загрузка...
 
О.Е. Розанова, Л.Н. Бубнова ГУ Российский НИИ гематологии и трансфузиологии, Санкт Петербург Цитокинопосредованные аспекты иммунопатогенеза апластической анемии
Повернутись до змісту

О.Е. Розанова, Л.Н. Бубнова ГУ Российский НИИ гематологии и трансфузиологии, Санкт Петербург Цитокинопосредованные аспекты иммунопатогенеза апластической анемии

С целью выяснения цитокинопосредованных аспектов иммунопатогенеза апластической анемии (АА) методом иммуноферментного анализа исследованы синтез и соотношение некоторых гемо( поэтических факторов — цитокинов, продуцируемых, в основном, клетками иммунной  системы и оказывающих позитивное (IL1?, IL2, IL6, эритропоэтин — EPO) или негативное (TNF?, IFN?) влияние на  гемопоэз, а  также являющихся антагонистами негативных регуляторов  гемопоэза  IL4. Объектом исследования служили мононуклеарные клетки периферической крови и костного мозга 68 больных АА и мононуклеары периферической крови 35 кадровых доноров. Установлено, что вклад иммунной системы в развитие депрессии кроветворения при АА обусловлен не снижением синтеза позитивных гемопоэтических факторов, но сверхпродукцией негативных регуляторов гемопоэза, а именно, TNF?. Дисбаланс соотношения цитокинов при данном заболевании усугубляется недостаточной продукцией антагониста негативных регуляторов —  IL4.  (Цитокины и воспаление. 2005.  Т. 4, № 4. С. 34–38.)

Ключевые  слова:  апластическая  анемия,  гемопоэз, цитокины, мононуклеары.

Известно, что гемопоэтические ростовые факторы—гемопоэтины, к которым относятся различные колониестимулирующие факторы (CSF), эритропоэтин  (EPO) и целый ряд цитокинов,— являются неотъемлемой частью кроветворения и оказывают влияние на все его этапы. В зависимости от характера этого влияния их условно разделяют на позитивные и негативные регуляторы  гемопоэза. К позитивным регуляторам относятся те факторы, которые поддерживают пролиферацию полипотентной стволовой клетки  (PPSC), миелоидных, эритроидных и лимфоидных предшественников, стимулируя соответствующие ростки кроветворения. Это, прежде всего, различные CSF, EPO, цитокины: IL1, IL3, IL6, IL11 и т.д.  [2]. Другие цитокины, такие как TNF,  IFN, трансформирующий фактор роста (TGF), напротив, могут снижать клоногенность всех типов предшественников  гемопоэтических клеток, способны подавлять эритро, моно и гранулопоэз и относятся к негативным регуляторам гемопоэза [4, 16]. Апластическая анемия (АА)—одно из самых тяжелых заболеваний системы крови, патогенез которого до настоящего времени не ясен.

Среди трех основных концепций, объясняющих депрессию кроветворения при АА:

1) поражением стволовой клетки,

2) дефектностью гемопоэтического микроокружения и

3) иммуноопосредованными механизмами,—последняя привлекает все большее внимание исследователей [10, 15]. Действительно, иммуносупрессивная терапия при АА вызывает клинико гематологическое улучшение или ремиссию и, кроме того, именно клетки иммунной системы являются основными продуцентами большинства вышеперечисленных гемопоэтических факторов.

С целью выяснения цитокинопосредованных аспектов иммунопатогенеза заболевания, задачами настоящей работы были:

1) изучение синтеза гемо

поэтических факторов, продуцируемых, в основном, клетками иммунной системы и оказывающих позитивное или негативное влияние на эритро, тромбо и  гранулопоэз—наиболее уязвимые при АА звенья гемопоэза;

2) изучение продукции антагонистов негативных регуляторов гемопоэза и факторов, поддерживающих пролиферацию Т лимфоцитов, поскольку при угнетении эритро, тромбо и  гранулопоэза лимфоидный росток кроветворения у больных АА остается относительно сохранным. Для решения поставленных задач у больных определяли уровень EPO в   сыворотке крови, а также продукцию мононуклеарами периферической крови и костного мозга таких цитокинов, как  IL1?,  IL6, TNF?, IFN?, а также IL4 и IL2. Большинство цитокинов плейотропны, действуют в синергизме друг с другом или являются антагонистами и, в зависимости от условий, оказывают как ингибирующее, так и стимулирующее действие на все типы клеток, в том числе на  ге мопоэтические предшественники  [6, 11]. Регуляторные эффекты цитокиновой сети построены на равновесии оппозитных пулов молекул, нарушение которого может приводить к патологии  [5]. Поэтому у больных АА мы оценивали также соотношение тех факторов, которые условно принято относить к позитивным или негативным регуляторам гемопоэза.

Материалы и методы

Объектом исследования  служили мононуклеарные клетки периферической крови и костного мозга 68 больных тяжелой АА в возрасте от 19 до 65 лет, находившихся на лечении в гематологической клинике РосНИИ  ГТ  с 1995 по 2004  г. Для определения  тяжести  заболевания использовали комплекс гематологических критериев, разработанных международной группой изучения апластической анемии [7]. Контролем служили мононуклеары 35 практически здоровых людей (кадровых доноров крови) в возрасте от 22 до 65 лет. Уровень EPO и цитокинов исследовали иммуноферментным методом с помощью диагностикумов фирм «R&D» (США) и «Протеиновый контур»  (Санкт Петербург). Для оценки продукции цитокинов  in  vitro мононуклеары, выделенные из крови или из пунктата костного мозга центрифугированием на  градиенте плотности  Lymphoprep  (Sigma, ? = 1,077  г/см3),  культивировали 24 ч при 37о С и 5% СО2 в 96 луночных планшетах в  количестве 2 ? 105 на лунку в среде RPMI 1640 с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки и 80 мкг/мл гентамицина. Синтез TNF?, IFN?, IL1? и IL6 индуцировали ЛПС содержащим препаратом пирогеналом (0,1 мкг/лунку), синтез IL2 и IL4—фитогемагглютинином (10 мкг/лунку). Не стимулированные культуры  служили для оценки  спонтанной продукции цитокинов. Все пробы ставили в  триплетах. Супернатанты культур исследовали на наличие цитокинов. Статистическую обработку данных проводили  с помощью программы Statistica 4.5. Данные выражали в виде  средних арифметических и их стандартных ошибок (M ± m). Достоверность различий между  сравниваемыми величинами определяли по  t критерию Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Первый этап исследований был посвящен изучению продукции «позитивных» регуляторов  гемопоэза, поддерживающих пролиферацию PPSC и стимулирующих эритро, тромбо и  гранулопоэз—EPО, IL1 и IL6. Считается, что уровень EPO, составляющий 3,3 мЕ/мл, достаточен для поддержания нормального эритропоэза, а при уровне EPO выше 200 мЕ/мл лечение больных эритропоэтином нецелесообразно. У больных АА были выявлены очень широкие колебания уровня EPO: у 13 больных он составлял от 5 до 175 мЕ/мл  (в среднем 63,2), а у 24 больных—от 200 до 700 мЕ/мл (в среднем 618,3) и превышал рубеж в 200 мЕ/мл. Содержание эритропоэтина в сыворотке доноров колебалось от 3,3 до 16,6  (в среднем 10,0). Таким образом, 35 % больных АА характеризовались нормальным и повышенным и 65 %—высоким содержанием EPO; ни у одного больного уровень EPO не был ниже нормативных показателей (рис. 1). Полученные данные подтверждают существующее мнение об эритропоэтин независимости АА, то есть о выраженном угнетении эритроидного ростка кроветворения при высоком уровне EPO [1].

Данные об уровне позитивных регуляторов  гемопоэза—IL1? и IL6—у больных АА представлены в табл. 2. При определенных условиях  IL1? и  IL6 могут индуцировать апоптоз, а  IL1?—угнетать поздние стадии эритропоэза [8], тем не менее эти цитокины положительно влияют на тромбо и гранулопоэз, а их стимулирующее действие на PPSC позволяет отнести их к положительным гемопоэтическим факторам  [12]. Как следует из данных табл. 2, спонтанная продукция IL1? была повышена у больных АА в костном мозге в среднем в 1,7 раза и в периферической крови в 6,5 раз; спонтанная продукция IL6—в 2,8 и 3,9 раза, соответственно. При этом индуцированная продукция цитокинов находилась в пределах нормальных величин  (IL1?—мононуклеары крови) или была значительно снижена (IL6—мононуклеары крови и костный мозг,  IL1?—костный мозг).

В результате этого соотношение спонтанной и стимулированной продукции обоих цитокинов было нарушено как в периферической крови, так и в костном мозге (особенно). Как известно, спонтанная продукция цитокина in vitro свидетельствует о предсуществующей активации клеток in vivo.

 

Рис. 1. Распределение больных  апластической  анемией по  уровню  эритропоэтина

Поскольку уровень EPO и спонтанная продукция IL1? и IL6, у больных АА повышены, аплазия в этой  группе пациентов не может быть обусловлена недостаточным синтезом этих положительных гемопоэтических факторов. Следующей задачей была оценка уровня цитокинов—негативных регуляторов гемопоэза (табл. 3). Спонтанная продукция IFN? клетками костного мозга была несколько снижена, а клетками периферической  крови  не сколько превышала показатели нормы, однако эти изменения не были достоверными. Что касается другого негативного гемопоэтического фактора—TNF?, то установлено резкое повышение его продукции клетками и костного мозга, и периферической крови (в 5 и более чем в 10 раз, соответственно). Для негативных регуляторов  гемопоэза (TNF? и IFN?) также выявлено существенное нарушение соотношения их спонтанной и стимулированной продукции.

Таким образом, у больных АА имеют место серьезные нарушения  цитокинового статуса: с одной стороны, резко повышена продукция негативного регулятора  гемопоэза TNF?, с другой— повышена  (или, по крайне мере, не отличается от нормы) продукция положительных гемопоэтических факторов. Чтобы выяснить, какие из цитокинов, продуцируемых клетками иммунной системы, являются доминирующими при АА, проанализировано соотношение уровня спонтанной продукции негативного регулятора TNF? с уровнями положительных гемопоэтических факторов у каждого конкретного больного на тот же момент обследования (табл. 4). Из представленных данных видно следующее: при самых разнообразных показателях синтеза IL1? и IL6 у больных АА — и соответствующих норме (Бва), и повышенных (Шев), и высоких  (Мер)—все больные характеризовались резким повышением продукции TNF?  (не менее чем в 10 раз). Это позволяет сделать вывод о том, что не столько синтез положительных гемопоэтических факторов, сколько сверхпродукция негативных регуляторов гемопоэза (именно TNF?) определяет вклад клеток иммунной системы в развитие АА. У больных АА был изучен также синтез анта гониста негативных регуляторов гемопоэза (IL4)

Таблица  2 Продукция IL(1? и IL(6 клетками больных апластической анемией (пг/мл)

 

Примечание. Здесь и в других  таблицах и рисунках: показатели нормы даны для периферической  крови доноров; * — различия достоверны по  сравнению  с нормой  (p < 0,05).

Таблица  3 Продукция IFN? и TNF? клетками больных апластической анемией (пг/мл)

 

Таблица  4 Соотношение негативных и позитивных регуляторов гемопоэза у больных апластической анемией

 

Таблица  5 Продукция IL(2 и IL(4 клетками больных апластической анемией (пг/мл)

 

и фактора, поддерживающего рост Т лимфоцитов (IL2). Спонтанная продукция IL4 клетками костного мозга и периферической крови была снижена в 1,4 раза, а спонтанная продукция IL2 как в костном мозге, так и в периферической  крови превышала  норму  более чем в 8 раз  (табл. 5).

Таким образом, дисбаланс соотношения цитокинов при АА, проявляющийся в сверхпродукции негативного фактора — TNF?, усугубляется недостаточным синтезом антагониста негативных регуляторов и повышенной продукцией фактора, поддерживающего пролиферацию Т лимфоцитов. Положение о доминирующей роли негативных регуляторов  гемопоэза в патогенезе АА подтвердилось при анализе динамики продукции цитокинов у больных АА в процессе терапии сандиммуном, одним из механизмов действия которого является снижение уровня цитокинов (см. рис. 2, а, б, в). Как видно из представленных данных, успешной терапии (с выходом в частичную или полную клинико гематологическую ремиссию) соответствовало снижение уровня спонтанной продукции TNF? и IL1? клетками как периферической крови, так и костного мозга, в среднем в 1,5 и 2 раза. При этом соотношение спонтанной и стимулированной продукции  IL1 в костном мозге практически восстанавливалось. При эффективной терапии спонтанная продукция  IL6 возрастала в среднем в 2,5 раза, причем в костном мозге эти процессы происходили более активно. Доминирующая роль негативных регуляторов гемопоэза при АА подтверждается и работами зарубежных авторов, показавших, что TNF? и IFN? ингибируют чувствительность клеток к  гемопоэтическим факторам, блокируя соответствующие рецепторы  [13]. Таким образом, эритропоэтин независимость АА, для которой характерно угнетение эритроидного ростка кроветворения при высоком уровне EPO, а также отсутствие должного эффекта при терапии больных АА колониестимулирующими  факторами  можно объяснить тем, что высокий уровень TNF?, продуцируемого клетками иммунной системы, делает недоступными те или иные  гемопоэтические факторы для клеток предшественников. То же самое можно предположить и по поводу сообщений о тромбопоэтиннезависимости АА—выраженном угнетении тромбопоэза при достаточно высоком уровне тромбопоэтина [9]. Ряд авторов  [3, 14] указывают на способность TNF? и IFN? оказывать прямое и опосредованное бактерицидное действие на некоторые микробные возбудители, а также нейтрализовывать эндотоксины некоторых грамположительных и грамотрицательных бактерий. Этим можно объяснить парадоксальный факт, характерный для АА: чрезвычайную устойчивость больных к инфекционным заболеваниям при тяжелейшей нейтропении или агранулоцитозе. По всей видимости, высокий уровень TNF?, которым характеризуются больные АА, обеспечивает им некоторую защиту от патогенных возбудителей.

Таким образом, выраженное угнетение гемопоэза, характерное для АА, во многом обусловлено

 

Рис. 2. Динамика продукции цитокинов

нарушением содержания и соотношения цитокинов, продуцируемых клетками иммунной системы, которое проявляется не только в повышенном синтезе всех изученных в работе  гемопоэтических факторов, но, особенно, в сверхпродукции мононуклеарами периферической крови и костного мозга негативного регулятороа гемопоэза—TNF?. Дисбаланс соотношения цитокинов при АА усугубляется недостаточным синтезом антагониста негативных регуляторов  IL4 и повышенной продукцией фактора, поддерживающего рост Т лимфоцитов—IL2. Столь выраженные нарушения синтеза и соотношения цитокинов, продуцируемых клетками иммунной системы, свидетельствуют о важной роли иммуноопосредованных механизмов в формировании депрессии кроветворения при АА, а понимание этих процессов поможет оптимизировать имеющийся комплекс терапевтических мероприятий и, возможно, выработать новые, патогенетически обоснованные методы лечения.

ЛИТЕРАТУРА

1. Абдулкадыров К.М., Бессмельцев С.С. Апластическая анемия. — М.: Наука, 1995. — 232  с.

2. Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Иммунология для врача. — СПб.: Гиппократ, 1998. — 156  с.

3. Маркелова Е.В., Просекова Е.В., Недобыльский О.В. Роль цитокинов в патогенезе пневмоний // Мед. иммунол. — 2000 — Т. 2, № 4. — С. 369–375.

4. Орловская И.А., Шкловская Е.В., Козлов В.А. Негативные регуляторы гемопоэза. Гомеостатическая роль в формировании взаимоотношений между гемопоэтической и иммунной системами // Иммунология. — 1996. — № 5. — С. 8–13.

5. Фрейдлин И.С., Тотолян А.А. Клетки иммунной системы. Т. III–V. — СПб.: Наука, 2001. — 392 с.

6. Ярилин А.А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и при патологии // Иммунология. — 1997. — № 5. — С. 7–13.

7. Camitta B.M., Storb R., Thomas E.D. Aplastic anemia: pathogenesis, diagnosis, treatment, and prognosis // N. Engl. J. Med. — 1982. — Vol. 306, № 12. — P. 712–718.

8. Fandrey J., Jelkmann W.E. Interleukin 1 and tumor necrosis factor alpha inhibit erythropoietin production  in  vitro  // Ann. N.Y. Acad. Sci. — 1991. — Vol. 628. — P. 250–255.

9. Gu  J.,  Lu  L., Xu R., Chen X. Plasma  thrombopoietin  levels  in patients with aplastic anemia and idiopathic thrombocytopenic purpura // Chin. Med. J. — 2002. — Vol. 115, № 7. — P. 983–986.

10. Hsu H.C., Tsai W.H., Chen L.Y. et al. Overproduction of inhibitory hematopoietic cytokines by  lipopolysaccharide activated peripheral blood mononuclear  cells in patients with aplastic anemia // Ann. Hematol. — 1995. — Vol. 71, № 6. — P. 281–286.

11.Kawano Y.,  Takaue Y., Hirao A. et  al.  Synergistic effect of  recombinant interferon gamma and  interleukin 3 on  the growth of  immature human hematopoietic progenitors  // Blood. — 1991. — Vol. 77, № 10. — P. 2118–2121.

12. Kitamura K. Clinical application of new cytokines // Jpn. J. Clin. Pathol. — 1993. — Vol. 41, № 4. — P. 390–398.

13. Novitzky N.,  Jacobs P.  In  aplastic  anemia progenitor  cells have a  reduced sensitivity to the effect of gowth factors // Eur. J. Haematol. — 1999. — Vol. 63, № 3. — P. 141–148.

14.O’Brien D.P., Briles D.E.,  Szalai A.J. et  al.  Tumor necrosis  factor alpha receptor  I  is  important  for  survival  from Streptococcus pneumoniae infections // Infect. Immun. — 1999. — Vol. 67, № 2. — P. 595–601.

15.Young N.S. Hematopoietic  cell destruction by  immune mechanisms  in acquired aplastic anemia // Semin. Hematol. — 2000. — Vol. 37, № 1. — P. 3–14.

16. Yu J.M., Emmons R.V., Hanazono Y. et al. Expression of  interferongamma by stromal cells inhibits murine longterm repopulating hematopoietic stem cell activity // Exp. Hematol. — 1999. — Vol. 27, № 5. — P. 895–903.

Cytokine(mediated aspects of immunopathogenesis of aplastic anemia O.E. Rozanova, L.N. Bubnova Russian Research  Institute of Hematology and Transfusiology, St. Petersburg

To establish the cytokine(mediated aspects of immunopathogenesis of aplastic anemia (AA) we studied the synthesis and balance of some hemopoietic factors — cytokines produced mainly by immune cells and  serving as positive  (IL1?,  IL2,  IL6, EPO) or negative  (TNF?,  IFN?) hemopoiesis  regulators. Synthesis of  IL4 as an antagonist of negative hemopoiesis  regulators was also  studied. Peripheral blood and bone marrow mononuclear cells of 68 AA patients and peripheral blood mononuclear cells of 35 blood donors were investigated. We have established that immune system participation in hemopoiesis depression development in AA was not linked with decrease of hemopoiesis positive regulators synthe( sis, but mostly was due to over(production of negative  regulators, predominantly TNF? . Cytokine  im( balance in AA is aggravated by insufficient production of IL4 — the antagonist to negative hemopoiesis regulators. (Cytokines and Inflammation. 2005. Vol. 4, № 4. P. 34–38.)

Key words: aplastic anemia, hemopoiesis, cytokines, mononuclears.



загрузка...