Влияние рецепторов эпидермального фактора роста и белка STAT1 на пролиферативную активность уротелиальных опухолей мочевого пузыря И.А. Шалавин, И.И. Бабиченко, И.А. Костанян, С.А. Осипов, М.В. Самойлов ГОУ ВПО «Российский Университет дружбы народов»,Институт биоорганической химии РАН им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова,Центральная клиническая больница РАН, Москва

Влияние рецепторов эпидермального фактора роста и белка STAT1 на пролиферативную активность уротелиальных опухолей мочевого пузыря И.А. Шалавин, И.И. Бабиченко, И.А. Костанян, С.А. Осипов, М.В. Самойлов ГОУ ВПО «Российский Университет дружбы народов»,Институт биоорганической химии РАН им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова,Центральная клиническая больница РАН, Москва

Белки EGFR, c-erbB-2, STAT1 могут участвовать в процессах онкогенеза уротелия. Цель: изучить влияние EGFR, c-erbB-2 и STAT1 на пролиферацию клеток при раке мочевого пузыря. Фиксированные в формалине тканевые фрагменты опухолей мочевого пузыря 42 пациентов исследовали иммуногистохимически с антителами к EGFR, с-егЬВ-2, Ki-67, STAT1. Средний индекс пролиферации (ИП) Ki-67 в

РМП, не содержащем EGFR, составил 6 %, при наличии EGFR — 15 % (p = 0,001). Экспрессия c-erbB-2 сопровождалась увеличением ИП Ki-67 с 3 до 13 % (р = 0,008). При положительной реакции на STAT1 пролиферация возрастала с 7,4 до 17 % (р = 0,024). Таким образом, рецепторы эпидермального фактора роста играют ключевую роль в пролиферации не только мышечно-инвазивного РМП, но и Та-Т1 уротелиальных опухолей мочевого пузыря. Белки STAT влияют на рост и пролиферацию уротелиальных опухолей. В карциномах низкой степени злокачественности (T1G1-2) наблюдается прямая зависимость между пролиферацией опухолевых клеток и коэкспрессией STAT1, c-erbB-2. (Цитокины и воспаление.2008. Т. 7, № 4. С. 37-40.)

Ключевые слова: EGFR, c-erbB-2, Ki-67, STAT1, рак мочевого пузыря.

Рецепторы эпидермального фактора роста (EGFR) относятся к системе трансмембранных циклинзависимых тирозинкиназ, которые при связывании с лигандами усиливают рост, пролифе­рацию и дифференцировку эпителиальных клеток. В дополнение к важной физиологической роли, рецепторы имеют ключевое значение в опухолевой трансформации и прогрессии. Гиперэкспрессия EGFR связана с прогрессией поверхностного рака мочевого пузыря (РМП) и безрецидивной выжива­емостью больных [8]. В свою очередь, совместная гиперэкспрессия EGFR и онкопротеина c-erbB-2 характеризует агрессивный фенотип уротели- альных новообразований и связана с высокой летальностью [4].

Известно, что коэкспрессия рецепторов EGFR и c-erbB-3 обладает чрезвычайной онкогенной активностью, главным образом, за счет вовлечения PI3K/PKB — сигнального пути [6]. Аналогичного влияния содружественной экспрессии EGFR и c-erbB-2 можно было бы ожидать и в отношении пролиферативной активности. Однако доступные кинетические модели рассматривают пролифера­тивную активность только как функцию экспрес­сии с-егЬВ-2 [3].

Белки STAT играют существенную роль во внутриклеточных процессах передачи сигнала рецепторов эпидермального фактора роста и интерферонов. Имеются данные о вовлечении STAT-протеинов, наряду с МАРК и Akt/mTOR, в EGFR-опосредованные механизмы опухолевого роста [5, 9]. Тем не менее, отдельные исследова­ния свидетельствуют об отсутствии воздействия STAT1 на пролиферативную активность клеток [2]. Целью настоящего исследования было изучение роли рецепторов эпидермального фактора роста и белка STAT1 в процессах пролиферации уротели- альных опухолей мочевого пузыря.

Материалы и методы

В исследование включено 42 пациента (средний возраст — 68 лет; 16 женщин, 26 мужчин). Патоморфологические заключения сформулированы согласно классификации уротелиальных опухолей ВОЗ 2004 г. [1]. Обнаружение тканевых антигенов осуществляли с помощью поликлональных антител к EGFR и моноклональных антител к c-erbB-2 (Dako), Ki-67 и STAT1 (Diagnostic Biosystems). Визуализацию иммунных комплексов осуществляли иммунопероксидазным методом с помощью системы детекции LSAB + (Dako). Оценка интенсивности иммуногистохимической реакции c рецепторами EGFR и c-erbB-2 выполнена согласно порядковой шкале: 0 — мембранного окрашивания нет; 1 + — слабое окрашивание неполного периметра мембран выявляется более,чем в 10 °% клеток; 2 + — окрашивание мембран средней интенсивности по всему периметру выявляется более, чем в 10 %о клеток; 3 + — интенсивное окрашивание мембран по всему периметру выявляется более, чем в 10 °% клеток. При статистических расчетах отрицательной считали реакцию при отсутствии мембранного окрашивания и положительной при окрашивании мембран слабой, средней и высокой интенсивности. Реакцию на белок STAT1 оценивали с помощью подсчета количества клеток с окрашенной цитоплазмой при учете 800 клеток. Критерием положительной реакции на STAT1 было окрашивание цитоплазмы более 40 °% клеток. В качестве индикатора пролиферативной активности использован индекс пролиферации Ki-67, который определяется долей окрашенных ядер при учете 500 клеток, выраженной в процентах.

Статистическая обработка результатов выполнена с помощью программного пакета SPSS 16.0. Оценка различий экспрессии Ki-67 и STAT1 в группах отрицательной и положительной реакции на EGFR и c-erbB-2 осуществлена с использованием критерия Манна — Уитни и двустороннего критерия Фишера.

Гистопатологическое иссле­дование выявило 12 неинвазивных уротелиальных опухолей (11 опухолей низкого злокаче­ственного потенциала (ОНЗП), 1 инвертированная папиллома) и 30 инвазивных уротелиаль­ных карцином. У 18 пациентов обнаружен инвазивный рак низ­кой степени злокачественности ТЮ1-2, у 9 — высокой степени ТЮ3. Еще 3 наблюдения со­ставили мышечно-инвазивные карциномы низкой (Т2G1-2, 1) и высокой степени злокачест­венности (T2G3, 2). Экспрессию маркеров оценивали также в нормальном уротелии мочеточников, полученных от 5 пациентов в ходе нефроуретерэктомии в связи с почечно-клеточной карциномой.

При изучении контрольной группы реакции с EGFR, c-erbB-2, STAT1 оценены отрицательными во всех 5 случаях. Средний индекс пролиферации Кь67 составил 0,4 %. В группе новообразований положительная реакция с EGFR и с-егLВ-2 отме­чалась соответственно у 31 и 57 % больных. Индекс пролиферации Кь67 варьировал от 1 % в ОНЗП до 27 % в ТЮЗ карциноме. Экспрессия БТАТ1 встре­тилась у 19/42 (45,2 %) больных (табл. 1).

Сравнение индекса пролиферации К1-67 и рецеп­торного статуса уротелиальных новообразований показало влияние экспрессии EGFR и с-егLБ-2 на пролиферативную активность (табл. 2). В связи с тем, что границы 95 % доверительных интервалов не пересекаются, можно сделать заключение о зна­чимом отличии (р < 0,05) пролиферации в группах, экспрессирующих EGFR и с-егLБ-2 с различной интенсивностью.

Средний индекс пролиферации в группе опу­холей, не содержащих ЕGFR, составил 6,01 %, тогда как в присутствии EGFR — 14,7 % (р = 0,001). Подобным образом при экспрессии с-егLБ-2 про­лиферация возрастала с 3,22 до 13,45 % (р = 0,008, рис. 1). Содружественная экспрессия обоих ре­цепторов приводила к двукратному повышению показателя пролиферативной активности — с 8,1 до 16,9 % (р = 0,02).

Таблица 1 Экспрессия рецепторов эпидермального фактора роста и белка STAT1 и пролиферация рака мочевого пузыря EGF и пролиферация уротелиальных опухолей

 

Таблица 2 Корреляция между экспрессией рецепторов эпидермального фактора роста и белка STAT1 и пролиферативной активностью рака мочевого пузыря

 

Экспрессия STAT1 сопровождалась значимым увеличением пролиферативной активности с 2,9 % в группе с низким содержанием STAT1 до 25 % при окрашивании более 60 % клеток (р < 0,05, табл. 2). Индекс пролиферации Ki-67 в группе опухолей с отрицательной реакцией на STAT1 составил 7,4 %, в то же время при положительной реакции этот показатель составил 17 % (р = 0,021, рис. 3). Коэкспрессия STAT1 и c-erbB-2 была связана с увеличением пролиферации T1G1-2 опухолей (rs = 0,382, p = 0,024).

Известно, что содружественная экспрессия EGFR и c-erbB-2 сопровождается задержкой EGFR на плазматической мембране и замедлением распада рецептора [10]. Высокие концентрации ге- теродимерных комплексов EGFR/^erbB-2 через адаптерные протеины активируют нисходящие сигнальные пути пролиферации (МАРК) и биосин­теза белка (AKT/mTOR). Учитывая индуцирую­щее влияние МАР-киназы на дифференцировку клеток в условиях длительного воздействия EGFR и c-erbB-2 становятся понятными вторичный опу­холевый рост и прогрессия T1-карцином мочевого пузыря, содержащих EGFR и c-erbB-2. Представ­ленные данные подтверждают более чем 2-кратное увеличение пролиферативной активности в случае коэкспрессии EGFR и c-erbB-2.

При связывании лигандов с рецепторами эпидермального фактора роста, интерфероновыми рецеп­торами может быть задействован JAK/STAT-путь передачи сигнала. Димеризованные белки STAT1 проникают в ядро, где индуцируют транскрипцию генов клеточного цикла, пролиферации, ангиогенеза и уклонения от иммунного ответа.

В исследованиях in vitro показана прямая связь экспрессии STAT и BCL-x [7]. Блокирование белков STAT приводит к уменьшению содержания BCL- x, остановке клеточного цикла и апоптозу. В свою очередь, применение специфического ингибитора STAT в клеточных линиях мочевого пузыря сопро­вождалось снижением пролиферативной актив­ности и замедлением перехода из G0/G1- в S-фазу клеточного цикла [11]. В соответствии с этими дан­ными, в настоящих исследованиях опухолей мо­чевого пузыря человека показано, что показатель их пролиферативной активности положительно коррелировал с количеством STATl-экспрессирующих клеток. При этом в карциномах низкой степени злокачественности (T1G1-2) наблюдалась прямая зависимость между коэкспрессией STAT1, c-erbB-2 и увеличением пролиферации опухоле­вых клеток.

Выводы

Рецепторы эпидермального фактора роста иг­рают ключевую роль в пролиферации не только мышечно-инвазивного рака мочевого пузыря, но и Tа-T1 уротелиальных опухолей мочевого пузыря.

Коэкспрессия EGFR и c-erbB-2 и последующее двукратное повышение пролиферативной актив­ности может лежать в основе рецидивирования и прогрессии Ta-T1 опухолей и должна учитываться наряду с другими неблагоприятными прогности­ческими факторами.

Рис. 1. Пролиферативная активность рака мочевого пузыря у лиц с положительной и отрицательной реакцией на рецепторы эпидермального фактора роста EGFR (а) и c-erbB2 (б)

 

Рис. 2. Пролиферативная активность рака мочевого пузыря у лиц с положительной и отрицательной реакцией на белок STAT1 EGF и пролиферация уротелиальных опухолей

В уротелиальных опухолях мочевого пузыря показатель пролиферативной активности положительно коррелирует с количеством БТАТ1- экспрессирующих клеток. В карциномах низкой степени злокачественности наблюдается прямая зависимость между пролиферацией опухолевых клеток и коэкспрессией БТАТ1, с-егLБ-2.

ЛИТЕРАТУРА

Андреева Ю.Ю., Завалишина Л.Э., Франк Г.А. Классификация эпителиальных опухолей мочевого пузыря // Арх. патол. — 2006. — T. 68, № 5. — С. 46-53.

Berclaz G., Altermatt H.J., Rohrbach V. et al. EGFR dependent expression of STAT3 (but not STAT1) in breast cancer // Int. J. Oncol. — 2001. — Vol. 19, № 6. — P. 1155-1160.

Eladdadi A., Isaacson D. A mathematical model for the effects of HER2 overex­pression on cell proliferation in breast cancer // Bull. Mathem. Biol. — 2008. — Vol. 70, № 6. — P. 1707-1729.

Gorgoulis V.G., Barbatis C., Poulias I., Karameris A.M. Molecular and immunohis- tochemical evaluation of epidermal growth factor receptor and c-erb-B-2 gene product in transitional cell carrinomas of the urinary bladder: a study in Greek patients // Mod. Pathol. — 1995. — Vol. 8, № 7. — P. 758-764.

Jacobs M.A., Wotkowicz C., Baumgart E.D. et al. Epidermal growth factor receptor status and the response of bladder carcinoma cells to erlotinib // J. Urol. — 2007. — Vol. 178, № 4, pt. 1. — P. 1510-1514.

Kim H.H., Sierke S.L., Koland J.G. Epidermal growth factor-dependent associa­tion of phosphatidylinositol 3-kinase with the ErbB3 gene product // J. Biol. Chem. — 1994. — Vol. 269, № 40. — P. 24747-24755.

Lassmann S., Schuster I., Walch A. et al. STAT3 mRNA and protein expres­sion in colorectal cancer: effects on STAT3-inducible targets linked to cell survival and proliferation // J. Clin. Pathol. — 2007. — Vol. 60, № 2. — P. 173-179.

Lipponen P., Eskelinen M. Expression of epidermal growth factor receptor in blad­der cancer as related to established prognostic factors, oncoprotein (c-erbB-2, p53) expression and long-term prognosis // Br. J. Cancer. — 1994. — Vol. 69, № 6. — P. 1120-1125.

Mo L., Zheng X., Huang H. Y. et al. Hyperactivation of Ha-ras oncogene, but not Ink4a/Arf defiriency, triggers bladder tumorigenesis // J. Clin. Invest. — 2007. — Vol. 117, № 2. — P. 314-325.

Shankaran H., Wiley H., Resat H. Modeling the effects of HER/ErbB1-3 coexpres- sion on receptor dimerization and biological response // Biophys. J. — 2006. — Vol. 90, № 11. — P. 3993-4009.

Wu F., Chen Y., Li Y. et al. RNA-interference-mediated Cdc42 silencing down- regulates phosphorylation of STAT3 and suppresses growth in human blad­der-cancer cells // Biotechnol. Appl. Biochem. — 2008. — Vol. 49, pt. 2. — P. 121-128.

EGF receptors (EGFR) and STAT proteins could up-regulate proliferation and tumor growth of the urinary bladder cancer I.A. Shalavin, I.I. Babichenko, I.A. Kostanyan, S.A. Osipov, M.V. Samoylov

 Peoples' Friendship University,  M.M. Shemyakin and Y.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry,

Russian Academy of Sciences, 3 Central Clinical Hospital, Russian Academy of Sciences, Moscow

The aim of the study: to explore the effect of EGF receptors and STAT proteins on proliferation activity in bladder cancer. Formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples were stained with antibodies against EGFR, c-erbB-2, Ki-67, and STAT1. The results showed that Ki-67 labeling index (LI) made up 6 % and 15 % in the absence and presence of EGFR respectively (p = 0,001). C-erbB-2 expression was accompanied by elevated Ki-67 LI (p = 0,003). STAT1 expression and proliferative activity were associated (p = 0,024). Thus, EGF receptors play major role in proliferation of the Ta-T1 urothelial neoplasms. STAT proteins influence proliferation and tumor growth of the urothelial neoplasms. (Cytokines and Inflammation. 2008. Vol. 7,

№ 4. P. 37-40.)

Key words: EGFR, c-erbB-2, Ki-67, STAT1, urinary bladder cancer.