загрузка...
 
И.В. Нестерова ,   И.Н. Швыдченко , И.В.Фесенко  Медицинский Центр УД Президента РФ, Москва;  Российский Центр функциональной хирургической гастроэнтерологии, г. Краснодар Бестим в коррекции дисфункций нейтрофильных гранулоцитов пациентов с хроническим осложненным панкреатитом в эксперименте in vitro
Повернутись до змісту

И.В. Нестерова ,   И.Н. Швыдченко , И.В.Фесенко  Медицинский Центр УД Президента РФ, Москва;  Российский Центр функциональной хирургической гастроэнтерологии, г. Краснодар Бестим в коррекции дисфункций нейтрофильных гранулоцитов пациентов с хроническим осложненным панкреатитом в эксперименте in vitro

Целью работы было изучение функциональных нарушений в  системе нейтрофильных  гранулоцитов (НГ) у пациентов с хроническим осложненным панкреатитом (ХОП) и оценка возможности их коррекции in vitro дипептидом Бестим (?D утамил L триптофан). Установлено, что при ХОП на фоне  глубокой депрессии фагоцитарной активности НГ, коррелирующей  с низким кислород зависимым микробицидным потенциалом, наблюдается реорганизация экспрессии рецепторов цитоплазматической мембраны НГ. Бестим проявляет  in vitro ярко выраженную иммуномодулирующую активность в отношении НГ пациентов  с ХОП. Стимулируя  экспрессию отдельных поверхностных мембранных рецепторов НГ, исследуемый пептид способствует нормализации выявленных дисфункций. (Цитокины и воспаление. 2006. Т. 5, № 2. С. 42–46.) Ключевые  слова: нейтрофильные  гранулоциты, Бестим,  хронический осложненный панкреатит, фагоцитоз, кислород зависимая микробицидная активность, дисфункции, иммуномодуляция. УДК 612.017.1:616.372002 Нейтрофильные  гранулоциты  (НГ) занимают особое место в системе иммунитета, участвуя одновременно в выполнении функций специфической и неспецифической защиты  [11]. Выполняя важную эффекторную роль, НГ оказывают также существенное регуляторное влияние на другие клетки иммунной системы, секретируя различные биологически активные вещества [1, 5, 8, 12]. Дисфункции НГ могут стать фактором риска для развития и отягощения различных патологических состояний. Вторичные повреждения в системе НГ могут возникать в виде нейтропении, количественной недостаточности активных суб популяций, дефектов адгезии, хемотаксиса, разнообразных нарушений рецепторного аппарата, депрессии процессов захвата, киллинга и элиминации бактериального антигена, дефицитов компонентов микро бицидных систем, извращения ответов в нагрузочных тестах in vitro  [1, 2, 4, 6, 9, 10, 14]. С другой стороны, гиперактивация  НГ может приводить к повреждениям окружающей ткани [1, 16, 17, 19, 20]. В настоящий момент в развитии и прогрессировании такой патологии, как панкреатит, многие исследователи отводят важную роль иммунным нарушениям. Для хронических панкреатитов, развившихся на фоне острого деструктивного панкреатита с гнойно некротическими осложнениями, характерна дисрегуляция функционирования нейтрофильного звена, связанная с активацией цитотоксичности в отношении клеток поджелудочной железы с одновременным ослаблением процессов фагоцитоза, что ведет к  гнойным осложнениям [3, 15]. Актуальным является подбор дифференцированной иммунотропной терапии с учетом повреждений НГ. Среди лекарственных препаратов перспективны для использования в клинике соединения пептидной природы. Новый препарат Бестим на основе синтетического дипептида ? Dглутамил L триптофана  (ГНЦ  ГосНИИ ОЧБ, Санкт Петербург) обладает иммуномодулирующей активностью в отношении клеток лимфоидного и нелимфоидного ряда и используется для лечения вторичных иммуно дефицитных состояний. Бестим (БС) влияет на экспрессию нейтрофилами тех рецепторов цитоплазматической мембраны, которые в целом отражают их способность к участию основных функциях—фагоцитарной и адгезивной [7]. В связи с вышесказанным, целью настоящей работы явилось изучение функциональных нарушений в системе НГ у пациентов с хроническим осложненным панкреатитом  (ХОП) с установлением возможности их коррекции БС в эксперименте in vitro. Материалы и методы Объектом исследования была периферическая венозная кровь пациентов  с ХОП  (парапанкреатический абсцесс, нагноившаяся киста поджелудочной железы) в период обострения, в возрасте от 20 до 50 лет. Забор крови производили в момент поступления больного в  стационар до начала  традиционной  терапии. Контрольную  группу  составили  здоровые добровольцы  того же возраста без жалоб и патологии. Функциональное состояние НГ оценивали с помощью комплекса иммунологических методов  [13]. 100 мкл взвеси НГ (2 ? 106  клеток/мл), выделенной на градиенте двойной плотности фиколла 2 верографина (1,093:1,077), инкубировали (37 °С, 30 мин) в лунках иммунологических планшетов  с БС  (20 мкл) в конечной концентрации 0,1 мкг/мл (группа «ХОП+БС» или с таким же объемом физиологического раствора (группа «ХОП»). Аналогично  с физиологическим раствором инкубировали НГ  здоровых лиц  (группа «Контроль»). Экспрессию рецепторов НГ исследовали непрямым иммунофлюоресцентным методом  с использованием панели моноклональных антител: CD11b, CD16, CD95, CD14, CD15, CD17, CD18, CD24, CD25, CD50  (НПЦ «Мед Био Спектр», Москва). При исследовании фагоцитарной функции и активности микробицидных систем НГ использовали цельную кровь. Фагоцитарную активность исследовали микроскопически по интенсивности  захвата и переваривания бактерий  S. aureus  (штамм № 209). Тестировали поглотительную функцию по проценту активно фагоцитирующих НГ из общего числа посчитанных  нейтрофилов  (%  ФАН), фагоцитарному числу  (ФЧ — среднее число фагоцитированных микробов на 1 «активный» НГ) и фагоцитарному  индексу  (ФИ — среднее число фагоцитированных микробов на 100 НГ).  Завершенность фагоцитарного акта оценивали по проценту переваривания (% П—отношение числа  убитых бактерий к общему числу фагоцитированных бактерий) и индексу переваривания (ИП—среднее число убитых микробов на 1 НГ). Со2 стояние оксидазной микробицидной системы НГ определяли по показателям НСТ2теста. Подсчитывали клетки  с восстановленным формазаном (% формазан позитивных клеток—% ФПКсп). Для оценки  степени  стимуляции внутриклеточного кислородзависимого метаболизма использовали функциональный нагрузочный тест  in vitro cS. aureus —стимулированный НСТ тест  (% ФПКст). Адекватность ответа на бактериальную нагрузку определяли по коэффициенту мобилизации  (КМ— % ФПКст: %ФПКсп). Статистическую обработку результатов проводили  с использованием  t'критерия  Стьюдента. Данные представлены в виде  среднего арифметического  значения ± ошибки средней величины. Различия  считали достоверными при р < 0,05. Результаты и обсуждение Анализ полученных данных свидетельствует о том, что НГ здоровых добровольцев в различной степени экспрессируют все исследуемые рецепторы  (рис. 1). 55,62 ± 1,61 % НГ экспрессировали ?м субъединицу (CD11b) рецептора CD11b/CD18. Такой довольно высокий уровень CD11b+НГ мог быть результатом методических манипуляций, связанных с выделением клеток [18]. Несмотря на значительное количество НГ, экспрессирующих ?м субъединицу рецептора CD11b/CD18, ?2 цепь (CD18) была выявлена только на 14,52 ± 0,59 % клеток. Субпопуляция НГ, несущих еще одну молекулу межклеточной адгезии CD50 (ICAM­3), составила в контрольной  группе 35,48 ± 1,58 %. 23,96 ± 1,62 % НГ экспрессировали молекулу

 

Рис. 1. Влияние Бестима на  экспрессию мембранных рецепторов нейтрофильными гранулоцитами при  хроническом осложненном панкреатите

По вертикали – относительное количество (%) нейтрофильных гранулоцитов, экспрессирующих соответствующий рецептор. Контроль — НГ  здоровых лиц; ХОП – НГ пациентов  с  хроническим осложненным панкреатитом; ХОП+БС — НГ пациентов с хроническим осложненным панкреатитом после инкубации с Бестимом (0,1 мкг/мл). — р < 0,05;  — р < 0,01; — р < 0,001 по сравнению с НГ здоровых лиц; — аналогично, по сравнению с НГ пациентов с ХОП без нагрузки Бестимом.

CD14. На поздней стадии миелоидной дифференцировки на НГ появляется рецептор CD15. Мембранная экспрессия данного рецептора была выявлена на 31,87 ± 1,73 % клеток. 17,83 ± 0,94 % НГ в  группе здорового контроля экспрессировали низкоаффинный Fc рецептор для IgG (CD16). Количество НГ, несущих рецепторы CD17, CD24 и CD25, составило, соответственно, 26,54 ± 0,89 %, 14,61 ± 0,49 % и 12,5 ± 0,45 %. Незначительным  былуровень НГ здоровых лиц с  готовностью к апоптозу, если судить по количеству CD95+НГ (13,09 ± 0,59 %). Совсем иной фенотип поверхностной мембранной экспрессии НГ был обнаружен у пациентов с ХОП (см. рис. 1). Экспрессия 3 поверхностных рецепторов цитоплазматической мембраны НГ—CD14, CD17 и CD25 у пациентов с ХОП не отличалась от контрольных значений. Выявлено повышенное количество НГ, экспрессирующих рецепторы CD16, CD18 и CD50. По сравнению со здоровым контролем у пациентов с ХОП отмечен также более высокий уровень НГ, несущих активационную молекулу CD24 (р<0,001) и проапоптический CD95 рецептор. Количество CD11b+ и CD15+НГ при данной патологии было снижено. Исследование эффекторной функции НГ, в частности фагоцитоза и активности кислород зависимой микробицидной системы (НСТ тест), позволило установить глубокую депрессию функционирования НГ при ХОП. У пациентов с данной патологией было снижено количество активно фагоцитирующих нейтрофилов  (% ФАН). Страдала как поглотительная способность НГ, так и функция переваривания  (рис. 2). Наряду с депрессией процессов фагоцитоза снижалась и микробицидность НГ  (рис. 3). Глубоко снижена способность НГ адекватно отвечать на бактериальную нагрузку  (стимулированный НСТ тест), что свидетельствует о снижении резервных возможностей клетки (КМ). Таким образом, при данной форме осложненного хронического панкреатита, на фоне усиления экспрессии отдельных рецепторов цитоплазматической мембраны НГ, наблюдаются выраженные дефекты их функционирования. Недостаточности функциональной активности НГ может способствовать тот факт, что, несмотря на наличие воспалительного процесса, экспрессия таких рецепторов, как CD14 и CD17, участвующих, соответственно, в распознавании патогена и фагоцитозе, остается на уровне здорового контроля, а количество CD11b+НГ резко снижается. Инкубация НГ пациентов с ХОП с БС привела к существенной рецепторной перестройке (см. рис. 3). Не было выявлено достоверного влияния БС только на экспрессию одного рецептора—CD95. Несколько снижалось повышенное при ХОП количество CD16+ и CD50+НГ. Еще больше увеличились субпопуляции НГ, экспрессирующие рецепторы CD18 и CD24. Стимулирующий эффект БС наблюдался и в отношении остальных ис

 

Рис. 2. Влияние Бестима на фагоцитарную  активность нейтрофильных гранулоцитов при  хроническом осложненном панкреатите  (% от  контроля).

Контроль — НГ здоровых лиц; ХОП — НГ пациентов с хроническим осложненным панкреатитом; ХОП+БС — НГ пациентов с хроническим осложненным панкреатитом после инкубации с Бестимом (0,1 мкг/мл). % ФАН — относительное количество активно фагоцитирующих НГ; ФЧ — фагоцитарное число; ФИ — фагоцитарный индекс; % П — % переваривания; ИП — индекс переваривания. — р < 0,05— р < 0,01;— р < 0,001 по сравнению с НГ здоровых лиц;— аналогично, по сравнению с НГ пациентов с ХОП без нагрузки Бестимом.

 

Рис. 3. Влияние Бестима на  активность  кислородзависимой микробицидной  системы  (НСТ тест) нейтрофильных гранулоцитов при  хроническом осложненном панкреатите

Контроль — НГ здоровых лиц; ХОП — НГ пациентов с хроническим осложненным панкреатитом; ХОП+БС — НГ пациентов с хроническим осложненным панкреатитом после инкубации с Бестимом (0,1 мкг/мл). По оси значений слева — относительное количество формазан позитивных клеток (% ФПКсп, % ФПКст), подсчитанных, соответственно, в спонтанном и стимулированном НСТ2тесте. По оси значений  справа — коэффициент мобилизации  (КМ) в  усл. ед.  р < 0,05;  р < 0,01;  р < 0,001 по сравнению с НГ здоровых лиц;  аналогично, по сравнению с НГ пациентов с ХОП без нагрузки Бестимом. следуемых рецепторов НГ, экспрессия которых у пациентов с ХОП была либо снижена  (CD11b, CD15), либо не отличалась от  группы здорового контроля (CD14, CD17, CD25). Вероятно, выявленное иммуностимулирующее влияние БС на экспрессию отдельных рецепторов НГ пациентов с ХОП имело положительное значение для нормализации угнетенных при данной патологии функциональных способностей клеток. После инкубации клеток с БС достоверно увеличилось до уровня здорового контроля количество активно фагоцитирующих НГ, повысился захват бактериальных частиц и их переваривание (см. рис. 2). БС также обладал модулирующим действием на активность мембранных оксидаз: % ФПК в спонтанном НСТ тесте достиг уровня здоровых лиц; возросло количество формазан позитивных НГ при дополнительной бактериальной нагрузке (см. рис. 3). Таким образом, установлено, что при ХОП на фоне угнетения фагоцитарной активности и микробицидности НГ наблюдается реорганизация экспрессии рецепторов цитоплазматической мембраны, возможно, опосредующая и отражающая выявленные функциональные нарушения. Синтетический дипептид ? D глутамил L триптофан—Бестим проявляет in vitro выраженную иммуномодулирующую активность в отношении НГ пациентов с ХОП. Стимулируя экспрессию отдельных поверхностных мембранных рецептоов НГ, Бестим способствует нормализации дисфункций. Важно также, что инкубация НГ с БС снижает количество клеток, экспрессирующих рецептор CD16, связанный с антитело зависимой цитотоксичностью. Выводы 1. При хроническом осложненном панкреатите активационный потенциал НГ возрастает, однако, несмотря на наличие воспалительного процесса, количество НГ, экспрессирующих CD14 и CD17, остается на уровне здорового контроля, а количество CD11b+НГ резко снижается. 2. Реорганизация экспрессии мембранных рецепторов НГ сопровождается  глубокой депрессией фагоцитарной активности (снижением количества активно фагоцитирующих нейтрофилов, угнетением захвата и переваривания) и сниженным кислород зависимым микробицидным потенциалом НГ. 3. Бестим проявляет  in vitro иммуномодулирующую активность в отношении НГ при ХОП. Стимулируя экспрессию отдельных мембранных рецепторов  (CD11b, CD14, CD17, CD18, CD24, CD25), Бестим способствует нормализации процессов фагоцитоза и кислород зависимой микробицидности НГ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бережная Н.М. Нейтрофилы и иммунологический гомеостаз // Киев: Наукова думка, 1988. — 192 с.

2. Блинников И.Ю., Корчагина А.П. Локомоторная функция фагоцитов у часто болеющих детей // Тез. докл. 12 го Съезда иммунологов России. — 1992. — С. 51.

3. Брискин Б.С., Яровая Г.А., Савченко З.И. и др. Иммунные и ферментные нарушения у больных острым панкреатитом // Хирургия. — 2001. — № 7. — С. 21–24.

4. Дзержинская И.И. Розетко образующая способность нейтрофилов и Т лимфоцитов у больных хронической почечной недостаточностью // Иммунология. — 1982. — № 1. — С. 64–66.

5. Долгушин И.И., Зурочка А.В., Чукичев А.В. Участие нейтрофилов в регуляции воспалительно репаративной реакции поврежденной  ткани  // Иммунология. — 1998. — № 6. — С. 14.

6. Колесникова Н.В., Нестерова И.В., Чудилова Г.А., Тараканов В.А. Влияние миелопептида 3 на экспрессию молекул CD11b, CD16 и CD95 нейтрофильными гранулоцитами у детей с гнойносептическими заболеваниями // Иммунология. — 1999. — № 3. — С. 41–43.

7. Ломтатидзе Л.В. Влияние Бестима на функционирование нейтрофильных гранулоцитов в эксперименте. — Дисс. . . . канд. мед. наук. — Краснодар, 1999. — 216 с.

8. Маянский Д.Н., Маянский А.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге // Новосибирск, 1988. — 256  с.

9. Нестерова И.В. Интралейкоцитарная микробицидная система нейтрофильных гранулоцитов у здоровых детей и при гнойносептических заболеваниях. — Дисс.. канд. мед. наук. — М., 1980. — 249 с.

10. Нестерова И.В. Иммунореабилитация детей со вторичными иммунодефицитными состояниями. — Дисс.. докт. мед. наук. — М., 1992. — 455 с.

11. Нестерова И.В. Физиологическая роль нейтрофильных гранулоцитов в поддержании иммунного  гомеостаза  // Russ.  J.  Immunol. — 2004. — Vol. 9, suppl. 1. — P. 17.

12. Нестерова И.В., Колесникова Н.В. Современные представления о роли системы нейтрофильных гранулоцитов // Russ. J. Immunol. — 1999. — Vol. 4, suppl. 1. — P. 22–29.

13.Нестерова И.В., Колесникова Н.В., Чудилова Г.А. Комплексное трехуровневое исследование системы нейтрофильных гранулоцитов с возможной диагностикой ИДС при различной патологии  // Метод. рекомендации № 96/11. — Краснодар, 1996. — 22 с.

14. Нестерова И.В., Светличная М.А. Значение исследования функционального потенциала нейтрофильных гранулоцитов при гнойносептических заболеваниях // Педиатрия. — 1984. — № 9. — С. 63–65.

15. Тарасенко В.С., Смолягин А.И., Кубышкин В.А. Особенности иммунного статуса при остром панкреатите // Хирургия. — 2000. — № 8. — С. 51–55

16. Cochrane C.G. Cellular injury by oxidants // Am. J. Med. — 1991. — Vol. 91, № 3C. — P. 23–30.

17. Fontes B., Sergio Poggetti R. The  role of  the polymorphonuclear neutrophils in the failure of multiple organs and systems // Rev. Hosp. Clin. Fac. Med. Sao2 Paulo. — 1996. — Vol. 51, № 1. — P. 21–25.

18. Hamblin A., Taylor M., Bernhagen J. et al. A method of preparing blood leukocytes  for  flow cytometry which prevents upregulation of  leukocyte  integrins // J. Immunol. Methods. — 1992. — Vol. 146, N 2. — P. 219–228.

19. Kobayashi K., Kashima K., Higuchi K., Arakawa T. The mechanisms of gastrointestinal mucosal injury and repair // Nippon Rinsho. — 1998. — Vol. 56, № 9. — P. 2215–2222.

20. Ward P.A., Varani  J. Mechanisms of neutrophil2mediated  injury  // Clin. Exp. Immunol. — 1993. — Vol. 93, suppl. 1. — P. 2.

Bestim in correction of neutrophil granulocytes dysfunction in patients with complicated chronic pancreatitis by in vitro experiment I.V. Nesterova1 , I.N. Shvydchenko2 , I.V. Fesenko2 1  Medical Center of President of Russian Federation, Moscow; 2  All2Russian Center  for Functional Surgical Gastroenterology, Krasnodar The aim of the work was to study functional disorders in the system of neutrophil granulocytes (NG) in patients with  complicated  chronic pancreatitis  (CCP), with determination of  the possibility of  their correction in vitro with dipeptide Bestim (?D glutamyl L tryptophan). Depressed NG phagocytic activity, reduced oxygendependent microbicidal potential and significantly changed NG membrane recep tors expression were observed in CCP patients. Bestim displayed strong immunomodulating activity in vitro for NG of patients with CCP. The peptide acts to normalize NG dysfunctions by stimulating of NG membrane receptors expression. (Cytokines and Inflammation. 2006. Vol. 5, № 2. P. 42–46.)

Key words: neutrophilic granulocytes, Bestim, complicated chronic pancreatitis, phagocytosis, oxygen2dependent microbicidal activity, dysfunctions, immunomodulation.



загрузка...