ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск
Проведен сравнительный анализ продукции Th1- и ^2-цитокинов (TNFa, IFNy, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, GM-CSF), а также количества CD4 и CD8 Т-лимфоцитов, внутриклеточно экспрессирующих IFNy и/или IL-4, в группах здоровых доноров и больных сепсисом, включая пациентов со сниженной (более чем на 50 %) и сохранной пролиферацией Т-клеток в ответ на стимуляцию анти-^3-антителами. Показано, что у больных со сниженной пролиферативной активностью Т-клеток имеется угнетение продукции IL-2, IFNy и IL-4, которое ассоциировано со снижением относительного количества IFNy- и IL-4-позитивных CD4 Т-клеток и, таким образом, является проявлением анергии Th1 и Th2. Увеличение у данной категории больных продукции IL-10, возможно, отражает накопление регуляторных Т-клеток с супрессорной активностью (Tri). В свою очередь, у больных с сохранной пролиферативной активностью наблюдается усиление продукции TNFa, GM-CSF, IL-4, IL-5, IL-13 и IL-10, что сопровождается смещением цитокинового баланса в сторону Th2. Поскольку дисбаланс ^1-/^2-цитокинов сопряжен со снижением количества IFNY+CD8+ Т-клеток и увеличением доли IL-4+CD8+ Т-лимфоцитов, выявленные изменения отражают феномен переключения Ts1^Ts2. (Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 2. С. 45-53.)
Т-клеточная недостаточность при системном воспалительном ответе (SIRS) инфекционного и неинфекционного генеза признается большинством авторов и расценивается в качестве неблагоприятного прогностического фактора [4, 19]. Дефект Т-клеточного иммунитета при сепсисе (инфекционный SIRS) во многом связывают с повышенной гибелью лимфоцитов по механизму апоп- тоза [6, 29]. В качестве другой причины Т-клеточ- ных дисфункций при сепсисе и тяжелой травме (неинфекционный SIRS) рассматривается активная супрессия вследствие смещения цитокиново- го баланса в сторону противовоспалительных медиаторов в популяции моноцитов/макрофагов и переключения Th1^№2 [2, 7, 19, 23, 26]. Недавними исследованиями показано, что еще одним механизмом дефекта при тяжелой травме Т-кле- ток может быть пребывание их в состоянии анергии [14]. Аналогичные данные были нами получены при хирургическом сепсисе. В частности, четкие признаки анергии Т-лимфоцитов в виде глубокого угнетения пролиферативной активности Т-клеток, ассоциированного с блоком клеточного цикла и снижением продукции ^-2, были выявлены нами у 40 % больных сепсисом. Причем индукция анергии была сопряжена с накоплением естественных регуляторных клеток с супрессорной активностью (CD4+CD25+ Т-лимфоцитов) и снижением пролиферативного ответа Т-клеток на различные стимулы [1, 5].
Несмотря на определенные успехи в изучении феноменологии Т-клеточных дисфункций при системном воспалительном ответе инфекционного и неинфекционного генеза, данные, характеризующие механизмы их развития, остаются немногочисленными и достаточно разноречивыми, особенно касательно больных сепсисом. Так, например, угнетение пролиферативной активности и снижение продукции Th1-цитокинов в качестве проявлений иммунной недостаточности выявляется не у всех больных и не на все стимулы. Что касается продукции №2-цитокинов, то описываются все возможные варианты, включая неизмененную продукцию, ее усиление или глубокое угнетение. При этом целый ряд вопросов остается открытым. Действительно ли глубокое угнетение пролиферации Т-клеток при их стимуляции через Т-клеточный рецептор связано с анергией Т-кле- ток, и какая из субпопопуляций CD4 Т-клеток подвержена анергии — Th1, Th2 (или и та, и другая); каковы особенности спектра цитокинов, продуцируемых анергичными Т-клетками при хирургическом сепсисе; у какой категории больных имеет место Th1^№2 переключение и в каких субпопуляциях Т-клеток (CD4, CD8 или обеих) это происходит? Остается неисследованным вопрос о возможном сочетании различных механизмов развития Т-клеточных дисфункций и их удельном весе у различных пациентов.
С целью выяснения этих вопросов нами был проведен анализ продукции широкого спектра Th1/Th2-цитокинов (TNFa, IFNy, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, GM-CSF) у больных с хирургическим сепсисом, в том числе в группах пациентов с сохранной и сниженной пролиферативной активностью Т-клеток. Для идентификации Т-клеточных субпопуляций, причастных к изменению цитоки- нового баланса, наряду с анализом продукции ци- токинов, также исследовалось относительное количество лимфоцитов с внутриклеточной экспрессией IFNy, IL-4 или обоих цитокинов в субпопуляциях CD4 и CD8 Т-клеток.
В исследование были включены 24 больных с хирургическим сепсисом (54 % мужчин и 46 % женщин, средний возраст 43,0 ± 3,1 года), находящихся в отделении реанимации и интенсивной терапии. В 62,5 % случаев сепсис был вызван гнойно-воспалительными заболеваниями органов брюшной полости и в 20,8% — нагноительными заболеваниями органов грудной полости. В остальных случаях (16,7%) регистрировался ангиогенный сепсис. Диагностика сепсиса в соответствии с рекомендациями Чикагской согласительной конференции основывалась на выявлении двух и более признаков синдрома системного воспалительного ответа (SIRS) при наличии очага инфекции [9]. Тяжелый сепсис, сопровождающийся развитием синдрома полиорганной недостаточности (СПОН), в структуре обследованных больных составил 54,2 %. Обследование всех пациентов проводилось при получении информированного согласия. Контрольная группа была представлена 35 здоровыми донорами крови, сопоставимыми по полу и возрасту.
Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из периферической крови стандартно в градиенте плотности фиккола-верог- рафина. Клетки в концентрации 0,1 х 106/лунку культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований в среде RPMI-1640 (Sigma, США), дополненной 0,3 мг/мл L-глутамина, 5 мМ HEPES, 100 мкг/мл гентамицина и 10 % инактивированной сыворотки доноров AB(IV) группы. Для стимуляции Т-клеток использовали моноклональные анти^3-антитела IC0-90 (анти^3, «Мед- биоспектр», Москва) в концентрации 1 мкг/мл. Интенсивность пролиферации оценивали радиометрически по включению 3Н-тимидина (1 мкКи/лунку), вносимого за 18 ч до окончания культивирования.
Методом проточной флюориметрии [3, 12] на двулучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-PLex Protein Assay System, Bio-Rad, США) с использованием коммерческих тест-систем и в соответствии с инструкцией фирмы-производителя оценивали продукцию ТЬ|1/ТЬ|2-цитокинов (TNFa, IFNy, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, GM-CSF, определяемый динамический диапазон 2-32000 пкг/мл) в 48-часовых супернатантах МНК в отсутствие (спонтанная продукция) и присутствии анти- CD3-антител (стимулированная продукция).
Определение экспрессии внутриклеточных цитокинов в МНК периферической крови проводили методом трехцветной проточной цитометрии (FACSCaLibur, Becton Dickinson). С целью селективной активации Т-клеток и индукции синтеза цитокинов МНК культивировали в 24-луночных планшетах в течение 4 ч в присутствии форболмиристатацетата (30 нг/мл, ICN) и иономицина (2 мкМ, ICN), а также брефелдина А (10 мкг/мл, ICN, блокатора транспорта протеинов из аппарата Гольджи). Затем клетки инкубировали с моноклональными антителами к поверхностным маркерам (CD4-PerCP, CD8-PerCP, Becton Dickinson). После пермеабилизации клеток c помощью 0,2%-ного раствора Твин-20 их инкубировали с моноклональными анти-^у-анти- телами, конъюгированными с FITC, и анти-К-4-антителами, мечеными фикоэритрином (Becton Dickinson). Образцы анализировали на проточном цитометре с использованием программы CeLLquest. Цитокин-экспрессирующие клетки, отнесенные к лимфоцитарному региону, оценивали по параметрам прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния.
Математическую обработку полученных результатов проводили методами описательной, параметрической и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы «Statistica 5.0». Таблицы содержат информацию в виде средних арифметических величин (М) и стандартных ошибок средних (SE). Сравнение вариационных рядов осуществляли с помощью непараметрического критерия Вилкоксона — Манна — Уитни (U). Корреляционный анализ проводили методом ранговой корреляции по Спирмену.
Продукция Th1/Th2-цитокинов у больных с хирургическим сепсисом
Для оценки особенностей продукции №1/№2-цитокинов был проведен сравнительный анализ содержания TNFa, ^N7 Пі-2, ^-4, Пі-5, Пі-10, Пі-13 и GM-CSF в 48-часовых супернатантах МНК здоровых доноров и больных с хирургическим сепсисом. Согласно данным литературы, продукция №N7 и ^-2 характерна для ^1-клеток, а ^-4, ^-5, ^-10, ^-13 — для ^2-клеток. TNFa и GM-CSF могут продуцироваться как теми, так и другими клетками, однако уровень продукции GM-CSF выше в популяции №1 [13, 27]. В табл. 1 приведены средние значения концентрации цито- кинов, диапазоны минимальных и максимальных величин, а также частота встречаемости больных со сниженным, сохранным и повышенным уровнем анти-CD3-стимулированной продукции ис
следуемых цитокинов (т.е. соответственно ниже, в пределах или выше границ нормативного диапазона здоровых доноров). В группе доноров спонтанная продукция большинства анализируемых цитокинов (за исключением TNFa и №N7) была минимальной и регистрировалась в «следовых» концентрациях. Спонтанная продукция №N7 не превышала 245 пг/мл. В то же время выявлялся относительно высокий уровень спонтанной продукции TNFa. Стимуляция МНК aнти-CD3-антителами сопровождалась существенным усилением продукции цитокинов. При этом наиболее высокий уровень продукции был выявлен для №N7 и TNFa.
По сравнению с донорами у больных сепсисом отмечалось достоверное увеличение спонтанной и индуцированной продукции ^-10. Кроме того, у больных регистрировалась тенденция к возрастанию среднего уровня анти-CD3-стимулирован- ной продукции как Th1/иммуностимуляторных цитокинов (^-2, TNFa и GM-CSF), так и №2-ци- токинов (^-4, ^-5 и ^-13) за счет существенного увеличения случаев выявления максимальных значений продукции исследуемых цитокинов.
Так, при анализе индивидуальных показателей в группе больных сепсисом обращала внимание поляризация уровня цитокинов в области низких либо высоких значений. Например, по уровню ^-2, TNFa и GM-CSF отмечалось либо снижение, либо повышение их продукции. И только у 18,8 % больных показатели ^-2 и TNFa находились в границах диапазона нормативных значений. Относительно №N7 — у 43,7 % больных отмечалось снижение продукции, в остальных случаях — сохранный (50,0 %) или повышенный (6,3 %) уровень. Что касается №2-цитокинов, продукция ^-4 была либо минимальной, либо повышенной (в 56,3 и 43,7 % случаев, соответственно). Уровень ^-5, ^-13 и ^-10 в половине случаев оставался в пределах номы, а в половине — повышен. Эти факты явно свидетельствовали о разнонаправленном характере изменения цитокинов при сепсисе и гетерогенности обследованных пациентов.
Особенности продукции цитокинов у больных с различным уровнем пролиферативного ответа Т-клеток
Важно отметить, что обследованные больные существенно различались по уровню пролиферативной активности Т-клеток. Учитывая этот факт, выявленная разнородность показателей цитокинов могла отражать различное функциональное состояние Т-лимфоцитов у больных со сниженной и сохранной пролиферативной активностью Т-клеток. Поэтому на следующем этапе анализ продукции цитокинов был проведен отдельно в подгруппах пациентов с сохранной и сниженной пролиферацией Т-клеток, которых мы условно обозначили как «реактивных» и «анергичных» больных, соответственно. Критерием отнесения в группу «анергичных» больных слу
жило более чем двукратное снижение пролиферации в культурах анти-CD3-стимулирвоанных МНК больных по сравнению со средним нормативным уровнем здоровых доноров (34730 ± 1950 имп./мин, n = 50). Таким образом, индивидуальные значения aнти-CD3-индуцированного пролиферативного ответа в группе «анергичных» пациентов варьировали в диапазоне 830-16636 имп./мин, составляя в среднем 13008 ± 1821 имп./мин (n= 11), в подгруппе «реактивных» больных — от 23599 до 70401 имп./мин (40125 ± 3883 имп./мин, n = 13).
Из данных табл. 2 видно, что у «анергичных» больных стимулированная продукция IL-2, IFNy, TNFa, GM-CSF и IL-4 была значимо снижена, в то время как уровень IL-10 был повышен почти в 2 раза. Угнетение продукции IL-2 на фоне пролиферативной ареактивности является классическим признаком Т-клеточной анергии [33]. Поэтому выявленное сочетанное снижение пролиферации и продукции IL-2 означало, что TM-клетки в исследуемой группе больных сепсисом подвержены анергии. В литературе описаны различные модели индукции анергии, при которых пролиферация Т-клеток и продукция IL-2 блокируются, в то время как уровень IL-4 не изменяется, либо усиливается [11, 32]. В наших исследованиях наряду с угнетением продукции IL-2 также выявлялось значимое снижение IL-4. Этот факт явно указывал на то, что анергии у пациентов с дефектом анти-СD3-индуцированного пролиферативного ответа подвержены как Th1, так и Th2.
Важно отметить, что состояние анергии, в зависимости от условий индукции, может иметь различные проявления. Так, в некоторых моделях TM-анергии продукция IFNy не меняется или снижается незначительно [32]. В то же время у обследованных нами больных анергия Th1 проявлялась не только дефектом продукции IL-2, но и угнетением других цитокинов с иммуностимулирующей активностью — IFNy, TNFa и GM-CSF, что, по-видимому, отражает глубину Т-клеточ- ных нарушений при септическом процессе [16]. В противоположность универсальному снижению Th1/иммуностимулирующих цитокинов, изменение №2-цитокинов не было столь однонаправленным. Несмотря на снижение IL-4, стимулированная продукция IL-5 и IL-13 оставалась в пределах нормативного диапазона. На этом фоне несколько неожиданным было увеличение продукции IL-10. Известно, что продуцентами IL-10 среди Т-клеток являются не только Th2, но и оха- растеризованные в последние годы анергичные CD4 Т-клетки с регуляторной активностью, т. н. регуляторные Т-клетки I типа (Tr1) [17, 22]. С этой точки зрения увеличение уровня IL-10 может отражать активность Tri-клеток, опосредующих свое действие через продукцию IL-10, и не быть связано непосредственно с функционированием №2-клеток.
Действительно, проведен- Таблица 2 ный корреляционный анализ между уровнями IL-10 и №2-цитокинами (IL-5 и IL-13) не выявил значимой взаимосвязи между анализируемыми параметрами (r = 0,32; p = 0,48 и r = 0,29; p = 0,53, соответственно).
Таким образом, у больных сепсисом дефект анти-CD3-индуцирован- ного пролиферативного ответа Т-клеток ассоциирован со снижением как №1/иммуностимулятор- ных цитокинов, так и №2-продуцируемого IL-4. При этом индукция анергии сопряжена с увеличением уровня IL-10, что, по-видимому, отражает накопление регуляторных Т-клеток с супрессорной активностью.
В группе больных с сохранным уровнем анти- CD3-индуцированного пролиферативного ответа
продукция ТМ/^2-цитокинов имела совершенно иной характер. Так, по сравнению с донорами концентрация TNFa и GM-CSF в стимулированных культурах МНК «реактивных» больных была значимо выше, в то время как умеренное возрастание IL-2 и №N7 было статистически недостоверным. Одновременно отмечалось существенное усиление продукции всех №2-цитокинов (1Ъ-4, IL-5, ^-13 и 1Ъ-10). Значительный прирост №2- цитокинов может быть обусловлен либо стимуляцией ТМ-клеток, способных продуцировать цитокины как первого, так и второго типа, либо активацией обеих популяций Т-хелперных клеток, либо переключением ТМ^1Ъ2. В исследованиях при тяжелой травме А.К. De et а1. показали, что у больных с сохранной пролиферативной реактивностью имеется усиление продукции как
и ^-10, так и ^N7 расцениваемое как активация ТМ и Th2 [14]. С другой стороны, в литературе имеются данные о доминировании №2 при травме [26]. При анализе полученных нами данных обращало на себя внимание то, что увеличение ТЫ- и №2-цитокинов было неравнозначным. Так, если средние значения №N7 у реактивных больных превышали таковые у доноров в 1,8 раза, то уровень продукции ^-4 и ^-13 — в 9 раз, ^-5 — в 14 раз, что указывало на явное смещение баланса в сторону №2-цитокинов.
Чтобы более точно оценить состояние цитоки- нового баланса, были сравнены индексы соотношения некоторых ТМ/^2-цитокинов в исследуемой группе с таковыми у здоровых доноров. По сравнению со здоровыми донорами у пациентов из группы «реактивных» больных отмечалось достоверное снижение индексов ^-2/^-4 (1,6 ± 0,27 vs
± 1,6; ри < 0,05), ^-2/^-5 (0,6 ± 0,16 vs 2,6 ± 1,6; ри < 0,05) и №N7/^-4 (85 ± 23 vs 403 ± 1,6; ри < 0,05), что позволяло предполагать наличие у них ТЫ^^2 переключения. Для сравнения, у «анергичных» пациентов соотношения ^-2/^-4 и ^-2/
IL-5 значимо не изменялись, однако индекс №N7/^-4 был также достоверно снижен (98 ±3 vs 403 ± 1,6; ри < 0,05), что не исключает изменения баланса Т-клеток I и II типа и у больных со сниженной пролиферативной активностью.
Внутриклеточная экспрессия цитокинов CD4 и CD8 Т-лимфоци- тами у больных сепсисом
Следует отметить, что использование культур МНК, стимулированных через Т-клеточный рецептор анти-CD3-антителами, для анализа продукции ТЫ/^2-цитокинов не позволяет в строгом смысле утверждать, что секреция цитокинов в этих условиях опосредована исключительно популяцией T-хелперных клеток. Как известно, сходный спектр цитокинов способны продуцировать и CD8 Т-лимфоциты. При этом, по аналогии с Th1/Th2 CD8, Т-клетки также характеризуются дихотомией, и, в зависимости от профиля продуцируемых цитокинов среди них выделяют ци- тотоксические/супрессорные CD8 Т-клетки I и II типа (Ts1/Ts2) [27, 31]. Чтобы исследовать субпо- пуляционную принадлежность клеток, причастных к дефекту ТЫ/^2-цитокинов у «анергичных» больных и доминированию №2/иммуносуп- рессорных цитокинов в группе «реактивных» пациентов, на следующем этапе было проведено исследование содержания Th0-, Th1- и №2-клеток путем определения CD4, лимфоцитов с внутриклеточной экспрессией IL-4+IFNy IFN7 или IL-4, соответственно. Аналогичным образом (по наличию внутриклеточного IFNy IL-4 или их комбинации) были идентифицированы субпопуляции CD8 Т-клеток, включающие Ts1, Ts2 или их предшественники (Ts0).
Как видно из данных табл. 3, у здоровых доноров приблизительно четвертая часть CD4 Т-кле- ток и половина CD8 Т-клеток экспрессировала внутриклеточный IFN7, в то время как количество IL-4-позитивных клеток в популяции CD4- и CD8-лимфоцитов составило всего 3 и 2 %, соответственно. Таким образом, количество Т-клеток с внутриклеточной экспрессией IFN7 существенно преобладало над численностью Т-лимфоцитов, экспрессирующих внутриклеточный IL-4, что полностью согласуется с данными об уровне спонтанной продукции соответствующих цитокинов в культуре in vitro (см. табл. 1). Причем преобладание IFNY-позитивных клеток над IL-4-содержа- щими лимфоцитами в популяции CD8-цитоток- сических/супрессорных клеток было более выражено, чем в популяции CD4 T-хелперных клеток (соотношение Ts1/Ts2 и Th1/Th2 составляло ±11 и 8,5 ± 0,98, соответственно).
В группе «анергичных» больных регистрировалось одновременное снижение как IFNy-, так и IL-4-содержащих СD4 Т-клеток. В совокупности с полученными данными о снижении продукции IFNy и IL-4 этот факт однозначно свидетельствовал о том, что у больных с дефектом пролиферативного ответа Т-лимфоцитов на анти-CD3-сти- муляцию анергии подвержены обе субпопуляции Т-хелперных клеток (Th1 и Th2). Характерно, что соотношение Th1/Th2 в этой группе больных не только не снижалось, а наоборот, возрастало за счет более выраженного дефицита Th2. Таким образом, подверженные анергии Т-клетки не имели признаков смещения баланса в сторону Th2.
Изменения в популяции CD8+ Т-клеток имели несколько иной характер. Снижение IFNy-позитивных клеток было сопряжено с увеличением IL-4-содержащих лимфоцитов и выраженным уменьшением соотношения Ts1/Ts2-клеток, что указывало на Ts1^Ts2 переключение. Возможно, этим феноменом объясняется и выявленное у «анергичных» больных снижение уровня продукции и индекса соотношения IFNy/IL-4.
В группе «реактивных» больных относительное содержание IFNy- и IL-4-содержащих CD4 Т-кле- ток и их соотношение оставалось сохранным. В то же время в популяции CD8 Т-клеток наблюдалось достоверное снижение соотношения Ts1/Ts2 за счет уменьшения IFNy+ и увеличения IL-4+CD8 Т-клеток. Количество Ts0 при этом значимо не менялось. В совокупности с данными о повышенной продукции IL-4, IL-5, IL-13 и IL-10 полученные результаты свидетельствуют о преобладании активности Ts2-клеток в подгруппе «реактивных» больных сепсисом.
Таким образом, у больных с дефектом пролиферативной активности Т-клеток снижение продукции IL-2, IFNy и IL-4 обусловлено анергией Th1 и Th2, в то время как усиление продукции №2/иммуносупрессорных цитокинов у больных с сохранной пролиферацией — Ts1^Ts2 переключением.
Нарушение функций Т-клеток у больных сепсисом в виде снижения продукции IL-2 впервые было описано в 1984 г. J. Wood [38]. Впоследствии дефект продукции IL-2 и пролиферативной активности Т-клеток при системном воспалительном ответе инфекционного и неинфекционного ге- неза был выявлен многими авторами, однако, как отмечалось, не у всех больных и не на все активирующие стимулы [6, 28]. Неоднозначно интерпретировались и механизмы угнетения функциональной активности Т-клеток. Так, рядом авторов было продемонстрировано, что при тяжелой травме и сепсисе наблюдается снижение уровня Th1- и увеличение №2-цитокинов, причем нормализация цитокинового баланса у больных сепсисом ассоциируется с благоприятным прогнозом [19, 23, 26, 39]. Данные изменения интерпретируются как результат Th1^Th2 переключения. В то же время J. Muret et al. выявили у больных сепсисом одновременное снижение КонА-стимули- рованной продукции IL-2, IL-5 и IL-10 и расценили это как состояние анергии Th1 и Th2 [28]. Аналогичное заключение было сделано при исследовании больных с тяжелой травмой. Дефект пролиферативного ответа Т-клеток у этой категории больных также ассоциировался с подавлением продукции IL-2 и IL-4, что позволило авторам сделать предположение об анергии Т-клеток в качестве ведущей причины Т-клеточных нарушений [14]. Состояние анергии Т-клеток было также выявлено C.D. Heidecke et al. у больных с абдоминальным сепсисом, однако снижение продукции TM-цитокинов было изолированным и не сопровождалось изменением уровня №2-цитокинов [18]. Важно отметить, что в подавляющем большинстве этих работ удельный вклад CD4 и CD8 Т-клеток в нарушение цитокинового баланса зачастую оставался не изученным. Изменение профиля цитокинов традиционно связывалось исключительно с Th1/Th2-клетками, хотя хорошо известно, что СD8 Т-лимфоциты также включают оп- позитные по спектру цитокинов субпопуляции (Ts1/Ts2) и могут существенно влиять на баланс цитокинов.
В настоящей работе мы впервые провели одновременное исследование продукции ТМ/^2-ци- токинов (TNFa, IFNy, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, GM-CSF) и относительного содержания Th1/Th2- и Ts1/Ts2-клеток у больных с хирургическим сепсисом, в том числе в подгруппах пациентов со сниженным и сохранным уровнем анти-CD3-индуци- рованного пролиферативного ответа Т-клеток. Полученные данные позволили сделать ряд важных заключений и частично объяснить имеющиеся в литературе противоречия по поводу механизмов Т-клеточных дисфункций у больных сепсисом. В частности, нами установлено, что выраженные изменения продукции Th1- и №2-цитокинов имеются у всех больных с хирургическим сепсисом. Однако у больных со сниженным и сохранным уровнем пролиферации Т-клеток эти изменения носят принципиально различный характер.
Больные со сниженным анти-CD3-индуциро- ванным пролиферативным ответом характеризуются низким уровнем продукции ТЫ/иммуно- стимуляторных цитокинов (IL-2, IFNy, TNFa и GM-CSF) и №2-ассоциированного IL-4, что свидетельствует об анергии Т-клеток, продуцирующих цитокины I и II типа. Ранее нами было показано, что угнетение пролиферации Т-клеток у больных сепсисом сопряжено со снижением продукции IL-2, не коррелирует с повышенным апоп-
тозом и ассоциировано с блоком клеточного цикла, что позволило предположить важную роль анергии в развитии Т-клеточного дефекта при сепсисе [5, 6]. Кроме того, выявление блока клеточного цикла именно в популяции CD4, но не CD8 Т- клеток указывало на то, что анергии при сепсисе подвержены преимущественно СD4 Т-лимфоциты [5]. Поэтому выявленное снижение уровня ^-2, ^N7 и ^-4 мы расценили как анергию №1 и №2. Прямым подтверждением тому послужили результаты исследования количества ^-4- и ^^-экспрес- сирующих клеток, согласно которым у больных исследуемой группы отмечалось одновременные снижение относительного содержания CD4 Т-клеток, экспрессирующих как ^-4, так и №N7.
Развитие анергии при сепсисе представляется теоретически вполне обоснованным. Неполноценность костимуляторного сигнала как причина анергии может быть обусловлено, например, многократной рестимуляцией клеток антигеном или представлением антигена «непрофессиональными» антигенпрезентирующими клетками [32]. Дефект костимуляторных молекул на моноцитах/макрофагах может быть индуцирован повышенным апоптозом [1, 20]. Так, апоптотические клетки продуцируют иммуносупрессорные факторы [37] и после фагоцитоза макрофагами способны ингибировать экспрессию и продукцию костимуляторных молекул антигенпрезентиру- ющими клетками [15]. Наконец, состояние анергии может быть индуцировано активацией Т- клеток измененными пептидами, образующимися в результате деградации собственных белков в процессе апоптоза [19, 30]. При этом, в зависимости от особенностей индукции (тип пре- зентирующих клеток, дозы антигена, экспериментальные условия), анергия может развиваться в различных субпопуляциях Т-клеток и характеризоваться фенотипическим и функциональным разнообразием [11, 16, 32, 35].
Особенностью выявленной нами у больных сепсисом анергии является, прежде всего, то, что она носит распространенный характер, т.е. анергии подвержены как №1-, так и №2-клетки. При этом ^^анергия проявляется снижением не только ^-2, но и других цитокинов — №N7, TNFa, GM- CSF, что свидетельствует о большей выраженности Т-клеточного дефекта [16]. Это имеет принципиальное значение, поскольку TNFa и GM-CSF играют важную роль в дифференцировке и созревании дендритных клеток, инициирующих запуск специфического иммунного ответа, а также в поддержании жизнеспособности и функциональной активности нейтрофилов, опосредующих реакции врожденного иммунитета [24, 34].
В то же время анергия №2 проявляется исключительно в снижении ^-4 при сохранной продукции других №2-цитокинов — ^-5 и ^-13. Более того, несмотря на сниженную продукцию ^-4, уровень ^-10 у больных с анергией оказался повышенным. Характерно, что продукция ^-10 не коррелировала с другими №2-цитокинами (^-5, ^-13) и, т. о., вряд ли была связана с функционированием №2 или Ts2. Поэтому данную ситуацию мы расценили как еще одну особенность анергии при сепсисе, связанную с накоплением в циркуляции регуляторных CD4 Т-клеток с супрессорной активностью ^г1). Действительно, индукция анергии, по данным ряда авторов, сопровождается приобретением анергичными клетками супрессорной активности [11, 25, 36]. Причем генерация ^1 не является чисто витральным феноменом. Накопление ^^клеток и их причастность к иммунной недостаточности описаны при ряде хронических инфекций бактериальной и вирусной природы [8, 10, 21]. Не исключено, что именно присутствие ^-10-продуцирующих регуляторных клеток определяет своеобразие №1-анергии, детерминируя снижение не только ^-2, но и других Th1/иммуностимуляторных цитокинов (№N7, TNFa, GM-CSF).
В отличие от CD4 Т-клеток, интерпретация изменений в субпопуляции CD8 Т-лимфоцитов у больных со сниженным пролиферативным ответом остается достаточно проблематичной. Выявленное снижение количества IFNY-позитивных клеток в популяции CD8 лимфоцитов ассоциировалось с увеличением содержания ^-4-экс- перссирующих лимфоцитов и, вследствие этого, со снижением соотношения CD8+IFNY+/ CD8+IL-4+, что указывало на возможность переключения Ts1^Ts2. Учитывая также данные о снижении уровня продукции и индекса соотношения IFNY/IL-4, а также более ранние результаты об отсутствии блока клеточного цикла в популяции CD8 Т-клеток у «анергичных» больных [5], возможность переключения Ts1^Ts2 представляется вполне вероятной. Однако тогда остается не ясным, почему доминирование Ts2 клеток не приводит к усилению продукции ^-4 или ^-5/^-13. Таким образом, вопрос о том, что же происходит в популяции CD8 Т-клеток — Ts1^Ts2 переключение или индукция анергии, остается открытым. Возможно, определенный вклад в изменение функциональной активности Т-клеток, включая и популяцию CD8 Т-лим- фоцитов, вносят регуляторные Т-клетки. Увеличение количества естественных регуляторных Т-клеток с фенотипом CD4+CD25+ у больных с анергией было продемонстрировано нами в предшествующих исследованиях [5]. Из настоящей работы следует, что это, по-видимому, не единственный тип регуляторных Т-клеток с супрессорной активностью, который имеет отношение к патогенезу иммунной недостаточности при сепсисе.
Пациенты с сохранной пролиферацией отличались повышенной продукцией TNFa, GM-CSF и всей группы №2-цитокинов (ГЬ-4, IL-5, ^-13 и IL-10). Причем возрастание продукции цитокинов ассоциировалось со смещением баланса в сторону Th2, о чем свидетельствовало снижение индексов соотношения ТЫ/^2-цитокинов (^-2/^-4, IL-2/IL-5 и №N7/^-4). При этом анализ внутриклеточной экспрессии №N7 и ^-4 показал, что увеличение продукции цитокинов не связано с активацией предшественников ТМ/^2 или Ts1/Ts2, поскольку увеличения Th0 и Ts0 не наблюдалось, а обусловлено Т51^Тб2 переключением.
Таким образом, даже при сохранном пролиферативном ответе Т-клеток у больных с хирургическим сепсисом имеется смещение баланса в сторону Th2/Ts2/иммуносупрессорных цитоки- нов. Невозможно полностью исключить роль в этом CD4 Т-клеток, поскольку отсутствие достоверных изменений в количестве и соотношении №N7- и ^-4-экспрессирующих CD4 Т-клеток еще не означает отсутствия изменений в уровне продукции цитокинов. Однако можно с уверенностью утверждать, что в смещении цитокинового баланса значительную роль играют CD8 Т-клетки. Полученные результаты согласуется с данными S. Zedler [39], который показал, что именно за счет ^-4-продуцирующих CD8 Т-клеток происходит смещение баланса в сторону доминирования ^-4 при ожоговой травме [39].
Какой из выявленных дефектов (ТМ/^2-анер- гия или Т51^Тб2) является более тяжелым нарушением при сепсисе? Согласно полученным нами данным при сепсисе [1, 5] и данным А.К. De et а1. при травме [14], развитие анергии у больных со сниженным пролиферативным ответом Т-клеток ассоциировано с большей тяжестью системного воспалительного ответа, в частности, с развитием СПОН и более высоким уровнем летальности. Проспективные наблюдения в подгруппах «анер- гичных» и «реактивных» больных в настоящем исследовании выявили сходные тенденции. Так, при всех прочих сопоставимых параметрах (возраст, пол, локализация очага инфекции, сроки обследования, качество и объем интенсивной и антибактериальной терапии) частота выявления тяжелого сепсиса/СПОН у «анергичных» больных была выше, чем у «реактивных» пациентов (72,7 vs 38,5 %). Кроме того, уровень 28-суточной летальности в группе «анергичных» больных практически в 2 раза превысил таковой в оппо- зитной подгруппе (27,3 vs 15,4 %).
Авторы выражают признательность Региональному общественному фонду содействия отечественной медицине за поддержку в проведении исследований.
Норкин М.Н., Леплина О.Ю., Тихонова М.А. и др. Роль апоптоза и анергии Т-клеток в патогенезе гнойно-септических заболеваний // Мед. иммунол. —
— Т. 2, № 1. — С. 35-42.
Останин А.А., Леплина О.Ю., Тихонова М.А. и др. Цитокин-опосредованные механизмы развития системной иммуносупрессии у больных с гнойно-хирургической патологией // Цитокины и воспаление. — 2002. — Т. 1, № 1. — С. 38-45.
Останин А.А., Леплина О.Ю., Шевела Е.Я. и др. Оценка цитокинового профиля у больных с тяжелым сепсисом методом проточной флюориметрии (Bio- PLex анализа) // Цитокины и воспаление. — 2004. — Т. 3, № 1. — С. 20-27.
Пинегин Б.В., Андронова Т.М., Юдина Т.И. Иммунодиагностика и иммунотерапия хирургических инфекций // Int. J. ImmunorehabiLitation. — 1998. — № 10. — С. 86-99.
Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Тихонова М.А. и др. Феномен Т-клеточной анергии при хирургическом сепсисе // Мед. иммунол. — 2003. — Т. 5, № 5-6. — С. 529-538.
Черных Е.Р., Норкин М.Н., Леплина О.Ю. и др. Апоптоз и анергия периферических Т-лимфоцитов при гнойно-септической патологии // Мед. имму- нол. — 1999. — Т. 1, № 5. — С. 45-51.
AyaLa A., DeoL Z.K., Lehman D.L. et aL. Polymicrobial sepsis but not Low-dose endotoxin infusion causes decreased spLenocyte IL-2/IFN-g reLease whiLe increasing IL-4/IL-10 production // J. Surg. Res. — 1994. — VoL. 56. — P. 579-585.
BLuestone J.A., Abbas A.K. NaturaL versus adaptive reguLatory T ceLLs // Nat. Rev. ImmunoL. — 2003. — VoL. 3. — P. 253-257.
Bone R.C., BaLk R.A., Cerra F.B. et aL. ACCP/SCCM consensus conference. Definitions for sepsis and organ faiLure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis // Chest. — 1992. — VoL. 101. — P. 1644-1655.
Boussiotis V.A., Tsai E.Y., Yunis E.J. et aL. IL-10-producing T ceLLs suppress immune responses in anergic tubercuLosis patients // J. CLin. Invest. — 2000. — VoL. 105. — P. 1317-1325.
Buer J., Lanoue A., Franzke A. et aL. InterLeukin 10 secretion and impaired effector function of major histocompatibiLity compLex cLass Il-restricted T ceLLs anergized in vivo // J. Exp. Med. — 1998. — VoL. 187. — P. 177-183.
Carson R., VignaLi D. SimuLtaneous quantitation of fifteen cytokines using a muLtipLexed fLow cytometric assay // J. ImmunoL. Meth. — 1999. — VoL. 227. — P. 41-52.
Curfs J.H.A.J., Meis J.F.G.M., Hoogkamp-Korstanje J.A.A. A primer on cytokines: sources, receptors, effects and inducers // CLin. MicrobioL. Rev. — 1997. — VoL. 10, № 4. — P. 742-780.
De A.K., Kodys K.M., Pellegrini J. et al. Induction of global anergy rather than inhibitory Th2 lymphokines mediates post-trauma T-cell immunodepression // Clin. Immunol. — 2000. — Vol. 96. — P. 52-66.
Fadok V.A., Bratton D.L., Rose D.M. et al. A receptor for phosphatidylserine- specific clearance of apoptotic cells // Nature. — 2000. — Vol. 405. — P. 85-90.
Groux H., Bigler M., de Vries J.E., Roncarolo M.G. Interleukin-10 induces a longterm antigen-specific anergic state in human CD4 T cells // J. Exp. Med. —
— Vol. 184. — P. 19-29.
Groux H., O'Garra A., Bigler M. et al. Generation of a novel regulatory CD4 T-cell population, which inhibits antigen-specific T-cell responses // Nature. —
— Vol. 389. — P. 737-742.
Heidecke C.D., Hensler T., Weighardt H. et al. Selective defects of T lymphocyte function in patients with lethal intraabdominal infection // Am. J. Surg. — 1999. — Vol. 178. — P. 288-292.
Hotchkiss R.S., Karl I.E. The pathophysiology and treatment of sepsis // N. Engl. J. Med. — 2003. — Vol. 348, № 2. — P. 138-150.
Hotchkiss R.S., Tinsley K.W., Swanson P.E. Sepsis-induced apoptosis causes progressive profound depletion of B and CD4+ T Lymphocytes in humans // J. Immunol. — 2001. — Vol. 166. — P. 6952-6963.
Iwashiro M., Messer R.J., Peterson K.E. et al. Immunosuppression by CD4 regulatory T cells induced by chronic retroviral infection // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2001. — Vol. 98. — P. 9226-9231.
Jonuleit H., Schmitt E., Schuler G., Knop J., Enk A.H. Induction of interleukin 10-producing, nonproliferating CD4 T cells with regulatory properties by repetitive stimulation with allogeneic immature human dendritic cells // J. Exp. Med. — 2000. — Vol. 192. — P. 1213-1222.
Lederer J.A., Rodrick M.L, Mannick J.A. The effects of injury on the adaptive immune response // Shock. — 1999. — Vol. 11. — P. 153-159.
Lee A., Whyte M.K.B., Haslett C. Inhibition of apoptosis and prolongation of neutrophil functional longevity by inflammatory mediators // J. Leukoc. Biol. — 1993. — Vol. 54. — P. 283-288.
5. Lombardi G., Sidhu S., Batchelor R., Lechler R. Anergic T cells as suppressor cells in vitro // Science. — 1994. — Vol. 264. — P. 1587-1592.
Mack V.E., McCarter M.D., Naama H.A., Calvano S.E., Daly J.M. Dominance of T helper 2 type cytokines after severe injury // Arch. Surg. — 1996. — Vol. 131, № 12. — P. 1303-1308.
Mosmann T.R., Sad S. The expanding universe of T-cell subsets: Th1, Th2 and more // Immunol. Today. — 1996. — Vol. 17, № 3. — P. 138-146.
Muret J., Marie C., Fitting C., Payen D., Cavaillon J-M. Ex vivo T-lymphocyte derived cytokine production in SIRS patients is influenced by experimental procedures // Shock — 2000. — Vol. 13. — P. 169-174.
Oberholzer A., Oberholzer C., Moldawer L.L. Sepsis syndromes: understanding the role of innate and acquired immunity // Shock. — 2001. — Vol. 16. — P. 83-96.
Pellegrini J.D., De A.K., Kodys K. et al. Relationships between T lymphocyte ap- optosis and anergy following trauma // J. Surg. Res. — 2000. — Vol. 88. — P. 200-206.
31.Salgame P., Abrams J.S., Clayberger C. et al. Differing lymphokine profiles of functional subsets of human CD4 and CD8 T cell clones // Science. — 1991. — Vol. 254. — P. 279-282.
Schwartz R.H. Models of T cell anergy: is there a common molecular mechanism? // J. Exp. Med. — 1996. — Vol. 184. — P. 1-8.
Schwartz R.H. T cell anergy // Annu. Rev. Immunol. — 2003. — Vol. 21. — P. 305-334.
5. Taams L.S., van Eden W., Wauben M.H.M. Dose-dependent induction of distinct anergic phenotypes: multiple levels of T-cell anergy // J. Immunol. — 1999. — Vol. 162. — P. 1974-1981.
Taams L.S., Wauben M.H.M. Anergic T cells as active regulators of the immune response // Hum. Immunol. — 2000. — Vol. 61. — P. 633-639.
Voll R.E., Herrmann M., Roth E.A. et al. Immunosuppressive effects of apop- totic cells // Nature. — 1997. — Vol. 390. — P. 350-351.
Wood J., Rodrick M., O'Mahony J. et al. Inadequate interleukin 2 production. A fundamental immunological deficiency in patients with major burns // Ann. Surg. — 1984. — Vol. 200. — P. 311-320.
Zedler S., Bone R.C., Baue A.E., Donnersmarck G.H., Faist E. T-cell reactivity and its predictive role in immunosupression after burns // Crit. Care Med. — 1999. — Vol. 27, № 1. — P. 66-73.