровнями IL1? и TNF? у больных РЛ (r = 0,450, p < 0,01), РМЖ (r = 0,370, p < 0,05), ФАМ (r = 0,610, p < 0,001) и ТЛ (r = 0,460, p < 0,001). Анализ патогистологической картины злокачественных новообразований позволил установить, что только между соотношением НД/УД клеток
Рис. 2. Распределение (%) содержания TNF? (пкг/мл) у больных и доноров
Рис. 3. Распределение (%) уровней антител к TNF? у больных и доноров
и содержанием IL1? существует прямая корреляционная зависимость (r = 0,461, p < 0,003). Значимые корреляционные связи морфологических признаков, отражающих активность туберкулезного процесса и выраженных в баллах, отмечены только при сравнении с уровнями АТ к TNF? (r = 0,408, p < 0,01). Среди больных ТЛ с высокой степенью активности процесса были лица с наиболее тяжелой формой заболевания—казеозной пневмонией, подтвержденной патоморфологическим исследованием, которые характеризовались сочетанием высокого содержания TNF? с наиболее низким уровнем АТ к нему. Именно такое сочетание, по нашему мнению, приводит к выраженной деструкции легочной ткани и, в конечном счете, к множественным полостным образованиям. При сочетании высокого содержания TNF? с высокими уровнями АТ к этому цитокину патоморфологическая картина свидетельствовала о наличии туберкулемы. Следовательно, характер течения ТЛ в значительной степени зависит от сочетания тех или иных уровней TNF? и антител к нему. Проведенные исследования показали, что для правильной интерпретации клинического значения содержания цитокинов в крови необходимо учитывать для онкологических больных—вариант дифференцировки опухоли, ее локализацию и степень злокачественности, для больных ТЛ— форму туберкулезного процесса, степень активности и уровни АТ к TNF?, обусловливающие характер исхода заболевания.
ЛИТЕРАТУРА
1. Аутеншлюс А.И., Иванова Г.Г., Сидоров С.В. и др. Содержание цитокинов и антител к ФНО? у больных раком молочной железы и фиброаденоматозом // Иммунология. — 2003. — № 3. — С. 140–142.
2. Гельцер Б.И., Маркелова Е.В., Просекова Е.В., Кочеткова Е.А. Система цитокинов и болезни органов дыхания // Тер. архив. — 2001. — № 11. — С. 94–99.
3. Демьянов А.В., Котов А.Ю., Симбирцев А.С. Диагностическая ценность исследования уровней цитокинов в клинической практике // Цитокины и воспаление. — 2003. — Т. 2, № 3. — С. 20–35.
4. Кноринг Б.Е., Симбирцев А.С., Сахарова И.Я. и др. Продукция цитокинов при разных формах туберкулеза легких // Пробл. туберк. — 1998. — № 3. — С. 67–71.
5. Мишин В.Ю., Павлюк А.С., Заречнова Т.Ю. и др. Система и активность энергетических ферментов лимфоцитов у впервые выявленных больных туберкулезом легких // Пробл. туберк. — 1988. — № 6. — С. 55–59.
6. Якубовская Р.И. Современные представления о молекулярных механизмах канцерогенеза и опухолевой прогрессии как основа разработки новых методов терапии злокачественных новообразований // Росс. онкол. журн. — 2000. — № 6. — С. 42–50.
7. Bendzen K., Svenson M., Jmnsson V., Hippe E. Autoantibodies to cytokines — friends or foes// Immunol. Today. — Vol. 11. — P. 167–169.
8. Kurosowa T., Shimocala K. Cooperation between accessory cells and T lymphocytes in patients with tuberculous pleuries // Chest. — 1991. — Vol. 100. — P. 1046–1052.
9. Jufermans N.P., Verbon A., van Deventer S.J. et al. Tumor necrosis factor and interleukin/1 inhibitors as markers of disease activity of tuberculosis // Am. J. Respir. Crit. Care Med. — 1998. — Vol. 157. — P. 1228–1231.
IL1 ? and TNF ? cytokines content and the level of anti TNF ? antibodies in patients with oncological and inflammatory diseases A.I. Autenshlus, A.N. Shkunov, G.G. Ivanova, A.V. Proskura, E.S. Mikhailova, U.V. Sedova, N.B. Kuznetsova, D.V. Morozov, A.V. Klimenkov, S.V. Sidorov Institute of Molecular Biology and Biophysics, SB RAMS, Novosibirsk
Serum levels of IL1 ?, TNF? and anti TNF? antibodies were measured by ELISA in patients with lung cancer, mammary gland cancer, fibroadenomatosis and pulmonary tuberculosis and in healthy donors. It was concluded that for correct clinical interpretation of blood cytokine levels, the following clinical and pathological features should be taken into account: in oncological patients — the variant of tumor differentiation, its localization and degree of malignancy, in pulmonary tuberculosis patients — the form of the process, degree of activity and the level of anti TNF ? antibodies determining an outcome of the disease. (Cytokines and Inflammation. 2005. Vol. 4, № 3. P. 11–15.)
Key words: cytokines, anti TNF? antibodies, oncological and inflammatory diseases. IL1 ? and TNF ? cytokines content and the level of anti TNF ? antibodies in patients with oncological and inflammatory diseases A.I. Autenshlus, A.N. Shkunov, G.G. Ivanova, A.V. Proskura, E.S. Mikhailova, U.V. Sedova, N.B. Kuznetsova, D.V. Morozov, A.V. Klimenkov, S.V. Sidorov Institute of Molecular Biology and Biophysics, SB RAMS, Novosibirsk
Serum levels of IL1? , TNF? and anti TNF? antibodies were measured by ELISA in patients with lung cancer, mammary gland cancer, fibroadenomatosis and pulmonary tuberculosis and in healthy donors. It was concluded that for correct clinical interpretation of blood cytokine levels, the following clinical and pathological features should be taken into account: in oncological patients — the variant of tumor differentiation, its localization and degree of malignancy, in pulmonary tuberculosis patients — the form of the process, degree of activity and the level of anti TNF ? antibodies determining an outcome of the disease. (Cytokines and Inflammation. 2005. Vol. 4, № 3. P. 11–15.)
Key words: cytokines, anti/TNF? antibodies, oncological and inflammatory diseases.
