загрузка...
 
Влияние хирургического стресса на уровень циркулирующих СЭ34+-гемопоэтических стволовых клеток:анализ возможные факторов мобилизации М.А.Алиев, Н.Н. Беляев, М.Р. Рысулы, Е.А. Ахметов, А.О. Сейдалин, Т.А. Супниязова, Ю.В. Перфильева, Р.Т. Тлеулиева, Б.А. Жумабаева, А.Т. Кодасбаев, К.С. Батталова,Ж.А. Сатыбалдиева Научный центр хирургии им. А.Н. Сызганова МЗ РК; Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина ЦБИ КН МОН РК; Национальный центр экспертизы лекарственных средств МЗ РК,  ТОО «Стэмкорд», г. Алматы, Республика Казахстан
Повернутись до змісту

Влияние хирургического стресса на уровень циркулирующих СЭ34+-гемопоэтических стволовых клеток:анализ возможные факторов мобилизации М.А.Алиев, Н.Н. Беляев, М.Р. Рысулы, Е.А. Ахметов, А.О. Сейдалин, Т.А. Супниязова, Ю.В. Перфильева, Р.Т. Тлеулиева, Б.А. Жумабаева, А.Т. Кодасбаев, К.С. Батталова,Ж.А. Сатыбалдиева Научный центр хирургии им. А.Н. Сызганова МЗ РК; Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина ЦБИ КН МОН РК; Национальный центр экспертизы лекарственных средств МЗ РК,  ТОО «Стэмкорд», г. Алматы, Республика Казахстан

Изучали содержание гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) с фенотипом Сй34+ в периферической крови больных, подвергнувшихся хирургическим операциям различной степени тяжести, в сочетании с оценкой уровня цитокинов, специфически влияющих на функциональную активность ГСК. Обследовано 27 больных с ишемической болезнью сердца. В опытной группе больные с множественными поражениями коронарных артерий подвергались аортокоронарному шунтированию с использованием венозных трансплантатов. В контрольной группе больным проводили стентирование коронарных артерий стентами. Процедура стентирования не приводила к увеличению уровня циркулирующих ГСК. В опытной группе к моменту выписки наблюдалось достоверное увеличение количества циркулирующих ГСК в 2,9 раза и 3,5-кратное увеличение концентрации БйР-1 в крови. Уровень СМ-СБР, БСР и ИР практически не менялся у больных обеих групп на протяжении всего периода наблюдений. Уровень С-СБР после операции транзиторно повышался в 2,6 раз только в опытной группе. Предполагается, чтозначительная травматизация тканей, вызванная операцией аортокоронарного шунтирования, приводит уже в первый день к повышению продукции С-СБР, который, в свою очередь, стимулирует выброс ГСК из костного мозга. Совпадение максимума содержания ГСК в крови с максимумом продукции БйР-1 по времени свидетельствует о важности оси С-СБР — ГСК — поврежденная ткань — БйР-1 в регенерационном процессе в посттравматический период. (Цитокины и воспаление. 2008. Т. 7, № 2. С. 45-48.)

Ключевые слова: кардиохирургия, гемопоэтические стволовые клетки, цитокины, SDF-1.

Обнаружение феномена пластичности у гемопо­этических стволовых клеток (ГСК), инициировало взрыв исследовательского интереса к возможности восстановления поврежденных патологическим процессом или травмой тканей жизненно важных органов, таких как сердце, печень, легкие, спинной мозг. Ряд экспериментальных работ, проведенных на животных, доказал несомненность регенераци- онного потенциала ГСК, выделенных из костного мозга или мобилизованных из него с помощью колониестимулирующих факторов, и привел к появлению новой концепции восстановительной терапии поврежденных тканей, в основе которой лежит принцип соблюдения естественных меха­низмов клеточной репарации. Предполагаемый механизм заключается в том, что любая гибель клеток, связанная с травмой (в том числе, хирургической) или патологическим процессом, включая инфекционное и неинфекционное воспаление, ин­фаркт (например, вызванный ишемией), инсульт и т. п., приводит к выбросу в кровь из очага тканевого повреждения ряда факторов, обладающих мобили­зующими свойствами в отношении ГСК костного мозга. ГСК покидают свою естественную нишу и пе­ремещаются с кровотоком в область повреждения за счет хоуминга, обусловленного рядом факторов, образующихся в поврежденном участке. Наиболее изученным фактором хоуминга является хемокин SDF-1 (Stroma Derived Factor), к которому на ГСК имеются рецепторы типа CXCR4 [6]. В результате в очаге повреждения скапливаются ГСК, которые осуществляют репарацию поврежденной ткани. Однако экспериментальные находки нуждаются в подтверждении и, самое главное, в доказательстве существования феномена естественной клеточной репарации у человека. Важным этапом в этом про­цессе является изучение феномена мобилизации ГСК и механизмов хоуминга, инициированных тканевым повреждением, в частности, хирурги­ческой операцией.

Целью настоящего исследования явилось изу­чение содержания ГСК с фенотипом CD34+ в периферической крови больных, подвергшихся хирургическим операциям различной степени тяжести, в сочетании с оценкой уровня цитокинов, специфически влияющих на функциональную ак­тивность ГСК.

Материалы и методы

Обследовано 27 больных с ишемической болезнью сердца (ИБС) в возрасте от 35 до 55 лет. Больше половины больных (68 %) страдали ИБС в течение 1-5 лет. К моменту обследования 78 % больных были инвалидами 1-Ш групп. Большинство паци­ентов (93 %) перенесли инфаркт миокарда. У восьми больных в анамнезе имелся 1 инфаркт миокарда, у трех больных — 2 и у трех больных — 3. У трех больных острый инфаркт миокарда осложнился аневризмой левого желудочка, с наличием в про­свете тромба. Все больные до операции предLявляли жалобы на повторяющиеся боли за грудиной или в области сердца, купирующиеся приемом нитроглицерина. По функциональной классификации Нью-Йоркской ассоциации кардиологов ^НА), 55,4 % больных были отнесены к III функциональному классу (ФК), 6,3 % — к IV ФК, столько же процентов больных имели нестабильную стенокардию, а 38,3 % — клинику II ФК.

Операции выполняли в условиях искусственного кровооб­ращения, комбинированной фармакохолодовой кардиоплегии и общей гипотермии при температуре 28 °С. В случаях распро­страненного поражения коронарных артерий использовали методику антеградного и ретроградного введения кардиопле- гического раствора.

Исследовали две группы больных, принципиально отли­чавшихся объемом хирургического вмешательства. В опытной группе, состоящей из 10 человек, больные подвергались аортокоронарному шунтированию. Среднее время искусственного кровообращения при этом составило 135 мин. Всем больным шунтировали от 2 до 5 коронарных артерий. При этом трем боль­ным — в сочетании с аневризмэктомией и ремоделированием левого желудочка и одному больному — в сочетании с тромбэк- томией. Маммарокоронарное шунтирование было произведено всем десяти больным. Аортокоронарное шунтирование с веноз­ным трансплантатом осуществляли при множественности пора­жения коронарных артерий(шунтирование правой коронарной артерии у 5 больных, огибающей ветви левой коронарной арте­рии у 6 больных, ветви тупого края у 3 больных, диагональной ветви у 3 больных). В контрольной группе (17 человек) больным проводили стентирование коронарных артерий стентами (от 1 до 4) «CYPHER» фирмы «Johnson&Johnson».

Исследовали периферическую кровь больных, взятую за день до операции, на следующий день после операции и в момент выписки из стационара (на 8-10 день). Процент содержания CD34+ клеток определяли с помощью моноклональных антител, меченых фикоэритрином, используя стандартный протокол фир­мы «BD Biosciences» (Germany) и проточный цитофлуориметр FACS CaLibur. В качестве негативного дискриминирующего конт­роля использовали неспецифические меченые моноклональные антитела идентичного изотипа.

Цитокины определяли в сыворотке крови, используя ком­мерческие иммуноферментные тест-системы фирмы «IBL» (Germany) согласно рекомендациям фирмы-производителя. Определяли концентрацию LIF (Leukemia inhibitory factor), SCF (stem ceLL factor), G-CSF (granulocyte colony stimulating factor), GM-CSF (granulocyte-monocyte colony stimulating factor). SDF-1 определяли в иммуноферментном анализе типа «сэндвич», ис­пользуя стандартные методические подходы [1] по следующей схеме. Поликлональные антитела к SDF-1a («PeproTech», USA) в концентрации 3 мкг/мл иммобилизовали на полистирольном планшете («Nunc», Denmark) в карбонат-бикарбонатном буфер­ном растворе в течение ночи при +4 °С. Блокирование неспеци­фического связывания проводили 0,5 % бычьим сывороточным альбумином и 0,1 % твином-20 в фосфатно-солевом буферном растворе в течение 1 ч при комнатной температуре. Образцы сы­воротки крови или калибровочные растворы рекомбинантного SDF-1a («PeproTech», USA) в концентрациях от 0,08 до 20 нг/мл вносили совместно с биотинилированными поликлональными антителами к SDF-1a (1 мкг/мл) и инкубировали 2 ч при ком­натной температуре. Вторые антитела выявляли полимерным конLюгатом стрептавидин — пероксидаза («Sigma», USA) в разведении 1:1000. В качестве субстрата использовали о-фе- нилендиамин («Sigma», USA).

Полученные данные обрабатывали методами математической статистики, используя прикладную программу Microsoft Excel. Вычисляли среднюю арифметическую, среднюю квадратическую ошибку средней арифметической и достоверность различия средних (p), используя функцию ТТЕСТ.

Результаты и обсуждение

На рисунке представлены результаты опре­деления CD34+-клеток в динамике наблюдения. Как оказалось, исходное содержание ГСК в кон­трольной и опытной группах было одинаковым и составляло 0,69±0,17 и 0,65±0,12 %, соответ­ственно. Процедура стентирования приводила к увеличению уровня циркулирующих ГСК у 60 % больных. Однако по средним значениям досто­верных изменений не наблюдалось (р = 0,380). К моменту выписки из стационара у всех больных уровень ГСК возвращался к исходному состоянию. В опытной группе на следующий день после опе­рации содержание CD34+-клеток не отличалось от исходного уровня (р=0,183). Однако к моменту выписки наблюдалось достоверное увеличение количества циркулирующих ГСК в 2,9 раза ф=0,048).

Исследование факторов, способных регулировать поведение ГСК, показало, что их роль в мобилизации ГСК из костного мозга не одинакова. Как видно из таблицы, уровень GM-CSF практически не изменялся у больных обеих групп на протяжении всего периода наблюдений. При этом частные значения этого показателя варьировали незначительно, что может свидетельствовать о полном отсутствии влияния операционного стресса на его уровень в периферической крови. Иная картина наблюдалась при анализе уровня содержания SCF. Хотя достоверных различий в динамике наблюдения отмечено не было как между группами, так и внутри каждой группы, большой разброс данных внутри вариационных рядов свидетельствует об отсутствии общей закономерности изменения уровня данного цитокина в зависимостиот обLема проведенной хирургической операции. При анализе содержания цитокина LIF единственное существенное изменение его уровня было отмечено в контрольной группе в момент выписки из стационара: оно выразилось в виде трехкратного снижения его концентрации по сравнению с исходным значением ф=0,005). Поскольку содержание CD34+-клеток в эти же сроки в контрольной группе оставалось неизменным, можно заключить, что уровень LIF в периферической крови никак не модулирует мобилизацию ГСК из костного мозга. В опытной группе существенных изменений содержания LIF в динамике наблюдения не отмечалось. Поскольку в этой группе отмечалось повышение уровня ГСК в конце наблюдения, этот факт также подтверждает вывод о непричастности эндогенного LIF к мобилизации ГСК при хирургическом стрессе.

В отличие от перечисленных факторов уровень цитокина G-CSF в опытной группе после операции транзиторно повышался в 2,6 раза ^=0,044), тогда как в контрольной группе он не изменялся в динамике наблюдения. Как известно, G-CSF является сильнейшим мобилизационным фактором для ГСК и используется для этой цели в клинической практике [3]. Обращает на себя внимание тот факт, что повышение уровня мобилизационного фактора G-CSF наблюдалось в первый день после операции, а подLем уровня циркулирующих ГСК — к моменту выписки, когда уровень G-CSF снизился до исходного состояния. Анализ уровня SDF-1 показал отсутствие различий между контрольной и опытной группой в исходном состоянии и в первый день после операции. Не было изменений в контрольной группе и в момент выписки из стационара.

Таблица Динамика изменения уровня цитокинов, модулирующих ГСК, у больных ИБС, подвергшихся стентированию коронарных артерий (контроль) и аортокоронарному шунтированию (опыт)

 

Примечание.

Достоверность различия с состоянием до операции: ***p=0,001.p=0,044, **p=0,005,

 

Рисунок. Динамика содержания CD34+-гемопоэтических стволовых клеток в периферической крови у больных с ИБС до и после операции стентирования (контроль) или аортокоронарного шунтирования (опыт)

Однако в опытной группе в этот срок наблюдалось 3,5-кратное увели­чение (p=0,001) концентрации SDF-1 в крови, что совпадало с повышением уровня CD34+-клеток в крови в этой же группе.

Таким образом, наши исследования показали, что хирургические операции приводят к мобили­зации CD34+-ГСК/предшественников из костного мозга в периферическое кровообращение. При­чем объем хирургического вмешательства играет определяющую роль в этом процессе. Ранее было показано, что хирургический стресс и высокие физические нагрузки способствуют мобилизации дендритных клеток и ГСК из костного мозга [2, 5]. Значительное повышение уровня циркулирующих ГСК отмечали при ортотопической транспланта­ции печени, а также при ее частичной резекции при гепатоцеллюлярной карциноме [7]. И, наконец, недавно группа польских ученых установила, что инсульт и острый инфаркт миокарда у человека приводит к существенной мобилизации ГСК из костного мозга [8]. В наших исследованиях подLем уровня G-CSF на следующий день после операции свидетельствует о том, что именно хирургичес­кий стресс индуцирует усиление его продукции. И хотя к мобилизационным факторам относятся также GM-CSF и SCF, которые способны самосто­ятельно или в кооперации с другими факторами вызывать мобилизацию ГСК из костного мозга [3, 4], отсутствие изменений в их продукции в после­операционный период может свидетельствовать об их непричастности к процессу мобилизации CD34+-клеток при хирургическом стрессе.

Исходя из наших данных, можно предполо­жить, что хирургический стресс приводит к транзиторному повышению продукции G-CSF, который, в свою очередь, инициирует мобилиза­цию из костного мозга CD34+-клеток. Причем уровень ГСК в периферической крови существенно возрастает лишь через 8-10 дней. Значительное повышение в этот же период уровня SDF-1, игра­ющего роль фактора хоуминга для ГСК, очевидно, свидетельствует в пользу гипотезы участия ГСК в восстановлении поврежденных тканей. Получен­ные данные наводят на мысль о том, что с точки зрения поддержания и усиления мобилизацион­ного процесса, индуцированного хирургической операцией, представляет интерес использование лекарственных препаратов на основе рекомбинант- ных колониестимулирующих факторов с целью ускорения заживления раневых поверхностей и, соответственно, реабилитации хирургических больных.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Республики Казахстан в рамках научно-тех­нической программы

ЛИТЕРАТУРА

Брэдуэлл А., Кэтти Д., Дайкс П. и др. Антитела. Методы. Кн. 2: Пер. с англ. / Под ред. Д. Кэтти. — М.: Мир, 1991. — 384 с.

Bonsignore M.R., Morici G., Santoro A. et al. Circulating hematopoietic progenitor cells in runners // J. Appl. Physiol. — 2002. — Vol. 93, № 5. — P. 1691-1697.

Cottler-Fox M.H., Lapidot T., Petit I. et al. Stem cell mobilization // Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. — 2003. — P. 419-437.

Glaspy J.A., Shpall E.J., LeMaistre C.F. et al. Peripheral blood progenitor cell mo­bilization using stem cell factor in combination with filgrastim in breast cancer patients // Blood. — 1997. — Vol. 90, № 8. — P. 2939-2951.

Ho C.S., Lopez J.A., Vuckovic S. et al. Surgical and physical stress increases circulating blood dendritic cell counts independently of monocyte counts // Blood. — 2001. — Vol. 98, № 1. — P. 140-145.

Kuria M., Reca R., Miekus K. et al. Trafficking of normal stem cells and metastasis of cancer stem cells involve similar mechanisms: pivotal role of the SDF-1 — CXCR4 axis // Stem cells. — 2005. — Vol. 23, № 7. — P. 879-894.

Lemoli R.M., Catani L., Talarico S. et al. Mobilization of bone marrow-derived hematopoietic and endothelial stem cells after ortotopic liver transplan­tation and liver resection // Stem Cells. — 2006. — Vol. 24, № 12. — P. 2817-2825.

Paczkowska E., Larysz B., Rzeuski R. et al. Human hematopoietic stem/progenitor- enriched CD34(+) cells are mobilized into peripheral blood during stress related to ischemic stroke or acute myocardial infarction // Eur. J. Haematol. — 2005. — Vol. 75, № 6. — P. 461-467.

The influence of surgical stress on the level of circulating CD34+ hematopoietic stem cells:

analysis of possible mobilization factors

M.A. Aliev1, N.N. Belyaev2, M.R. Rysuly, E.A. Akhmetov, A.O. Seidalin, T.A. Supniyazova, Yu.V. Pefilieva, R.T. Tleulieva, B.A. Zhumabaeva, A.T. Kodasbaev, K.S. Battalova, Zh.A. Satybaldieva

1 A.N. Syzganov Scientific Centre of Surgery Ministry of Health; 2 M.A.Aitkhozhin Institute of Molecular Biology and Biochemistry; 3 National Centre of Drug Expertise Ministry of Health, Almaty, Republic of Kazakhstan;4 Stemcord Ltd.

A study of CD34+ hematopoietic stem cell (HSC) content in peripheral blood of patients, undergoing surgery operation of different heaviness in connection with cytokine level specifically influencing functional activity of HSC was the aim of the investigation. 27 patients suffering from ischemic cardiomyopathy were observed. Experimental group with multiple lesions of coronary arteries underwent coronary artery bypass grafting. Endoprosthesis replacement was carried out in control group. Surgical operation did not modify the level of HSC in control group in any period. Experimental group showed 2.9-fold increase in HSC content and SDF-1 level (3.5-fold) in peripheral blood 10 days after operation. The level of GM-CSF, SCF and LIF did  not change in both groups during entire period of observation. Transitory increase in G-CSF level (2.6-fold) was only observed in the experimental group 1 day after operation. Considerable surgical trauma is suggested to increase the G-CSF production as soon as in 1 day, which in turn stimulates HSC mobilization from bone marrow. Coincidence in time of maximums of HSC content and SDF-1 production provides evidence that the axis G-CSF - HSC - injured tissue - SDF-1 is important in tissue reparation during posttraumatic period. (Cytokines and Inflammation. 2008. Vol. 7, № 2. P. 45-48.)

Key words: cardiosurgery, hematopoietic stem cells, cytokines, SDF-1.



загрузка...