загрузка...
 
4.8. Анализ спороцидной активности  анолита АНК
Повернутись до змісту

4.8. Анализ спороцидной активности  анолита АНК

 

В соответствии с рядом устойчивости микроорганизмов по отношению к биоцидным агентам, наибольшей устойчивостью обладают бактериальные формы микроорганизмов - микобактерии и споры. В общем случае,  устойчивость микроорганизмов разделяют на естественную и приобретенную. Расположение микроорганизмов в ряду в соответствии с возрастанием сопротивляемости к воздействию биоцидных агентов связано с естественной устойчивостью, которую обычно относят к химическому составу и строению клеточных оболочек. Приобретенная устойчивость является результатом генетических изменений либо за счет мутации хромосом, либо за счет приобретения генетических элементов таких как плазмидов или транспозонов.

 Различие уровней чувствительности больничных штаммов микроорганизмов и внебольничных внутри одной группы микроорганизмов связывают с приобретенной устойчивостью, которая также приводит к изменениям в химическом составе клеточных оболочек, а точнее, к появлению в них липидов. Так, например, клеточная оболочка грам-положительных бактерий (стафилококков и стрептококков, а также вегетативных клеток бацилл), обладающих наивысшей чувствительностью по отношению к бактерицидным растворам, состоит в основном из толстого слоя пептидогликана (муреина). Появление  липидов в составе клеточной оболочки S.aureus объясняет его повышенную устойчивость по сравнению с другими грам - положительными бактериями. Клеточная стенка грам-отрицательных бактерий  представляет собой сложную двухслойную структуру, в которой слой пептидогликана составляет только 10 - 20% (у грам-положительных - 60 - 80%), а наружный слой, называемый наружной клеточной оболочкой,  - состоит из молекул липопротеина,  ковалентно связанного с пептидогликаном, наружная поверхность этих бактерий содержит слой липополисахарида (эндотоксина), состоящего из полисахаридов и липида А. Наличие липополисахаридов и липопротеинов определяют гидрофобную природу поверхности клеток   грам-отрицательных бактерий  и их резистентность по отношению к  биоцидным растворам.  Клеточные стенки микобактерий имеют более сложный состав и содержат скелет, состоящий из двух ковалентно связанных полимеров (пептидогликана и арабиногалактана), толстого липидного слоя  (60%), который защищает микобактерии от воздействия кислот и щелочей, но  может быть удален нейтральными растворителями, и пептидов, которые легко разрушаются под действием протеолитических ферментов. Очевидно, что для разрушения липидсодержащих защитных слоев биоцидный агент должен обладать гидрофобными свойствами или включать в свой состав поверхностно-активные вещества, увеличивающие сродство биоцидного агента с гидрофобной поверхностью клеточной  оболочки,  или ферменты, способные разрушить липидный слой. Неполярные вещества, такие как стероиды и газы легко проникают через клеточную оболочку, растворяясь в липидах.  Устойчивость спор бактерий Bacillus  и Clostridium к воздействию биоцидных растворов связывают не с наличием липидов в составе споровой оболочки, а с наличием белков типа кератина, не расщепляемых гидролитическими ферментами, а также с химическим составом центральной массы споры, обогащенной ионами кальция, которые придают спорам устойчивость к температурным обработкам. Особенности химического состава спор приводят к тому, что такие биоцидные агенты, как фенолы, хлоргексидин, четвертичные аммониевые основания, органические кислоты и эфиры, обладая высокой бактерицидной активностью,  не являются спороцидными, а соединения активного хлора (наряду с глутаровым альдегидом, формальдегидом, пероксидными соединениями) обладают и бактерицидной, и спороцидной активностью. При этом  минимальные концентрации активного хлора, необходимые для уничтожения спор, выше концентраций, необходимых для обеззараживания неспорообразующих бактерий, время экспозиции, необходимое для уничтожения спор, также выше времени, обеспечивающего бактерицидный эффект для неспорообразующих бактерий.

В соответствии с Методическими рекомендациями по применению ЭХА растворов активного хлора, получаемых на установках СТЭЛ, растворы анолита могут применяться для стерилизации медицинских изделий. Время выдержки в режимах стерилизации зависит как от типа анолитов, так  и от материалов, из которых выполнено стерилизуемое изделие.

В общем случае, эффективность обработки изделий зависит от уровня и типа загрязненности их поверхностей. В условиях высокой органической нагрузки (то есть, в присутствии белковых  загрязнений) происходит снижение концентрации активного хлора из-за  его взаимодействия с органическими загрязнениями.  Причем, в зависимости от уровня органической нагрузки, снижение концентрации активного хлора в первую же минуту может быть весьма значительным, что исключает возможность его биоцидного воздействия.

 Поскольку в присутствие органической нагрузки происходит снижение концентрации активного хлора  в анолите, применяемом на стадии дезинфекции, режим обработки изделий, в соответствии с методическими рекомендациями, выбирается с учетом уровня загрязненности изделия и типа микрофлоры, что значительно превосходит  концентрации и время обработки, рекомендуемые для режимов стерилизации. При обработке изделий в автоматических системах  типа «Олимпус» или «Стерис», стадия дезинфекции, предшествующая предстерилизационной обработке, отсутствует, то есть в этих системах процесс обработки изделия включает только этапы предстерилизационной обработки и стерилизации / дезинфекции высшего уровня. Другими словами,  уровень органической нагрузки на стадии дезинфекции / стерилизации при обработке изделий в автоматических системах минимален, что соответствует режимам стерилизации изделий, представленным в методических рекомендациях по применению растворов анолитов. Таким образом, при отсутствии органических загрязнений, выбор режима обработки в автоматических системах осуществляется только с учетом материалов обрабатываемых изделий и сложности их конфигураций ( особенно для изделий, имеющих труднодоступные участки и узкие каналы).

В тестах по оценке  спороцидной активности анолитов по отношению к обсемененным тест - объектам, было обнаружено, что режимы обработки зависят прежде всего от гидрофильности обрабатываемых поверхностей и их пористости, причем, пористость в свою очередь  уменьшает степень смачиваемости гидрофобных поверхностей и увеличивает проницаемость гидрофильных поверхностей.

Влияние природы материалов с точки зрения их гидрофильности  на антимикробную активность анолита исследовалось на основе метода определения спороцидной активности дезинфектантов 966,04, представленного в Официальных Методах Анализа Международной Ассоциации Химиков Аналитиков США (1995). Данный метод применяется для определения спороцидной активности жидких и газообразных биоцидных агентов [4]. В качестве гидрофильных поверхностей были использованы фарфоровые цилиндры, в качестве гидрофобных - кольца шелковых нитей (необходимо особо отметить, что и шелковые нити и фарфоровые цилиндры имеют пористые поверхности).  В качестве тест-культур использовали Cl. sporogenеs  и  B.subtilis. В результате исследований было установлено, что гидрофильные поверхности, обсемененные спорами B. subtilis, легко поддаются стерилизации растворами анолитов с различными рН (рис. 4.20).

 

Рис. 4.20. Влияние времени экспозиции при температуре 20°С на спороцидную активность анолита АНК по отношению к  гидрофильным поверхностям, обсемененным спорами B. subtilis

 

При обработке гидрофобных поверхностей, обсемененных спорами Cl. sporogenеs и B.subtilis и гидрофильных поверхностей, обсемененных спорами Cl. sporogenеs, поверхность которых становится гидрофобной после выдержки в культуральной среде в процессе обсеменения, количество стерильных проб составляло менее 90%.  Анализ полученных результатов позволил сделать предположение о том, что для увеличения эффективности обработки гидрофобных поверхностей (к которым можно также отнести полимерные материалы, и резины) необходимо снижение межфазного натяжения анолита. Уменьшение межфазного натяжения может быть достигнуто либо повышением температуры, либо введением в систему поверхностно-активных веществ (желательно, в количестве не более 1%  для сохранения физико - химических параметров анолита), либо за счет увеличения объема газовой фазы рабочих растворов (изменение спороцидной активности анолита АНК при увеличении объема газовой фазы не рассматривается в данной работе).  При увеличении температуры анолита до 50°С было установлено, что, несмотря на уменьшение концентрации активного хлора (рис.4.21) на 25% по сравнению с исходной концентрацией, время стерилизации может быть сокращено в два - три раза при обработке гидрофильных поверхностей, обсемененных спорами B. Subtilis (рис.4.22). При обработке тех же поверхностей, обсемененных спорами Cl. Sporogenеs, для достижения спороцидного эффекта  требуется более длительное времени экспозиции и при температуре 50°С оно составляет не менее одного часа (рис. 4.23).

 

 

Рис. 4.21.  Изменение концентрации активного хлора в растворах анолита АНК при увеличении температуры и в присутствии органической нагрузки. ( Концентрацию активного хлора определяли сразу после введения сыворотки в качестве органической нагрузки.)

 

Влияние температуры на спороцидную активность растворов анолита АНК  представлено на рис.4.22 и рис.4.23, где  спороцидная активность выражена в процентах количества стерильных объектов относительно общего количества объектов.

При обработке гидрофобных поверхностей  повышение температуры до 50°С  было менее эффективно. Отсутствие эффекта при обработке гидрофобных поверхностей анолитом АНК при температуре 50°С позволило предположить, что  при обработке шелковых нитей концентрация активного хлора в растворе анолита снижается из-за его дезактивации под действием культуральной среды, использованной при обсеменении нитей спорами. Изменение концентрации активного хлора в растворах анолита АНК  в присутствии культуральной среды, использованной при подготовке тест - объектов, представлено в таблице 4.14.

Рис.4.22.  Влияние температуры и времени экспозиции на спороцидную активность анолита АНК по отношению к  гидрофильным поверхностям, обсемененным спорами B. Subtilis

 

Таблица 4.14.  

 Изменение концентрации активного хлора

 в присутствии культуральной среды.

Объем среды, 

Концентрация активного хлора, мг/л*

введенной в 100 мл анолита, мл

Мясопептонный бульон

 почвенного экстракта

 Яично - мясной бульон

 почвенного экстракта

0

290

290

0,25

175

0

1,25

150

0

2,5

50

0

5,0

0

0

7,5

0

0

* концентрацию активного хлора измеряли сразу после введения среды в объем анолита.

 

            Результаты, приведенные в таблице 4.14 свидетельствуют о том, что под действием  культуральной среды происходит дезактивация анолита (что равносильно присутствию органической нагрузки), и что для достижения  спороцидного эффекта необходимо либо увеличении концентрации активного хлора, либо обеспечение  притока свежей порции анолита каждые 10 минут. Как уже отмечалось выше, на стадии стерилизации дезактивация анолита под действием органической нагрузки не происходит, поскольку на предшествующей стерилизации стадии предстерилизационной очистки происходит устранение органических загрязнений. То есть, при оценке спороцидной активности раствора методом 966.04 условия теста соответствуют не стадии стерилизации, а полному циклу обеззараживания объектов, инфицированных спорообразующими бактериями.

Применение поверхностно - активных веществ в концентрациях, не превышающих одного объемного процента по отношению к объему анолита, существенно не изменяет физико-химических и биоцидных показателей анолита (рис. 4.23), но увеличивает моющую способность раствора.

 

Рис. 4.23.  Влияние температуры и времени экспозиции на спороцидную активность анолита АНК по отношению к гидрофильным поверхностям, обсемененных спорами С. sporogenes.

 

На рис. 4.23 представлены три режима обработки ниток :

 I - 1час. выдержка нитей в анолите с энзимсодержащим детергентом при Т 20оС,  с последующей обработкой в потоке анолита в течение 25 мин. при  Т = 17оС;

II - 1 час. выдержка в анолите с энзимсодержащим детергентом, с последующей обработкой в статическом режиме в анолите АНК без энзимов в течение 1 часа при Т = 20оС;

III - выдержка в анолите с энзимсодержащим детергентом в течение 1 часа при Т = 20°С.

 

Рис. 4.24.  Определение спороцидной активности анолита АНК ,при добавлении 1% энзимсодержащего детергента, по отношению к гидрофобным поверхностям, обсемененным спорами C. Sporogenes.

При обработке шелковых нитей, инфицированных спорами Cl.sporogenеs, наиболее эффективно применение энзимсодержащих поверхностно - активных веществ (рис 4.24). Введение энзимсодержащего ПАВ снижает расход активного хлора на деструкцию органических примесей, что обеспечивает наличие остаточного хлора на протяжении всего процесса обработки (концентрация активного хлора даже при времени обработки 2 часа составляла 50 мг/л).

 

Рис. 4.25. Определение спороцидной активности анолита АНК при добавлении 0,1% раствора октил-фенокси-полиэтокси-этанола (TRITON - X),по отношению к различным тест объектам.

 

Использованное в этих экспериментах  поверхностно - активное вещество применяется для отмывки фарфоровых цилиндров при подготовке их в качестве  тест - объектов в процессе исследований по определению спороцидной активности дезинфектантов.

 

При этом для обеспечения стерильности достаточно 20 минутной обработки шелковых нитей при комнатной температуре анолитом с добавкой энзимсодержащего ПАВ, с последующей обработкой в статическом режиме анолитом без добавления ПАВ в течение 1,5 часов, либо в потоке анолита в течение 45 минут. Для обработки цилиндров, обсемененных спорами Cl. Sporogenеs, достаточно введение в анолит поверхностно - активного вещества “Triton X-100” (octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol), рекомендованного для мойки фарфоровых цилиндров, в количестве 0.1% (рис.4.25). Применение этого детергента в количестве 0,1% при обработке шелковых нитей, независимо от вида спор, не обеспечивает спороцидного эффекта. Отсутствие спороцидного эффекта при обработке шелковых нитей, обсемененных спорами B. Subtilis, свидетельствует о том, что данный детергент не увеличивает смачивающей способности анолита по отношению к поверхности нити.

Так как при введении поверхностно-активных веществ на фоне биоцидной активности увеличивается моющая способность анолита, целесообразно его использование на стадии предстерилизационной очистки. Использование анолита вместо воды для промывки обрабатываемых изделий от следов ПАВ позволяет сократить время ополаскивания и объем используемой для этих целей воды. При этом процесс дезинфекции, являющийся обязательным в соответствии с методическими рекомендациями, может быть совмещен с процессом предстерилизационной очистки. Использование свежих порций анолита для предстерилизационной очистки и ополаскивания от следов ПАВ, обеспечивает поддержание постоянной концентрации активного хлора, что также исключает негативное влияние остаточных белковых загрязнений на биоцидную активность анолита. Более того, проведение дезинфекции в потоке анолита позволяет снижать как концентрацию активного хлора, так и время обработки при тех же концентрациях, благодаря поддержанию концентрации на постоянном уровне в течение всего процесса дезинфекции. Еще одним решением проблемы снижения концентрации или времени обработки (или и того, и другого), обеспечивающим непрерывную подачу свежих порций анолита к обрабатываемой поверхности, может быть использование ультразвука.

Учитывая возможность получения растворов анолита с различной концентрацией активного хлора в одном и том же технологическом цикле, было предложено снижение концентрации активного хлора в растворе АНК, используемом на заключительном этапе ополаскивания. Для определения остаточной концентрации хлора на поверхности изделий, обрабатываемых раствором анолита с концентрацией активного хлора 50 мг/л в течение 5, 10 и 60 минут,  цилиндры погружали в дистиллированную воду, содержащую раствор KI. Результаты спектрофотометрического анализа воды показали отсутствие следов активного хлора.   Полученные результаты позволяют рекомендовать применение анолита с концентрацией активного хлора менее 50 мг/л на заключительном этапе ополаскивания. При этом использование стерильной воды становиться минимальным или может быть исключено полностью.

 



загрузка...