загрузка...
 
Т.Е. Белокриницкая , Ю.А. Витковский , Ю.Н. Пономарева , М.Н. Мочалова , Г.М. Ломнева  Читинская  государственная медицинская академия;  Читинский областной диагностический центр Фактор некроза опухолей ? и трансформирующий фактор роста ? в регуляции апоптоза и пролиферации клеток при дисплазии и раке шейки матки
Повернутись до змісту

Т.Е. Белокриницкая , Ю.А. Витковский , Ю.Н. Пономарева , М.Н. Мочалова , Г.М. Ломнева  Читинская  государственная медицинская академия;  Читинский областной диагностический центр Фактор некроза опухолей ? и трансформирующий фактор роста ? в регуляции апоптоза и пролиферации клеток при дисплазии и раке шейки матки

 Целью работы было изучение возможной роли TNF? и TGF? в регуляции апоптоза и пролиферации клеток при дисплазии и раке шейки матки. Проведено исследование цервикальной слизи и биоптатов шейки матки 164 пациенток с предраковыми и злокачественными заболеваниями шейки матки. Содержание  TNF? и TGF? в цервикальной  слизи определяли иммуноферментным методом, апоптоз и пролиферативную активность клеток цервикального  эпителия  иммуногистохимически с использованием моноклональных антител к p53, Bcl 2 и PCNA. При дисплазии шейки матки обнаружено увеличение уровня TNF?, TGF?  и экспрессии p53, PCNA по сравнению с контрольной группой. Цервикальный рак характеризовался высокими значениями TGF? на фоне показателей  TNF?, которые  статистически не отличались от  таковых при дисплазии шейки матки. Содержание p53 и PCNA в цервикальных опухолях увеличилось по сравнению с уровнем их экспрессии при предраковых изменениях шейки матки. В карциномах шейки матки обнаружен Bcl2, экспрессия которого отсутствовала в контрольной группе и при цервикальной дисплазии. Итак, в развитии дисбаланса между процессами пролиферации и апоптоза при диспластическом и злокачественном поражении шейки матки, на наш взгляд, могут иметь значение как апоптоз специфические, так и приведенные нами цитокин опосредованные механизмы регуляции клеточного роста. (Цитокины и воспаление. 2006. Т. 5, № 1. С. 31–33.)

Ключевые  слова: цитокины, апоптоз, пролиферация, рак шейки матки.

В настоящее время в реализации противоопухолевого иммунитета особое значение уделяется цитокинам, обеспечивающим поддержание клеточного  гомеостаза организма  [1]. Известно, что опухолевой рост является результатом дисбаланса между пролиферацией клеток и апоптозом. В регуляции этих процессов важная роль принадлежит цитокинам, в том числе фактору некроза опухолей ?  (TNF?) и трансформирующему фактору роста ? (TGF?) [4, 5, 6]. Несмотря на активное изучение роли отдельных цитокинов в реализации противоопухолевого иммунитета при заболеваниях шейки матки, особенности взаимосвязи цитокинового обмена с пролиферацией и апоптозом клеток цервикального эпителия изучены недостаточно [9, 10]. В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение возможной роли TNF? и TGF?в регуляции апоптоза и пролиферации клеток при диспластических и злокачественных заболеваниях шейки матки.

Материалы и методы

Нами проведено проспективное исследование цервикальной слизи и биоптатов шейки матки 164 пациенток с дисплазией и раком шейки матки, которые находились на обследовании и лечении в Читинском областном онкологическом диспансере в 2001–2004 гг. Забор цервикальной слизи проводили в фолликулиновую фазу овариального цикла до проведения комплексного обследования, биоптатов шейки матки — до начала лечения. Диагностика  заболеваний шейки матки включала в  себя клинические, кольпоскопические, цитогистологические и иммуногистохимические методы исследования. Стадирование предраковых процессов шейки проводили в  соответствии с общепринятой Международной статистической классификацией болезней (1992), гистологической классификацией опухолей женского полового тракта ВОЗ (1995) и рака шейки матки в  соответствии  с классификацией по  системе TNM и по системе FIGO (1997). У 41,1 ± 5,2% пациенток была выявлена дисплазия шейки матки I–III степени тяжести и у 58,9 ± 5,9% — цервикальная карцинома  I–III  стадии. Возраст обследованных больных варьировал от 23 до 59 лет и, в среднем  составил 41,9 ± 6,9  года. Контрольную  группу  составили 30 здоровых женщин, сопоставимых по возрасту, данным анамнеза и не имеющих в настоящее время  заболеваний шейки матки. Определение TNF? и TGF?  (пг/мл) в цервикальной  слизи проводили  с помощью  стандартных коммерческих наборов для прямого иммуноферментного анализа компании «ДРГ Биомедикал»  (Санкт Петербург) в лаборатории патологии и физиологии  гемостаза Читинской медицинской академии. В качестве  стандарта для  сравнения  служили TNF? и TGF? известной концентрации, входящие в набор реагентов  [3]. Апоптоз и пролиферативную активность клеток цервикального эпителия определяли иммуногистохимическим методом в лаборатории патоморфологии областного диагностического центра  г. Читы. При изучении пролиферативных процессов использовали определение антигена ядер пролиферирующих клеток (PCNA), при оценке клеточной гибели — экспрессию промотора апоптоза  гена p53 и антиапоптозного  гена  Bcl2.  Иммуногистохимическое исследование проводили на  серийных парафиновых  срезах толщиной 5 мкм. Срезы инкубировали с антителами к PCNA (Dako, Дания, клон PC)10, предварительное разведение р53  (Dako, Дания, клон DO)7, рабочее разведение 1:100), Bcl2  (Dako, Дания, клон 124, рабочее разведение 1:20). Сроки инкубации для всех антител составили 18 ч при температуре 4 °С. Для иммунного окрашивания использовали стрептавидин биотин пероксидазный метод (Dako, Дания), во всех  случаях проводили докрашивание ядер  гематоксилином. Подсчет проводили в 20 произвольно выбранных полях зрения при увеличении ? 400. Индексы мечения PCNA и р53 рассчитывали как отношение числа позитивно окрашенных ядер к общему числу ядер. При исследовании препаратов, окрашенных антителами к Bcl2, рассчитывали отношение иммуногистохимически позитивных клеток с окрашенной цитоплазмой к общему числу клеток [7, 8]. Данные представлены в виде M ± m, где M—среднее арифметическое, m—ошибка  среднего. Для оценки  статистически значимых различий полученных данных использовали критерий Стьюдента  (t), критический  уровень  значимости принимался равным 0,05. Результаты и обсуждение В результате проведенного исследования, была выявлена следующая динамика уровня TNF?, TGF? и экспрессии p53, Bcl2, PCNA (таблица). При диспластических изменениях цервикального эпителия обнаружено 8 кратное увеличение уровня TNF? и TGF? по сравнению с контрольной группой  (p = 0,01). При этом экспрессия p53 и PCNA была соответственно в 12 и 5 раз выше, чем у здоровых женщин (p = 0,05). Так же, как и в контроле, при предраковом поражении шейки матки не было выявлено клеток с экспрессией Bcl2. Цервикальный рак характеризовался высокими значениями TGF? на фоне показателей TNF?, которые статистически не отличались от тако вых при дисплазии шейки матки (соответственно p = 0,001 и p = 0,07). Содержание p53 в цервикальных опухолях увеличилось в 1,2 раза и PCNA в 1,3 раза по сравнению с уровнем их экспрессии при предраковых изменениях шейки матки  (соответственно p = 0,008 и p = 0,0001). В карциномах шейки матки был обнаружен Bcl2, экспрессия которого отсутствовала в контрольной группе и при диспластическом поражении цервикального эпителия.

Таким образом, развитие предраковых изменений цервикального эпителия связано с максимальной цитотоксической активностью макрофагов, что проявляется высоким содержанием в эндоцервикальной слизи TNF? и TGF?. Злокачественное поражение шейки матки сопровождается увеличением экспрессии TGF? на фоне стабильно высоких показателей TNF?, которые статистически не отличаются от таковых при цервикальной дисплазии. Очевидно, что TNF? стимулирует экспрессию TGF?, который подавляет затем его секрецию, деактивируя макрофаги  [2]. Высокое содержание TNF? в эндоцервикальной слизи ассоциировано с максимальными уровнями экспрессии проапоптозного  гена р53 при предраке шейки матки с последующей тенденцией к его

Таблица Динамика содержания TNF?,TGF? и экспрессии p53, Bcl2 и PCNA при дисплазии и раке шейки матки, М ± m

 

Примечание. Достоверность различий: * — по  сравнению  с показателями  здоровых женщин;  — между  аналогичными показателями при дисплазии и раке шейки матки.

снижению в клетках цервикальных опухолей. В свою очередь, антиапоптозный  ген Bcl2 обнаружен только при злокачественном поражении шейки матки на фоне высоких значений TGF?, который, вероятно, участвует в инициации этого протоонкогена. Возможно, что повышение экспрессии TGF? на этапе предракового поражения цервикального эпителия приводит к торможению роста клеток, а последующая малигнизация сопровождается снижением восприимчивости опухолевых клеток к антипролиферативному действию TGF? и индукцией протоонкогенов с высокими уровнями этого цитокина в цервикальной слизи и реализацией его иммуносупрессивного и ангиогенного эффектов. При сопоставлении экспрессии Bcl2 с уровнями апоптоза при карциноме шейки матки оказалось, что высокой экспрессии Bcl2 соответствуют низкие уровни р53. Экспрессия PCNA, отражающего пролиферативную активность цервикального эпителия, была значительно выше в злокачественных опухолях в отличие от дисплазии и нормальногоэпителия, что может быть обусловлено стимулирующим влиянием на пролиферацию протоонкогена Bcl2 с подавлением апоптоза. Косвенным подтверждением этого может являться локализация Bcl2 позитивных клеток в тех же участках опухолей,  в  которых  локализовались  р53  и PCNAпозитивные клетки. Полученные данные убедительно свидетельствуют об активном участии цитокинов в модуляции процессов апоптоза и пролиферации клеток цервикального эпителия при дисплазии и раке шейки матки. Злокачественное поражение отличается от предракового более низкими параметрами апоптоза и более высокими показателями экспрессии PCNA и Bcl 2, что свидетельствует о высокой пролиферативной активности и за медлении гибели опухолевых клеток. В развитии дисбаланса между процессами пролиферации и апоптоза, на наш взгляд, могут иметь значение как апоптоз специфические эндонуклеазы и рецепторы, так и приведенные нами цитокин опосредованные механизмы регуляции клеточного роста.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бережная Н.М., Чехун В.Ф. Система интерлейкинов и рак. — Киев: ДИА, 2000. — 224  с.

2. Зубова С.Г., Окулов В.Б. Молекулярные механизмы действия фактора некроза опухолей ? и  трансформирующего фактора роста ? в процессе ответа макрофага на активацию // Иммунология. — 2001. — № 5. — С. 18–21.

3. Иммуноферментный анализ / Под ред. Т.Т. Нго, Г.М. Ленхофф. — М.: Мир, 1988. — 444 с. 4. Кулаков В.И., Сухих  Г.Т.,  Гатаулина Р.Г. Апоптоз в клинике  гинекологических заболеваний // Пробл. репрод. — 1999. — № 2. — С. 15–26.

5. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). — М.: Медицина, 2001. — 192  с.

6.Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека / Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. — Казань, 2004. — 456 с.

7. Хариет Э.Р., Гаттер К.С. Иммуноцитохимия: электронная микроскопия // Молекулярная клиническая диагностика. Методы.; пер. с англ.; ред. С. Херрингтон, Дж. Макги. — М.: Мир, 1999. — 558 с.

8. Эллиниди В.Н., Аникеева Н.В., Максимова Н.А. Практическая иммуноцитохимия. — СПб.: ВЦЭРМ МЧС России, 2002. — 36 с.

9. Akca H., Akan S.Y., Yanikoglu A., Ozes O.N. Suppression of TNF alpha mediated apoptosis by EGF  in TNF alpha  sensitive human  cervical  carcinoma cell line // Growth Factors. — 2003. — Vol. 21, № 1. — P. 31–39.

10. Yasui H., Adachi M.,  Imai K. Combination of  tumor necrosis  factor)alpha with sulindac in human carcinoma cells in vivo // Ann. N. Y. Acad. Sci. — 2003. — Vol. 10, № 10. — Р. 273–277.

TNF?  and TGF? in regulation of apoptosis and cell proliferation in cervical intra%epithelial neoplasia and carcinoma of uterine cervix T.Ye. Belokrinitskaya1 , Yu.A. Vitkovsky1 , Yu.N. Ponomaryova1 , M.N. Mochalova1 , G.M. Lomneva2 1  Chita State Medical Academy;  2  Regional Diagnostic Centre, Chita

The aim of  the  study:  to  investigate  the  role of  TNF? and  TGF?  in apoptosis and  cell proliferation regulation in cervical intra%epithelial neoplasia (CIN) and carcinoma of uterine cervix. Methods: tissue sampling of  cervical mucosa and uterine  cervix were  studied  in 164 patients with CIN and  cervical tumours. The level of TNF?  and TGF? n cervical mucosa was determined with ELISA; apoptosis and cell proliferation were marked immunohistochemically with monoclonal antibodies to p53, Bcl 2 and PCNA. Results: there were an  increased  level of TNF?, TGF? and expression of p53 and PCNA  in CIN patients in comparison with the control group. Cervical carcinoma was characterized by high TGF?, but not TNF?, levels. Expression of p53 and PCNA was increased in comparison with the levels of their expression in CIN. The Bcl 2 expression was detected  in carcinoma patients but not  in control group and  in cervical precancerosis. Conclusion: changes of TNF?  and TGF? in cervical mucosa take place in development of imbalance between apoptosis and cell proliferation in CIN and cancer of uterine cervix. (Cytokines and Inflammation. 2006. Vol. 5, № 1. P. 31–33.)

Key words: cytokines, apoptosis, cell proliferation, cancer of uterine cervix.



загрузка...