И.В. Бабаченко , Н.Э. Ярв , Н.М. Калинина , Г.Я. Ценева Санкт Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия; Городская детская инфекционная больница № 5; Всероссийский Центр экстренной и радиационной медицины МЧС; ФГУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Роспотребнадзора, Санкт Петербург Особенности клеточного звена и цитокинового профиля иммунного ответа у детей, больных коклюшем
И.В. Бабаченко , Н.Э. Ярв , Н.М. Калинина , Г.Я. Ценева Санкт Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия; Городская детская инфекционная больница № 5; Всероссийский Центр экстренной и радиационной медицины МЧС; ФГУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Роспотребнадзора, Санкт Петербург Особенности клеточного звена и цитокинового профиля иммунного ответа у детей, больных коклюшем
Представлены результаты исследования субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови и цитокинового профиля иммунного ответа по концентрации и соотношению интерлейкинов (IL2, IL4) и интерферонов (IFN? и IFN?) в сыворотке крови, а также способности клеток детей, больных коклюшем, в разные сроки периода судорожного кашля (ПСК) к спонтанной и индуцированной выработке этих цитокинов. Показано, что иммунный ответ развивается по смешанному Тh1/Тh2 типу, причем на 1–2 й неделях ПСК доминирует клеточный, а в поздние сроки (на 3–6 й неделях) нарастает гуморальный ответ. У больных коклюшем повышено абсолютное количество CD3+, CD4+ и CD8+лимфоцитов, у большинства пациентов на фоне частого выявления детей с низким относительным количеством CD8+, CD16+, CD16+56+ лимфоцитов. Низкая индуцированная продукция цитокинов in vitro при их высокой сывороточной концентрации свидетельствует о функциональной несостоятельности иммуноцитов больных коклюшем и дисбалансе иммунной реактивности на протяжении всего срока заболевания, включая 5–6 ю недели ПСК. (Цитокины и воспаление. 2006. Т. 5, № 4. С. 3–9.)
Развитие вторичного иммунодефицита, или «коклюшной анергии», у детей, больных коклюшем, приводит к развитию бактериальных осложнений и наслоению вирусных инфекций, и, по мнению практикующих врачей и исследователей этой инфекции, значительно ухудшает прогноз заболевания [6]. Работами 80–90 х гг. было показано влияние коклюшного токсина (КТ), называемого «лимфоцитоз стимулирующим фактором», на различные популяции клеток крови [1]. Стали появляться единичные исследования, посвященные изучению параметров иммунного ответа больных детей [2, 3]. В последние годы рост интереса к клеточному и цитокиновому звеньям иммунного ответа при коклюше в большинстве стран мира связан с недостаточной протективной эффективностью вакцин, вызывающих хороший гуморальный ответ [8], а также с возможностями медикаментозной иммунокоррекции, применяемой отечественными авторами [4]. Однако различные лабораторные возможности исследователей, оценка цитокинового звена иммунитета по содержанию отдельных цитокинов в сыворотке крови, а также различные сроки проводимых в динамике болезни исследований приводят к противоречивым результатам, не объясняющим механизмов «коклюшной анергии».
Цель работы—изучить субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови и особенности выработки ряда ключевых цитокинов у детей, больных коклюшем, в динамике заболевания.
Материалы и методы
Обследовано 30 детей в возрасте от 1 месяца до 7 лет, получавших стационарное лечение по поводу коклюша в городской детской инфекционной больнице № 5 (ГДИБ № 5). Все обследованные больные переносили среднетяжелые формы заболевания. В стационар они поступили в периоде судорожного кашля (ПСК): с 1й по 5ю неделю. Иммунологическое обследование проводили в динамике с интервалом 10–14 дней на ранних и поздних сроках периода судорожного кашля (1–2й и 3–6й неделях ПСК). По этому признаку все дети были разделены на две группы: в 1ю вошли больные, переносившие коклюш на 1-2й неделях ПСК (15 человек), во 2ю — на 3–4й неделях (9 человек) и 5–6й неделях (6 детей). Сравнение иммунологических параметров проводили с возрастными нормами, используемыми в иммунологической лаборатории Всероссийского Центра экстренной и радиационной медицины МЧС [5]. Иммунологическое обследование включало фенотипирование лимфоцитов методом проточной цитометрии, подсчет общего числа лейкоцитов и формулу крови. Концентрацию интерлейкина 4 (IL4), интерферонов ? и ? (IFN?, IFN?) в сыворотке крови, а также уровни спонтанной и индуцированной продукции IL2, IL4, IFN? и IFN? клетками крови больных детей определяли иммуноферментным методом с помощью тест-систем производства ООО «Протеиновый контур» (IL2, IL4, IFN?) и ООО «Цитокин» (IFN?) (Санкт Петербург). Количественную оценку результатов по калибровочной кривой с использованием компьютерной программы «Microplate manager», отражающей зависимость оптической плотности от концентрации стандартного антигена и позволяющей сравнение с ним исследуемых образцов. Чувствительность метода составляла 5–30 пг/мл.
Результаты и обсуждение
В табл. 1 представлен субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови детей, больных коклюшем, в динамике заболевания. Обращает на себя внимание, что в ранние сроки заболевания (1я группа) средние значения (М) и колебания большинства иммунологических показателей (число лейкоцитов и лимфоцитов, процент CD3+, CD4+, CD8+Т лимфоцитов, процент CD20+В лимфоцитов) значительно превышают размах колебаний нормальных показателей. В поздние сроки ПСК отмечается достоверное снижение этих показателей (см. табл. 1), однако они по прежнему превышают нормативные. Указанные закономерности соответствуют литературным данным и обусловлены стимулирующим влиянием КТ B. pertussis [4, 8]. Из табл. 1 видно, что у больных коклюшем отмечается высокое количество клеток, несущих активационный маркер CD25 и маркер апоптотических клеток CD95. Учитывая большие колебания и многофакторную зависимость иммунологических показателей, нам представилось целесообразным уточнить, у какой части обследованных больных иммунологические параметры выходят за пределы нормальных колебаний. Анализ гемограмм больных показал, что у 80 % 1й группы отмечается лейкоцитоз и лишь у 20%—нормоцитоз. В динамике у детей 2й группы лейкоцитоз отмечался в 72 % случаев, нормоцитоз—в 21 % и незначительная лейкопения— у 2 детей (7 %). Лимфоцитоз, как в процентном, так и в абсолютном выражении (в виде количества клеток в микролитре), в ранние сроки ПСК отмечался у 74 % и 77 % больных, соответственно, что характерно для типичной картины коклюша и обусловлено действием лимфоцитоз стимулирующего фактора (КТ). Распределение больных по содержанию абсолютного числа основных субпопуляций лимфоцитов крови в процентах от нормы представлено на рис. 1а и 1б. Из рис. 1а видно, что у больных 1й группы на ранних сроках ПСК
Таблица 1 Субпопуляционный состав лимфоцитов у детей, больных коклюшем, в зависимости от сроков заболевания
Примечание. М — средние значения исследуемых параметров. Достоверность различий между 1–й и 2–й группами: * — p < 0,05; ** — p < 0,01.
Рис. 1. Распределение больных коклюшем по абсолютному и относительному содержанию лимфоцитов основных субпопуляций крови, в процентах от нормы
численность CD3+, CD4+, CD8+субпопуляций Т лимфоцитов увеличена у 83 %, 73 %, 90 % обследованных больных соответственно. Больных со сниженным количеством клеток этих популяций не выявлено. В динамике болезни частота больных (2 я группа) с высоким уровнем CD3+, CD4+, CD8+лимфоцитов остается равной 75 %, 54 %, 86 % соответственно (см. рис. 1б). Однако в поздние сроки болезни у 7 % детей уровень CD3+ Т лимфоцитов не достигает нормальных показателей. Содержание CD4 позитивных Т лимфоцитов хелперов (Тh) у 43 % пациентов соответствует нормативным показателям. Несмотря на достоверное снижение среднего числа цитотоксических Т клеток (CD8+), доля больных, имеющих повышенные значения этого показателя, в динамике болезни почти не изменяется, однако появляются дети, имеющие низкие значения этого показателя (4 %) (см. рис. 1б). Значительные колебания абсолютных значений субпопуляции лимфоцитов с двойными маркерами CD4+8+, являющихся предшественниками как Тh (CD4+), так и специфических Т киллеров (CD8+) (15–242 при норме 3–81) (см. табл. 1), у больных 1й группы сопровождаются более высоким процентом детей, имеющих повышенные показатели (19 %) (см. рис. 1а). Нормализация средних значений двойных позитивных клеток CD4+8+ и их колебаний (см. табл. 1) у 2 й группы детей совпадает с отсутствием у них отклонений от нормативных значений субпопуляции (см. рис. 1б). По видимому, выброс незрелых Т лимфоцитов, несущих два маркера (CD4+8+), объясняется действием КТ, нарушающего нормальную дифференцировку и рециркуляцию клеток в лимфоидных органах, что соответствует литературным данным [7]. Соотношение CD4/CD8 у обследованных больных соответствует возрастным нормам. Популяция натуральных киллеров (NK) представлена двумя субпопуляциями клеток (CD16+ и CD56+). В нашем исследовании CD56+ лимфоциты остаются в пределах нормы у всех детей во все пери оды заболевания, хотя средние их значения (М) у детей 2 й группы достоверно (p1–2 < 0,05) снижаются (см. табл. 1), вероятно, за счет ухода клеток в слизистые для реализации мукозального иммунитета и выработки IFN?. CD16+лимфоциты сохраняются в пределах нормы у больных обеих групп (77 % и 71 % соответственно), однако в поздние сроки ПСК растет число детей со сниженным абсолютным количеством клеток, маркируемых CD16+, с 3 % до 11 %. Интересно, что количество клеток предшественников NK, несущих оба маркера CD16+56+, сниженное у 15 % больных 1 й группы, во 2 й группе понижается в два раза чаще (у 29 % больных) (см. рис. 1а и 1б). Это, наряду с уменьшением CD16+клеток у 11 % больных, вероятно, свидетельствует об истощении резервных возможностей NK клеток, участвующих в реализации противовирусного иммунитета, и создает предпосылки для частого наслоения ОРВИ. Абсолютное содержание В лимфоцитов с кластером дифференцировки CD20+, повышенное у 57 % больных коклюшем 1 й группы, в поздние сроки заболевания достоверно (p < 0,05) снижается (см. табл. 1), уменьшается до 36 % количество детей, имеющих повышенное содержание В лимфоцитов, за счет роста доли пациентов (с 40 % до 61 %) с нормальным содержанием клеток этой субпопуляции. Снижение числа В лимфоцитов, вероятно, обусловлено дифференцировкой их в плазматические клетки, что совпадает со сроками роста титров специфических антител у больных коклюшем (3–4 й недели ПСК). Обращает на себя внимание несоответствие числа больных с повышенным количеством CD20+ и HLA II+лимфоцитов: среди детей 1 й группы таких пациентов 57 % и 40 % соответственно, среди детей 2 й группы—36 % и 25 % (см. рис. 1а и 1б). Учитывая, что HLA II маркер в норме экспрессируется на В лимфоцитах, моноцитах и частично на активированных Т лимфоцитах, можно предполагать, что у больных коклюшем значительная часть В лимфоцитов характеризуется сниженной экспрессией HLA II и является функционально неполноценной. Количество пациентов, имеющих повышенное число активированных Т лимфоцитов с маркером CD25+, незначительно различается в 1 й и 2 й группах (23 % и 29 % соответственно), что, вероятно, отражает активную Т клеточную пролиферацию под влиянием КТ у больных обеих групп. В поздние сроки ПСК дальнейшее увеличение объема этой субпопуляции у детей на фоне высокого числа CD4+ Т лимфоцитов хелперов может быть обусловлено появлением регуляторных клеток (CD4+25+), ограничивающих воспаление. С другой стороны, более чем у половины пациентов 1 й группы отмечаются повышенные уровни клеток CD95+, которые могут отражать как активацию иммунной системы, так и готовность к апоптозу. Маркер CD95 представлен преимущественно на Т хелперах, количество которых у больных коклюшем значительно повышено за счет действия КТ. В поздние сроки болезни, во 2 й группе, количество детей, имеющих повышенное количество CD95+клеток, снижается с 54 % до 44 % (см. рис. 1 а и 1б). Наряду с этим, количество пациентов с низким уровнем этих клеток растет с 3 % до 10 %, в то время как средние уровни CD95+ лимфоцитов в обеих группах остаются выше нормативных показателей (см. табл. 1). Из рис. 1а и 1б также видно, что в 1 й группе количество больных с повышенным числом CD95+ клеток в два раза превышает число тех, у кого повышено содержание лимфоцитов с активационным маркером CD25; во 2 й группе это различие сохраняется, сокращаясь до 1,5 раз, что, вероятно, свидетельствует о сохраняющемся в поздние сроки воспалительном процессе. Анализ иммунограмм больных показывает важность параллельной оценки абсолютного и относительного количеств отдельных субпопуляций лимфоцитов и их соотношений. Сравнение средних величин (М) процентного содержания субпопуляций лимфоцитов больных с нормативными значениями подтверждает относительный лимфоцитоз, характерный для коклюша (см. табл. 1), однако содержание основных субпопуляций не отличается от нормы, за исключением незначительного снижения CD16+лимфоцитов у пациентов 1 й группы и CD16+56+лимфоцитов у детей обеих групп (см. табл. 1). Анализ распределения больных по содержанию относительного числа основных субпопуляций лимфоцитов крови в процентах от нормы (рис. 1в и 1г) подтвердил, что у большинства больных 1 й и 2 й групп (60 % и 55 % соответственно) имеет место повышение числа CD3+ Т лимфоцитов. Доля детей с высокими относительными значениями CD4+ Тh в два раза ниже, чем CD3+ Т лимфоцитов в обеих группах. Обращает на себя внимание, что в отличие от абсолютного содержания специфических Т киллеров (CD8+), повышенного у большинства обследованных, их относительное количество снижено у 53 % и 72 % обследованных 1 й и 2 й групп соответственно, что подтверждает дисбаланс клеточного иммунного ответа на субпопуляционном уровне. Из представленных на рис. 1 в и 1 г диаграмм можно заключить, что для больных коклюшем более чем в половине случаев характерно снижение популяций CD16+NK клеток и их клеток-предшественников (CD16+56+), причем в динамике болезни нормализация этих показателей отмечается лишь в незначительном проценте случаев. Снижение относительного числа NK можно объяснить длительным сохранением очага воспаления в легких под действием коклюшного токсина и миграцией клеток в очаг. Обращает на себя внимание также рост числа пациентов со сниженным количеством В лимфоцитов среди детей 2 й группы по сравнению с 1 й (31 % и 23 % соответственно) на фоне мало изменившегося числа больных с нормальным относительным содержанием CD20+ клеток, что, вероятно, связано с трансформацией их в плазматические клетки и объясняет поздний антителогенез при коклюше. Для лучшего понимания иммунопатологических процессов, происходящих в организме больного коклюшем ребенка, причин и характера развивающегося иммунодефицита, для подтверждения профиля иммунного ответа необходимо оценивать продукцию медиаторов воспаления—цитокинов, причем не только в сыворотке крови, но и их спонтанную и индуцированную продукцию клетками крови in vitro. В табл. 2 представлен цитокиновый профиль больных коклюшем. Из табл. 2 видно, что у больных обеих групп на фоне высоких уровней сывороточного IL4, IFN? и IFN? и высокой спонтанной продукции IFN? имеет место выраженное снижение индуцированной продукции этого цитокина (IFN?). Индуцированная продукция IFN?, соответствующая нормативным показателям, тем не менее, снижается у больных 2 й группы в 1,8 раз. Индуцированные уровни IL2 и IL4, также соответствующие нормативным показателям по средним значениям (М), напротив, имеют тенденцию к повышению в поздние сроки ПСК. Уровень индуцированного IFN? повышается у детей 2 й группы в 1,7 раз, хотя его продукция остается значительно ниже нормы. Представленные данные подтверждают диссоциацию между сывороточными и клеточными уровнями цитокинов и необходимость комплексного исследования продукции цитокинов для адекватной оценки этого звена иммунитета. На рис. 2 а г представлено распределение больных по содержанию основных регуляторных цитокинов сыворотки крови и уровню их продукции клетками в процентах от нормы. Выявлено, что у абсолютного большинства больных коклюшем обеих групп спонтанный и сывороточный уровни IFN? соответствуют возрастным нормам (100 %, 92 %, 88 % и 88 % соответственно) (см. рис. 2 а). Индуцированные уровни повышены на ранних сроках заболевания у 19 % обследованных, на поздних—у 8 %, снижены—у 23 % и 27 % детей соответственно, что может свидетельствовать о функциональных нарушениях иммунокомпетентных клеток и способствовать наслоению острых вирусных инфекций. IL4, являющийся одним из ключевых медиаторов, определяющих профиль цитокинового ответа, повышен в сыворотке крови у 47 % обследованных 1 й группы и 37 % 2 й группы, причем у остальных его значения изменяются в пределах нормальных колебаний (см. рис. 2б). При этом спонтанный и индуцированный уровни IL4 снижены у 23 % и 45 % детей 1 й группы и 30 % и 33 % детей 2 й группы соответственно. Высокие сывороточные уровни этого цитокина, как правило, расцениваются как показатель иммунного ответа, протекающего по Тh2 типу. Угнетение индуцированной выработки IL4 у половины детей в ранний период заболевания и у одной трети обследованных в поздние сроки также может наблюдаться при длительном иммунопатологическом процессе, протекающем по Тh2 типу. Уменьшение доли больных с пониженным уровнем индуцированного IL4 в поздние сроки коклюшной инфекции, наряду с трехкратным ростом числа обследованных с высокой спонтанной выработкой этого цитокина, а также достоверное снижение абсолютного числа специфических Т киллеров (CD8+) маркирует усиление гуморального иммунного ответа и совпадает с ростом защитных титров специфических антител. IL2, фактор роста и дифференцировки Т лимфоцитов,—ключевой медиатор Т клеточного иммунного ответа по Тh1 типу.
Таблица 2 Цитокиновый профиль больных коклюшем детей на разных сроках заболевания, пг/мл
Рис. 2. Продукция цитокинов больными коклюшем на разных сроках заболевания, в процентах от нормативных показателей
В сыворотке крови IL2 сохраняется в течение нескольких минут, поэтому целесообразнее оценивать не сывороточные концентрации IL2, а способность клеток больного вырабатывать IL2. Спонтанная продукция IL2 соответствовала нормативным показателям у 90 % обследованных 1 й группы и 54 % 2 й группы; у 46 % больных коклюшем в поздние сроки ПСК отмечалось ее нарастание (см. рис. 2в). Индуцированная продукция IL2 у 38 % детей 1 й группы и 33 % детей 2 й группы бала снижена, у остальных соответствовала возрастным нормам, что, вероятно, является адаптивной самоограничительной реакцией иммунной системы на лимфоцитоз стимулирующее действие КТ. Уровень IFN?, основного цитокина активированных Тh1, повышен в сыворотке крови у 43 % пациентов 1 й группы и 65 % 2 й группы (см. рис. 2г). Его спонтанная продукция повышена у половины обследованных больных обеих групп и у трети соответствует возрастным нормам, что, наряду с высоким уровнем CD3+, CD4+, CD8+Т лимфоцитов, у большинства наблюдаемых детей так же свидетельствует развитии иммунного ответа по Тh1 типу. Особое внимание привлекает снижение клеточной способности индуцировать IFN? у 100 % больных на ранних сроках ПСК и у 92 % в поздние сроки, что свидетельствует о функциональной несостоятельности иммуноцитов и вносит весомый вклад в развитие «коклюшной анергии».
Заключение
Таким образом, данные, полученные в результате обследования больных коклюшем детей на разных сроках заболевания, позволяют сделать вывод о том, что иммунный ответ развивается по смешанному Th1/Th2 типу, причем в ранние сроки ПСК (на 1–2 й неделях) доминирует клеточный ответ, а в поздние сроки (на 3–6 й неделях) нарастает гуморальный. Изменения в субпопуляционном составе лимфоцитов, заключающиеся в повышении абсолютного количества CD3+, CD4+, CD8+лимфоцитов на фоне относительного снижения субпопуляций киллеров, осуществляющих как специфический (CD8+), так и неспецифический (CD16+) иммунный ответ, а также клеток-предшественников NK (CD16+56+), отражают дисбаланс иммунной реактивности больных на протяжении всего срока заболевания, включая 5–6 ю недели ПСК. Снижение индуцированной активности исследованных цитокинов на фоне их высокой сывороточной концентрации свидетельствует о функциональной несостоятельности иммуноцитов больных, а также диктует необходимость при оценке цитокинового статуса анализировать не только их сывороточные концентрации, но и способность клеток обследуемых пациентов к спонтанной и индуцированной продукции цитокинов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бабаченко И.В., Мартынкин А.С., Кузьмина А.И. и др. Современные аспекты коклюша у детей // Педиатрия. — 1994. — № 3. — С. 66–70.
2. Власов В.А Клиникоиммунологические особенности коклюша у привитых и непривитых детей. — Автореф. дисс. … канд. мед. наук. — Свердловск, 1989. — 21 с.
3. Панасенко Л.М. Клиникоиммунологические особенности неосложнённого и осложнённого течения коклюша. — Автореф. дисс. … канд. мед. наук. — Новосибирск, 1995. — 22 с.
4. Панасенко Л.М. Системные иммунометаболические изменения при коклюше и их коррекция. — Автореф. дисс. … дра мед. наук. — Новосибирск, 2005. — 37 с.
5. Справочник по иммунотерапии / Под ред. А.С. Симбирцева. — СПб.: Диалог, 2002. — 480 с.
6. Тимченко В.Н., Бабаченко И.В., Ценева Г.Я. Эволюция коклюшной инфекции у детей. — СПб.: ЭЛБИСПб, 2005. — 191 с.
7. Huang K., Im SunhGoung, Samlowski W.E., Daynes R.A. Molecular mechanisms of lymphocyte extravasation. III. The loss of lymphocyte extravasation potential induced by pertussis toxin is not mediated via the activationof protein kinase C // J. Immunol. — 1989. — Vol. 143, № 1. — P. 229–238.
8. Мills K.H.G. Immunity to Bordetella pertussis // Microbes and Infection. — 2001. — № 3. — P. 655–677.
Peculiarities of cellular immunity and cytokine response in children with whooping cough I.V. Babachenko , N.E. Jarv , N.M. Kalinina , G.Ja. Zeneva St. Petersburg State Pediatric Medical Academy; City children isolation hospital № 5, St. Petersburg; All Russian Center of Emergency and Radiation Medicine, Emercom of Russia; L. Pasteur Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology, St. Petersburg
The results of blood lymphocyte subpopulations and cytokine profile investigation in children with whooping cough during spasmodic cough period are presented. The level and ratios of interleukins (IL2, IL4) and interferons (IFN? and IFN?), spontaneous and induced cytokine production were analyzed. A complex Th1/Th2 immune response develops, with cellular immunity predominance on the first 2 weeks of spasmodic cough period and humoral immunity activation later on (3d to 6th week). Absolute contents of CD3+, CD4+ and CD8+ lymphocytes are often elevated in most of patients, while relative levels of CD8+, CD16+ CD16+ 56+ lymphocytes are often low. Low level of induced cytokine production in vitro and high serum cytokine content are the signs of functional immunocyte failure and immune reactivity imbalance in children with whooping cough on all disease stages including 5!6th weeks of spasmodic cough period (Cytokines and Inflammation. 2006. Vol. 5, № 4. P. 3–9).
