20 июля 2005 г. исполняется 65 лет со дня рождения Владимира Александровича Козлова — крупного ученого-иммунолога, академика РАМН, доктора медицинских наук, профессора, вице-президента Российского научного общества иммунологов, заведующего кафедрой клинической иммунологии Новосибирской ГМА, директора НИИ клинической иммунологии СО РАМН, заведующего лабораторией регуляции иммунопоэза этого же института.
В.А. Козлов — признанный специалист в области клинической и экспериментальной иммунологии, внесший большой вклад в развитие отечественной медицины. Одно из основных направлений научных исследований, разрабатываемых В.А. Козловым и возглавляемым им коллективом, — изучение роли медиаторов в регуляции пролиферации, дифференцировки и функциональной активности стволовых клеток и клеток иммунной системы. Его труды посвящены фундаментальным аспектам функционирования цитокиновой сети и путям их использования в клинике.
Козловым В.А. с сотрудниками впервые были описаны иммунорегуляторные функции эритро- идных клеток и их способность к продукции гемо- и иммунорегуляторных цитокинов, что было зарегистрировано в 1990 г. как открытие Госкомитетом по делам открытий и изобретений СССР.
Под руководством В.А. Козлова начаты фундаментальные исследования функционирования цитокиновой сети, альтернативного сплайсинга и аллельного полиморфизма генов цитокинов, регуляции экспрессии генов цитокинов, изучение роли продуктов макрофагов в регуляции иммунных реакций и стволовых клеток, получение трансгенных по генам цитокинов растений. Большое внимание В.А. Козлов уделяет вопросам практического использования иммуноактивных молекул. Под его руководством выделены и охарактеризованы регуляторные факторы из мышечной ткани и эрит- рокариоцитов. Разработан иммуноактивный препарат, не имеющий аналогов в России и за рубежом, Hbb (цепь гемоглобина), со свойствами модулятора эритро- и иммунопоэза. Обоснована возможность применения нового ингибитора пролиферации стволовых кроветворных клеток ^ЬЬ и входящего в его состав пептида PN951) в качестве химиопротекторного средства.
Большое внимание В.А. Козлов уделяет вопросам терапевтического применения цитокинов, их использования в клеточных технологиях. Его блестящие организаторские способности проявились в организации Межрегионального центра трансплантации костного мозга, Центра цитокинотерапии.
В.А. Козлов — инициатор проведения в России тематических конференций по различным аспектам цитокинологии и создания Российского цито- кинового общества, председателем которого он избран в 2001 г.
Под его руководством создана школа высококвалифицированных специалистов в области иммунологии, цитокинологии, физиологии и патологии макрофагов и полипотентных стволовых кроветворных клеток, нейроэндокринной регуляции функций иммунной системы, иммунофармакологии. Его ученики работают на кафедрах многих ВУЗов России, заведуют лабораториями, отделениями клиник, возглавляют филиалы института.
В.А. Козлов — автор 850 научных работ, 9 авторских свидетельств, 12 патентов, диплома на открытие. Под его руководством защищено 40 кандидатских и 15 докторских диссертаций. Он член редакционных советов целого ряда научных журналов по иммунологии и смежным дисциплинам.
Трудолюбивый, целеустремленный, широко образованный ученый, Владимир Александрович награжден знаком «Отличник здравоохранения», медалью «Ветеран труда», премией РАМН им. Н.И. Пирогова, он — академик-учредитель РАЕН, Заслуженный деятель науки РФ, Кавалер золотого почетного знака «Общественное признание» 2001 г.
Коллектив НИИ клинической иммунологии СО РАМН, ученики и друзья, редколлегия журнала «Цитокины и воспаление» поздравляют Владимира Александровича с 65-летием, желают ему здоровья, исполнения творческих планов, успехов на поприще науки и здравоохранения.
Российская академия медицинских наук, Сибирское отделение ГНЦ ГосНИИ особо чистых биопрепаратов МЗ РФ
А.П. Богоявленский, В.Э. Березин Институт микробиологии и вирусологии, Алматы, Казахстан
В современном птицеводстве для экономии площадей и снижения себестоимости продукта используется содержание большого количества птиц на малых площадях, что является причиной возникновения различных инфекционных заболеваний, в том числе и эймериозов. Одним из перспективных методов борьбы с паразитарными инфекциями является создание новых высокоэффективных вакцинных препаратов на основе белковых антигенов.
Целью данных исследований является изучение стимуляции цитокинов при экспериментальной вакцинации мышей иммуностимулирующими комплексами, содержащими нативные антигены Eimeria tenella и сапонинсодержащий экстракт Glycyrrhiza glabra. Надмолекулярные иммуностимулирующие комплексы были сформированы экстенсивным диализом с использованием неионного детергента МЭСК.
В ходе экспериментов было установлено, что изучаемый препарат обладает способностью к индукции синтеза высокого уровня INFy, IL-2, характерных для Т-хелперов I типа, и IL-4, IL-10, характерных для Т-хелперов II типа. Так, после однократной иммунизации мышей исследуемыми белковыми препаратами уровень INFy и IL-2 составил 18,57 пкг/мл, уровень IL-4 — 17,96 пкг/мл, уровень IL-10 — 31,25 пкг/мл. Уровень основных классов цитокинов был сопоставим с таковым после иммунизации мышей антигенами Eimeria tenella с коммерческими препаратами Квил А или полным адъювантом Фрейнда.
Таким образом, сапонинсодержащий экстракт Glycyrrhiza glabra может быть использован при конструировании новых вакцинных препаратов, вызывающих формирование не только гуморального, но и клеточного иммунного ответа.
Возможный механизм модулирующего влияния препарата Глутоксим® на регуляторное действие цитокинов
Глутоксим® — лекарственный препарат, синтетический аналог природного гексапептида — окисленного глутатиона (GSSG), обладает иммунокорригирующей, гемостимулирующей активностью, повышает резистентность клеток к действию токсинов, понижает риск развития побочных эффектов химиотерапии. В клинической практике Глутоксим® используется в комплексной терапии хронических инфекционных и пролиферативно-воспалительных заболеваний различного генеза для профилактики и лечения проявлений неспецифического синдрома болезни, токсического воздействия лекарственных препаратов. Следует отметить, что механизмы фармакологической активности препарата Глутоксим®, схожие с действием ряда цитокинов, остаются до конца не выясненными. В этой связи на клетках А431 изучалось действие препарата Глутоксим® на активность рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), контролируемые им транскрипционные факторы (т. ф.) STAT1 и STAT3, Ras-зависимые сигналпередающие МАР-киназы — ERK1,2, в сравнении с GSSG и эпидермальным фактором роста (EGF). EGFR — рецепторная тирозинкиназа, проявляющая сродство к EGF и активность при образовании димера за счет дисульфидных связей. Глутоксим® и GSSG стимулировали EGFR при концентрациях 0,002—0,02 ммоль/л, что соответствует содержанию GSSG в межклеточной жидкости. Активность EGFR появлялась через 5 мин после внесения веществ, отсутствовала на 10 и 30 мин, была максимальна на 60 мин, не определялась в последующем. Действие препарата Глутоксим® и GSSG на клетки сопровождалось активацией МАР-киназы — ERK1,2, т. ф. STAT3, но не STAT1. Активация цитоплазматических белков имела волнообразный характер, определялась на 1,
8, 16 и 24 ч инкубации. Глутоксим® по активирующему влиянию на исследуемые молекулы превышал GSSG, но значительно уступал EGF. Глутоксим®, как и GSSG, при введении с EGF повышал сродство EGFR к EGF. Эффект всех исследуемых соединений на EGFR, контролируемые им сигналпередающие белки — STAT3, МАР-киназ — ERK1,2, отменялся селективным ингибитором EGFR— AG1478. Результаты исследований указывают на способность препарата Глу- токсим® восстанавливать функционально активную конформацию рецепторов цитокинов и, соответственно, чувствительность клеток к воздействию цитокинов, что позволяет объяснить ряд фармакологических эффектов препарата действием эндогенных цитокинов. По-видимому, Глутоксим® участвует в окислении тиоловых групп рецепторов цитоки- нов, что необходимо для их перехода в функционально активную конформацию.
Гуморальный фактор регуляции активности TNFa при раке и туберкулезе легких
А.И. Аутеншлюс, А.Н. Шкунов, Н.Б. Кузнецова,
Д.В. Морозов, Ю.В. Седова ГУ НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, г. Новосибирск
По современным представлениям, цитокины, выполняя функции медиаторов, регулируют интенсивность и продолжительность иммунного ответа при многих заболеваниях у человека, включая процессы онкологической и воспалительной природы. На активность цитокинов оказывают влияние антитела (АТ) к ним, присутствующие в крови пациентов, получавших цитокиновую терапию. Однако АТ к цитокинам могут продуцироваться и вне зависимости от цитокиновой терапии.
Целью исследования явилось изучение уровней ТОТа и АТ к нему у больных раком легких (РЛ) и туберкулезом лег
ких (ТЛ). Материалом исследования служила сыворотка крови больных и здоровых лиц. Содержание цитокина и уровни АТ определяли с помощью иммуноферментного анализа.
Установлено, что при РЛ отмечается достоверное повышение содержание TNFa и уровней АТ к нему по сравнению с донорами. Выявлена зависимость между вариантом диф- ференцировки опухоли, степенью ее злокачественности и уровнями TNFa и АТ в сыворотке крови больных.
При ТЛ, по мере нарастания активности процесса, одновременно происходило повышение содержания цитокина и АТ к нему, достигая наибольших величин при высокой степени активности заболевания. При сочетании высокого содержания TNFa с наиболее низким уровнем АТ, специфический процесс имел наиболее агрессивное течение, сопровождаясь выраженной деструкцией легочной ткани. Следовательно, характер течения ТЛ в значительной степени зависит от сочетания тех или иных уровней TNFa и АТ к нему.
Таким образом, для правильной интерпретации клинического значения содержания TNFa в сыворотке крови для больных с онкологическими заболеваниями необходимо учитывать вариант дифференцировки опухоли и степень ее злокачественности, у больных ТЛ — форму туберкулезного процесса, степень ее активности. Во всех случаях необходимо учитывать уровни АТ к TNFa, во многом обусловливающие характер течения заболевания.
Иммунологические и поведенческие расстройства при хронической морфиновой зависимости: механизмы и возможные подходы к коррекции
Е.В. Маркова1, В.В. Абрамов1, М.В. Старостина2,
Н. Михневич2, В.А. Козлов1
ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН;
Институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, г. Новосибирск
В рамках проблемы нейроиммунных взаимоотношений нами изучались афферентная организация взаимодействия иммунной и нервной систем, механизмы ответа мозга на активацию иммунной системы, участие иммуногенных факторов в регуляции процессов высшей нервной деятельности, как в норме, так и при различных патологических состояниях.
Одним из таких патологических состояний является хроническая морфиновая зависимость. Опиоиды взаимодействуют с опиатными рецепторами головного мозга, блокируют передачу болевых импульсов к коре, обладают антисеротони- новой активностью и опосредованным через центральные механизмы влиянием на иммунитет. У двух групп мышей (CBAЧC57Bl/6)F1 с различным уровнем исследовательского поведения была сформирована хроническая морфиновая зависимость. При одинаковом уровне потребления наркотика мы наблюдали разнонаправленные изменения поведения животных. Характер этих изменений определялся исходным поведенческим статусом. В период опийного абстинентного синдрома у всех животных, наряду с классическими поведенческими проявлениями (корчи, птоз, жидкий стул и др.), регистрировались изменения в параметрах иммунного статуса: снижение антителообразования в селезенке (более 50 % по сравнению с контрольной группой), снижение спонтанной пролиферативной активности сплено- цитов, наиболее выраженное у животных с исходно низким уровнем исследовательского поведения. Наблюдалось также достоверное снижение уровня экспрессии гена ^-1р в селезенке у всех животных и в головном мозге мышей с исходно низким уровнем исследовательского поведения. Трансплантация иммунокомпетентных клеток здоровых доноров, соответствующих по исходному поведенческому статусу животным в состоянии абстиненции, сопровождалась нормализацией у последних поведенческих реакций, нормализацией антителообразования (абсолютное и относительное число АОК не отличалось от таковых в контрольной группе животных). При этом у всех исследуемых животных показано восстановление уровня экспрессии гена ^-1р как в селезенке, так и в головном мозге.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что исходный поведенческий статус животных определяет характер поведенческих и иммунологических сдвигов при хронической наркотической зависимости; трансплантация иммуно- компетентных клеток способна нивелировать проявления абстинентного синдрома.
Влияние дипептида y-D-Glu-L-Trp («Бестим») на цитокин-продуцирующую активность нейтрофильных гранулоцитов
Е.В. Фомичева2, Г.Г. Рожкова2 1 Институт иммунофизиологии, Москва;
2 Российский центр функциональной хирургической гастроэнтерологии, г. Краснодар
Активированные нейтрофильные гранулоциты (НГ) способны синтезировать и секретировать различные цитокины и хемокины. Принимая во внимание тот факт, что НГ обычно первыми инфильтрируют воспалительные ткани и количественно преобладают среди других лейкоцитов при различных хронических воспалительных заболеваниях, их вклад в цитокиновый фон может оказаться существенным. Изучение цитокин-продуцирующей функции НГ и возможности влияния на этот процесс различных биологически активных веществ, в частности пептидов, является весьма актуальной задачей. Целью настоящей работы явилось изучение влияния дипептида y-D-Glu-L-Trp — «Бестим» (БС) на продукцию цитокинов IL-1 р, IL-1Ra, TNFa, IL-8 и IL-4 in vitro ней- трофилами при их дополнительной стимуляции липополисаха- ридом (ЛПС, E. coli:055:B5, «DIFCO»). НГ выделяли из периферической крови здоровых лиц (n = 19). Клетки (106 кл/мл) культивировали в полной культуральной среде RPMI 1640 («DIFCO»), в 5% СО2, при 37оС 24 ч с физиологическим раствором (контроль) — I, ЛПС (1 мкг/мл) — II, БС (0,1 мкг/мл) — III и ЛПС (за 30 мин)+БС — IV. Концентрацию цитокинов в супернатанте определяли методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем (ООО «Ци- токин», Санкт-Петербург). Добавление в инкубационную среду только БС не оказывало существенного влияния на уровень нейтрофильной секреции IL-1 р, но имелись тенденции к повышению секреции других провоспалительных цитоки- нов — TNFa, IL-8, а также IL-1Ra. Почти на 30 % снизился уровень IL-4. В комбинации с ЛПС БС имел выраженный стимулирующий эффект на секрецию нейтрофилами провоспа- лительных цитокинов IL-1 р, TNFa, IL-8, а также IL-1Ra. Добавление БС после 30 мин инкубации НГ с ЛПС в 3 раза увеличило продукцию IL-1 р по сравнению с уровнем спонтанной секреции (p < 0,01), уровень IL-8, TNFa и IL-1Ra повысился в 1,8 ,1,4 и 1,4 раза, соответственно. В то же время продукция IL-4 НГ снизилась в 1,6 раз. Это стимулирующее воздействие было свойственно именно БС, так как ЛПС в данной концентрации оказывал минимальное влияние на секрецию цитокинов НГ. Таким образом, БС имеет выраженное стимулирующее влияние на секрецию провоспалительных цитокинов, угнетая при этом продукцию IL-4. Возможно, этот эффект БС является одним из механизмов его стимулирующего действия на функции НГ, выявленные нами ранее.
Сравнительный анализ использования линейного и градиентного полиакриламидных гелей на примере исследования электрофоретической чистоты альфа-фетопротеина
Филиал Института иммунологии и физиологии УрО РАН, Екатеринбург;
ЗАО «Институт новых медицинских технологий», г. Краснокамск;
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь
Актуальность данного исследования определяется бурным развитием молекулярной биологии, требующим разработки и постоянного совершенствования эффективных
аналитических методов исследования и, прежде всего — скоростных и высокочувствительных. Последнее обстоятельство играет особенно важную роль, поскольку изучаемыми объектами, как правило, являются биологические активные вещества, присутствующие в живых организмах в чрезвычайно малых количествах (гормоны). Выделение веществ в чистом виде, как известно, сопряжено с определенными трудностями, поэтому исследование чистоты белковых препаратов является достаточно актуальной проблемой. Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) занимает центральное место среди методов контроля чистоты белковых препаратов как фактически единственный высокочувствительный метод визуализации их гетерогенности.
На примере исследования электрофоретической чистоты белка альфа-фетопротеина (АФП) нами был проведен сравнительный анализ использования двух типов ПААГ: линейного 12 % и градиентного 7,5—5 %.
В результате проведенных исследований установлено, что для определения электрофоретической чистоты АФП использование линейного 12 % геля не показательно, поскольку не происходит четкого разделения близких белковых зон. Напротив, использование ПААГ с градиентом концентрации
— 15 % имеет целый ряд преимуществ. Во-первых, отдельные молекулы при использовании градиентного ПААГ разделяются при электрофорезе не только по их общему заряду, но и по величине (молекулярный вес) и форме (третичная структура). Во-вторых, в ходе электрофореза происходит непрерывное сужение белковых зон, поскольку белки в передней части каждой зоны постоянно оказываются в области чуть более мелких пор, чем идущие в задней части этой же зоны. Кроме этого, данный процесс противодействует диффузии белков из зоны.
Таким образом, для оценки электрофоретической чистоты АФП использование градиентного ПААГ наиболее показательно по сравнению с линейным гелем.
И.М. Федорова, И.В. Капустин, З.К. Рамазанова, С.И. Котелева ГУ МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, Москва
Целью данного исследования стала попытка связать переваривающую активность фагоцитов с уровнем продукции ими TNFa в процессе фагоцитоза.
Нейтрофильные гранулоциты (НГ) выделяли из крови на желатине. Примесь мононуклеаров удаляли центрифугированием в градиенте плотности Ficoll-Paque (р = 1,077) фирмы Amersham Biosciences. Ресуспендированные в сыворотке здоровых доноров НГ соединяли с взвесью суточной культуры Staph. aureus (штамм 209) так, что на 1 НГ приходилось 20—30 бактерий. Через 30 мин, 1, 2, 3 и 24 ч инкубации при 37оС лейкоцитарно-микробную взвесь осаждали центрифугированием. Супернатанты отбирали для определения концентрации TNFa, а из осадков делали мазки для оценки поглотительной и переваривающей активности НГ. Концентрацию TNFa определяли методом ИФА с использованием тест-систем фирмы «Век- тор-Бест» (Россия). Контролем служили образцы сыворотки, инкубированные со стафилококком 2 ч при 37оС.
Через 60 мин после инкубации НГ со стафилококком TNFa в супернатантах не выявлялся, хотя поглощение бактерий фагоцитами происходило (ФЧб0 было максимальным по сравнению с ФЧ30, ФЧ120 и ФЧ180). Через 2 ч концентрация TNFa в супернатантах составляла 30—70 пкг/мл, через 3 ч она возрастала до 100, а к 24 ч снижалась до 10—20 пкг/мл. Уровень продукции TNFa, индуцированной стафилококком во взвеси НГ, в пересчете на 105 лейкоцитов был примерно в 100 раз ниже, чем индуцированной ФГА в цельной крови тех же людей.
У лиц с нормальными показателями переваривающей активности фагоцитов (индекс завершенности фагоцитоза был равен 2,0 ± 0,2) продукция TNFa, индуцированная стафилококком, была достоверно ниже, чем при сниженной переваривающей активности (ИЗФ = 1,2 ± 0,2).
Новосибирск: Наука, 2004, 324 с. ISBN 5-02-032447-7. Обложка твердая. Тираж 500 экз.
В сборнике представлены обзоры, посвященные теоретическим и клиническим аспектам функционирования системы цитокинов, написанные ведущими специалистами НИИ клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН с использованием собственных и литературных данных. Рассматриваются молекулярные основы функционирования системы цитокинов: аллельный полиморфизм, альтернативный сплайсинг и стабильность мРНК цитокинов, регуляторные функции цитокинов в гомеостазе; приводятся функциональные характеристики некоторых цитокинов. Ряд работ посвящен роли цитокинов в патогенезе и терапии некоторых заболеваний, а также основным современным методам исследования системы цитокинов. Книга будет интересна и полезна специалистам в области биологии и медицины, врачам, а также студентам профильных вузов.
НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск;
Сибирский Государственный медицинский университет, г. Томск;
НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, г. Новосибирск
Развитие вирусного гепатита С и его хроническое течение характеризуется широким спектром клинических проявлений, которые, в конечном счете, у части пациентов завершаются развитием декомпенсированного цирроза или гепатоцеллюлярной карциномы. Однако скорость развития этих тяжелых осложнений у отдельных индивидов колеблется в широких пределах и зависит не только от эффективности проводимой терапии, но и от активности клеточных реакций противовирусного иммунитета, компенсаторных и регенераторных функций печени и т. п. Учитывая тот факт, что функции иммунной системы находятся под генетическим контролем, правомерен вопрос об им- муногенетических аспектах темпов прогрессирования вирусного гепатита.
При ответе на инфицирование вирусом гепатита С происходит изменение продукции ряда цитокинов. Исходя из этого, целью данного исследования стало изучение полиморфизма G-308A TNFA, T-330G IL2, С-590Т IL4 и C-592A IL10 среди HCV-инфицированных пациентов в сравнении со здоровыми лицами.
Нами был обследован 81 пациент с диагнозом хронический вирусный гепатит С. В качестве контроля была обследована репрезентативная по полу и возрасту группа из 48 практически здоровых лиц. Обе группы состояли из представителей европеоидного населения Сибири.
На основании анализа частоты встречаемости аллельных вариантов генов цитокинов в ряде полиморфных точек, мы получили возможность с 95%-ной вероятностью прогнозировать состояние предрасположенности к развитию вирусного гепатита С при условии инфицирования данного индивида; и еще с большей вероятностью, превышающей 99 %, мы можем прогнозировать состояние резистентности человека с данным генотипом к развитию болезни.
Необходимо, однако, отметить, что эти результаты носят предварительный, хотя и, безусловно, обнадеживающий характер. Их использование потребует дополнительной проверки на больших группах обследованных лиц в условиях слепого опыта. Однако увеличение числа используемых для анализа точек аллельного полиморфизма про- моторных участков генов цитокинов может позволить решить эту проблему путем расчета серии алгоритмов для различных комбинаций генотипов у большего числа пациентов. Последнее, вероятно, может быть достигнуто путем использования биочиповых технологий, позволяющих одновременно исследовать практически неограниченное количество полиморфных участков различных генов.
Функциональная активность лимфоцитов и продукция цитокинов у больных с предопухолевой и опухолевой патологией молочной железы в зависимости от аллельного полиморфизма гена хемокинового рецептора CCR5 Н.Н. Бабышкина, П.А. Гервас, Е.В. Денисов, М.Н. Стахеева,
Е.М. Слонимская, Н.В. Чердынцева НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН, г. Томск
Целью исследования стала оценка взаимосвязи полиморфных вариантов гена CCR5 c функциональной активностью лимфоцитов и уровнем продукции цитокинов у больных раком молочной железы (РМЖ), фиброаденомой (ФА) и фиброзно-кистозной мастопатией (ФКМ).
В исследование были включены 142 пациентки с РМЖ, 75 больных с ФА и 32 пациентки с ФКМ. Генотипирова- ние аллелей гена CCR5 проводили методом ПЦР-ампли- фикации фрагмента размером 276 п.н., несущего потенциальную делецию в 32 п.н., с использованием фланкирующих праймеров (Н. Юдин и соавт., 1998). Контрольную группу составили 53 женщины без патологии молочной железы.
Оценка функциональной активности иммунокомпетен- тных клеток показала, что у больных РМЖ, несущих де- леционный аллель CCR5, и пациенток с ФКМ, имеющих дикий тип рецептора, наблюдается более высокая спонтанная пролиферация лимфоцитов, чем у здоровых лиц. Пролиферативная активность лимфоцитов в ответ на стимуляцию митогеном — ФГА была значимо снижена у больных ФКМ, несущих мутантный CCR5, а также у пациенток РМЖ с диким CCR5 по сравнению с группой контроля. Во всех изучаемых подгруппах, независимо от рассматриваемого генотипа, выявлена высокая продукция ^-1 мо- нонуклеарными клетками крови. Уровень базальной продукции TNFa также значимо превосходил контрольные значения у больных всех подгрупп, за исключением пациенток с ФА, несущих дикий CCR5. Следует отметить, что у больных РМЖ и ФКМ с делеционным вариантом гена CCR5 ЛПС-стимулированные мононуклеары не усиливали продукцию TNFa, в отличие от пациенток этих нозологий с диким типом CCR5. Для больных всех подгрупп, имеющих CCR5del32 генотип, показано снижение уровня базальной секреции ^-4 мононуклеарами крови относительно контрольных значений, однако статистическая значимость этих изменений получена лишь для больных с мастопатией ф < 0,05). У больных РМЖ, ФА, ФКМ с мутантным CCR5 выявлены высокие уровни секреции ^-2, однако статистического подтверждения они не нашли ^ > 0,05).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют том, что наличие делеционного аллеля гена хемокинового рецептора CCR5del32 у больных РМЖ, ФА и ФКМ ассоциировано с существенными нарушениями функциональной активности иммунокомпетентных клеток, а также продукции иммунорегуляторных цитокинов.
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН;
Областная клиническая больница г. Кемерово; 3 Кемеровский научный центр СО РАН
Рассеянный склероз (РС) является аутоиммунным заболеванием, в патогенезе которого лежит хроническая аутоиммунная реакция, направленная против белков ЦНС (олигодендроцитар- ный гликопротеин и миелин-ассоциированный гликопротеин). Считается, что РС может возникнуть при сочетании у человека ряда неблагоприятных факторов, внешних и внутренних, т.е. РС является комплексным заболеванием. Генетическая предрасположенность к РС, вероятно, связана с сочетанием нескольких генов, обуславливающих нарушение в системе иммунорегуляции, что в последствие проявляется аутоиммунной реакцией с антигенами центральной нервной системы. Так как аутоиммунные процессы модулируются сетью провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, то их продукция имеет особое значение при различных воспалительных заболеваниях.
Полиморфизм нуклеотидных последовательностей 5’- и 3’- регуляторных элементов или интронов генов может оказывать существенное влияние на транскрипцию путем изменения структуры сайтов связывания транскрипционных факторов в промоторах генов или структур энхансеров в интронах. Позитивная и негативная регуляция экспрессии цитокинов и их рецепторов проявляется в иммунном ответе в период заболевания и, соответственно, некоторые индивидуальные отличия в уровне их экспрессии приводят к разным проявлениям патологии. Целью данной работы было изучение ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов IL-1 р, IL-1Ra и IL-6 с предрасположенностью к заболеванию РС.
В ходе работы были обследованы две группы пациентов: больные РС (n = 80) и контрольная группа — здоровые доноры (n = 112). В основную группу были отобраны пациенты с достоверным диагнозом РС, согласно критериям Позера, находившиеся на лечении в Кемеровской областной клинической больнице. Средний возраст больных составил 35,3 года, средняя длительность заболевания 8,9 лет. Все больные имели ремитирующий характер заболевания на момент исследования, либо в начале заболевания. Контрольная группа подбиралась в соответствии с возрастным и половым составом группы РС. Исследование полиморфного локуса VNTR, инт- рон 2, гена IL1RA проводили с помощью ПЦР с праймерами, фланкирующими полиморфный регион в пределах 2-го интро- на, в котором находится вариабельное количество тандемных повторов размером 86 н.п. Точечные нуклеотидные замены С+3953Т в 5-м экзоне IL1B и C-174G в промоторном регионе IL-6 исследовали с помощью ПЦР-ПДРФ анализа. Для обнаружения ассоциации между частотами встречаемости аллелей применялись стандартные статистические методы. Попарное сравнение контрольных и опытных частот проводилось с помощью точного критерия Фишера и %2-критерия для долей с включением поправки Йейтса на непрерывность.
В результате данной работы выявлены статистически значимые различия частоты встречаемости аллеля Т (%2, p = 0,03) и генотипа С/С (%2, p = 0,025) полиморфного локуса С+3953Т в 5-м экзоне гена IL1B, а так же аллеля 5R VNTR-локуса во 2-м интроне гена IL1RA (F, p = 0,03) между группами больных РС и здоровых жителей. Статистически значимых различий частот аллелей или генотипов полиморфномого локуса C-174G в промоторном районе гена IL6 между исследуемыми группами не выявлено.
Ревматоидный артрит (РА) — заболевание аутоиммунной природы, в патогенезе которого важную роль играет баланс
провоспалительных и воспалительных цитокинов. Все большее внимание в настоящее время уделяется изучению полиморфизма генов цитокинов, участвующих в патогенезе РА. Установлено, что наличие того или иного аллельного варианта гена цитокина приводит к изменению уровня продукции соответствующего цитокина, что может влиять на характер течения заболевания и чувствительность к терапии. В нашем исследовании изучены аллельные варианты генов TNFA(-308) и lL1(+3953) у 150 пациентов с РА и 104 здоровых доноров европеоидной популяции. Клиническое обследование, определение уровня сывороточных цитокинов, показателей иммунного статуса, уровня продукции цитоки- нов было проведено у 30 больных РА, до назначения базисной противовоспалительной терапии и других видов терапии, влияющей на продукцию цитокинов. Затем проведено сравнение групп с различными аллельными вариантами соответствующих генов по иммунологическим, клиническим и лабораторным показателям, а также сравнение частоты аллелей в популяциях здоровых и больных РА. В результате выявлена положительная ассоциация генотипа А/G в промоторном участке гена TNFA(-308) с развитием РА среди лиц популяции европеоидов (р = 0,02). У больных РА до назначения патогенетической терапии генотип A/G (TNFA -308) ассоциируется с повышенным содержанием клеток с фенотипом CD16+ (р = 0,02) и отсутствием в системном кровотоке IL-2 и IL-7 (р < 0,05). Наличие аллеля Т (1L1B +3953) ассоциируется с низким содержанием про- лактина в сыворотке крови (р = 0,03) и с редким развитием анемии у больных РА (р = 0,03). При анализе уровня продукции мононуклеарными клетками периферической крови больных РА в зависимости от наличия того или иного генотипа исследуемых генов соответствующих цитокинов достоверных отличий не получено. Таким образом, исследованные в нашей работе аллельные варианты генов ци- токинов ассоциированы с некоторыми клиническими и иммунологическими параметрами больных РА. В частности, наличие аллеля Т в точке (+3953) гена 1L1B является про- тективным фактором в развитии анемии и потенциально связано с более низкой воспалительной активностью заболевания, т.к. ассоциировано с низким уровнем пролактина, положительно коррелирующего с показателями активности РА. У носителей генотипа A/G гена TNFA(-308) в нашей популяции повышен риск развития РА.
ГНЦ ГосНИИ особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург
Из клинических наблюдений известно, что реализация воспалительного ответа у разных лиц может существенно различаться по интенсивности и продолжительности: у одного больного протекать более остро и сопровождаться высокими значениями лихорадки, у другого иметь затяжной характер и протекать хронически, не сопровождаясь выраженным повышением температуры тела. Причем общие особенности воспалительного ответа у конкретного больного могут проявляться постоянно в течение жизни, независимо от типа воспалительного заболевания. Исследования последних лет показали, что персональные различия в продукции цитоки- нов могут определяться аллельным полиморфизмом регуляторных районов их генов. Эти данные позволяют предположить, что, в зависимости от индивидуального ансамбля высоко- или низкопродуцируюших вариантов генов цитокинов, характер воспалительного ответа может значительно варьироваться между индивидуумами с полярными сочетаниями: «провоспалительный генотип» — гены провоспалительных цитокинов являются высокопродуцирующими, а противовоспалительных цитокинов — низкопродуцирующими; или наоборот — «противовоспалительный генотип». По всей видимости, реализация воспалительного ответа у лиц с полярными генотипами может существенно различаться по интенсивности и продолжительности. Это может отражаться на общем характере протекания воспалительного ответа, предрасположенности к ряду заболеваний и чувствительности к терапевтическому воздействию, что подтверждают полученные нами данные. При генотипировании пациентов (методы ПЦР и ПДРФ-ПЦР) с хроническим гнойным риносинуситом, хроническим гепатитом С и туберкулезом легких, проходивших лечение рекомбинантным IL-1 ? (Беталейкин, БЛ) было выявлено, что для носителей гомозиготного по мутантному вы- сокопродуцирующему аллелю гена IL1RA*2(VNTR) лечение этим препаратом высокоэффективно, а для больных с гомозиготным по высокопродуцирующему аллелю геном IL1B(+3953) — низкоэффективно и может сопровождться выраженным побочным эффектом — лихорадкой. IL-1 является основным медиатором в механизме развития лихорадки. Донорам и пациентам, прошедшим генотипирование, был предложен список вопросов о характере лихорадки при перенесенных вирусных и бактериальных инфекциях (n = 156). Анализ этих данных показал, что лица с гомозиготным геном IL1B(+3953), болеют с очень высокой лихорадкой, до 39—41 °С. Напротив, носители гомозиготного гена IL1RA*2, как правило, болеют без выраженного повышения температуры: максимальные значения этого показателя достигают только субфебрильных значений (37,5—37,8 °С). Лица с полярным генотипом IL1RA*2, зачастую, имеют в анамнезе несколько хронически протекающих воспалительных патологий. Таким образом, выявление аллелей IL1B(+3953) и IL1RA*2 позволяет со значительной долей вероятности предсказать персональный характер протекания воспалительного ответа, и может учитываться при обосновании и выборе методов терапии. Полученные нами результаты позволяют предположить, что для носителей провоспалитель- ных генотипов дополнительное введение рекомбинантных аналогов провоспалительных цитокинов или проведение терапии, блокирующей выработку противовоспалительный цитокинов низкорезультативно, и может сопровождаться выраженными побочными реакциями, а, в ряде случаев, и усиливать патологический процесс, тогда как у пациентов с противовоспалительным генотипом дополнительное, компенсаторное введение провоспалительных цитокинов или медикаментозное блокирование продукции противовоспалительных цитокинов высокоэффективно. Генотипирование цитокинов по признакам полиморфизма может стать одним из критериев назначения тех или иных лекарственных средств, а также дать возможность индивидуально корректировать реакции воспаления.
И.В. Хорошая, И.О. Колчанова Курский государственный медицинский университет; Кафедра медицинской биологии, генетики и экологии, г. Курск
Изучение генетического полиморфизма цитокинов необходимо для понимания механизмов регуляции эритропоэза. Одним из наиболее важных цитокинов, участвующих в этом процессе, является IL-1?. Целью настоящего исследования явилось изучение влияния функционально значимого полиморфизма —511С/Т в промоторной области гена IL1B на фенотипическую вариабельность количественного содержания мембранных белков эритроцитов. Материалом послужили образцы венозной крови 209 практически здоровых добровольцев. Генотипирование проводили методом ПЦР-ПДРФ. Мембранные белки фракционировали одномерным электрофорезом в полиакриламидном геле по U.K. Laemmli. Расчет средних эффектов аллелей гена IL1B (ас и ат) и доли фенотипических дисперсий (G) белков, объясненных вариацией по изучаемому ло- кусу, проводили по алгоритму C.F. Sing и J. Davignon. Распределение частот генотипов (СС = 0,545, СТ = 0,364, ТТ = 0,091) находилось в равновесии Харди-Вайнберга (X2 = 1,45; d.f. = 1; р > 0,05). Однофакторный дисперсионный анализ позволил установить статистически достоверную (р < 0,05) ассоциацию полиморфизма —511С/Т гена IL1B с количественной вариабельностью таких белков, как ?-спек- трин (F = 2,96), белок 4.1 (F = 2,57) и дематин (F = 2,54). Доли фенотипических дисперсий белков, объясненные генотипическими различиями по полиморфизму —511С/Т, были следующими: для ?-спектрина G = 25 % (Ga = 12 %, Gd = 13 %, где Ga-аддитивная, а Gd-доминантная компоненты дисперсии), для белка 4.1 G = 38 % (Ga = 2 %, Gd = 36 %) и для дематина G = 12 % (Ga = 0 %, Gd = 12 %). Степени отклонения количественного содержания цитоскелетных белков от их среднепопуляционных значений, обусловленные но- сительством аллелей гена IL1B, были следующими: для ?-спектрина ас = —2,61и ат = 1,82, для белка 4.1 ас = 0,64 и ат = —1,61, для дематина ас = —0,10 и ат = —0,15. Полученные результаты свидетельствуют о выраженном плейот- ропном и разнонаправленном эффекте промоторного полиморфизма гена IL1B на экспрессию генов цитоскелетных белков эритроцитов. Установленные особенности модифицирующего эффекта IL-1 ? могут быть связаны не только с его непосредственным влиянием на продукцию мембранных белков, но и с его способностью индуцировать синтез других гемопоэтических цитокинов, обладающих специфическими активирующими или ингибирующими свойствами на различных этапах эритрогенеза.
К.В. Данилко, Т.В. Викторова Институт биохимии и генетики УНЦ РАН, г. Уфа
Болезни органов дыхания — наиболее частая патология в детском возрасте. Хронические бронхолегочные заболевания (ХБЛЗ) — хронический воспалительный неспецифический процесс, имеющий в своей основе необратимые морфологические изменения и сопровождающийся рецидивами воспаления в бронхах и легочной ткани. Цитокины представляют собой группу полипептидных медиаторов, участвующих в формировании и регуляции защитных реакций организма. Дисбаланс противо- и провоспалительных цитокинов в пользу последних может приводить к нарушению адекватного течения воспалительного ответа с развитием хронического воспаления. Известно, что интенсивность синтеза цитокинов может быть генетически обусловлена.
С целью выявления ассоциации полиморфных вариантов в генах про- и противовоспалительных цитокинов с развитием ХБЛЗ у детей был проведен анализ полиморфных вариантов генов провоспалительных: (-308G/A) TNFA, (+252A/G) LTA, (-511T/C, +3953T/C) IL1B, (-251A/T) IL8, (-174G/C) IL6 и противовоспалительных цитокинов: (VNTR, интрон 2) IL1RN, (-592A/C, -627C/A) IL10, (-509C/T) TGFB, у детей с ХБЛЗ — хронический бронхит и рецидивирующая пневмония (n = 180) и у здоровых индивидов (n = 230), проживающих в г. Уфе (Республика Башкортостан).
В результате показано достоверное увеличение частоты гап- лотипа G-G полиморфных локусов (-308G/A) и (+252A/G) сцепленных генов TNFA и LTA в группе детей больных ХБЛЗ (19,82 % против 14,67 % в контроле; %2 = 6,19, р = 0,013). В группе больных с ХБЛЗ статистически достоверно увеличена частота гаплотипа T-C-4 полиморфных локусов (-511T/C), (+3953T/C) гена IL1B и VNTR 2-го интрона гена IL1RN (X2 = 9,49, р = 0,003). Анализ распределения частот гапло- типов полиморфных локусов (-592A/C, -627C/A) промоторной области гена IL10 показал, что в группе больных ХБЛЗ статистически достоверно увеличена частота гапло- типа С/А (21,7 %, соответственно), тогда как в группе здоровых индивидов данный гаплотип встречался с частотой 14,4 % (X2 = 6,29, р = 0,012). Статистически достоверных различий в распределении частот генотипов и аллелей полиморфных локусов (-251A/T), (-174G/C) и (-509C^T) генов IL8, IL6 и TGFB между группами не выявлено.
Установлено, что полиморфные варианты генов TNFA, LTA, IL1RN и IL10 являются важной составной частью генетической структуры подверженности хронической патологии органов дыхания в детском возрасте.
И.Г. Ракова, М.И. Воевода, В.И. Коненков ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск
Тромбоз лежит в основе наиболее острых проявлений атеросклероза коронарных артерий, в том числе инфаркта миокарда. Значимыми механизмами в патогенезе образования тромба являются генетические механизмы. Многочисленные исследования частично подтвердили гипотезу о том, что вариации в генетике воспалительного ответа могут увеличивать риск заболевания. Согласно литературным данным, были найдены достоверные различия в промоторной области гена TGFB1 в японской и европеоидной популяции.
Нами было исследовано распределение полиморфизма в промоторных областях генов цитокинов -308A TNFA, T-330G IL2, С-590Т IL4, T-439C IL5 и C-592A IL10 и полиморфных сайтов рецептора IL-4 — Q576R и Ile50Val и IL-5 G-80A, среди больных острым инфарктом миокарда в сравнении с контрольной группой. Из тех больных, которые направлялись в НИИ Терапии с помощью опроса, медицинской документации и данных обследования, выделили 2 группы: 120 пациентов с диагнозом острый инфаркт миокарда в анамнезе и 150 страдающие коронарным атеросклерозом, но не перенесшие инфаркт миокарда. Обе группы состояли из представителей европеоидного населения Сибири. Распределение генотипов -308A TNFA, T-330G IL2, С-590Т IL4, T-439C IL5 и C-592A IL10 и рецепторов IL-4 — Q576R и Ile50Val и IL-5RA G-80A в контрольной группе показывает схожую картину с европеоидами других стран. Анализ распределения полиморфизма генов цитокинов IL5, IL4RA, IL4RA и IL5RA выявил достоверные различия в частотах распределения аллельных вариантов генов цитокинов.
Хотя результаты носят предварительный характер, полученные нами данные предоставляют доказательства того, что полиморфизмы генов, регулирующие воспалительный ответ, могут повышать риск развития заболевания. С развитием современных технологий, таких как биологические микрочипы, которые позволяют одновременно и быстро оценить множество полиморфных сайтов в различных генах, дальнейшее исследование функциональной значимости однонуклеотидных замен позволит получать более точную совокупность параметров в исследовании риска инфаркта миокарда.
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН,
Центральная клиническая больница СО РАН, г. Новосибирск
Исследование полиморфных локусов при изучении заболеваний, имеющих мультифакториальную природу, в том числе болезней сердечно-сосудистой системы, является актуальным направлением геномной медицины. В настоящее время изучается достаточно большое количество полиморфных вариантов генов, участвующих в формировании патологии сердечно-сосудистой системы, в частности генов цито- кинов. В соответствии с современными концепциями, ведущую роль в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) играет иммуновоспалительная активакция, опосредованная провоспалительными цитокинами. Так, например, IL-1 ? и TNF? приводят к уменьшению максимальной скорости сокращения кардиомиоцитов, причем их действие синэргично. Недавно открытый провоспалительный цитокин — IL-18, является ключевым медиатором в регуляции реакций гуморального и клеточного иммунитета и в значительной степени определяет продукцию других биологически-активных молекул, в том числе и провоспалительных. Промотор гена ^18 содержит два полиморфных локуса, которые входят в сайты связывания транскрипционных факторов. Замена О на С в положении —137 приводит к нарушению взаимодействия H4TF-1 с промотором и, соответственно, к изменению уровня транскрипции гена и экспрессии конечного белкового продукта ^-18. Ранее была показана ассоциация данного полиморфного локуса с такими заболеваниями, как диабет и саркоидоз.
Целью нашего исследования являлось изучение ассоциации аллельных вариантов гена ^18 (О-137С) с инфарктом миокарда. Для этого было обследовано 93 больных с острым инфарктом миокарда (ОИМ) и 112 человек без ССЗ. Диагноз ОИМ верифицировался на основании данных клиники, наличии превышения тропонина I, динамики ЭКГ, данных ЭХОКГ. Контрольная группа подбиралась в соответствии с возрастным и половым составом группы ОИМ. Исследование полиморфного локуса О-137С проводили с помощью аллель-спе- цифичной ПЦР.
Результаты данной работы представлены в таблице. Частоты встречаемости аллелей практически не различались между исследованными выборками, в то время как частота встречаемости генотипа СС была практически в 2 раза выше в группе ОИМ, чем в контроле (%2, р = 0,02). Следовательно, генотип СС может являться фактором риска развития острого инфаркта миокарда. Таким образом, в нашем исследовании установлено, что генотип СС полиморфного локуса О-137С гена ^18 ассоциирован с ОИМ, что может указывать на патогенетическую роль этого провоспалительного медиатора при данной патологии.
А.Н. Силков, С.В. Сенников, В.А. Козлов ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск
^-452 известен как естественный антагонист ^-4, образующийся при альтернативном сплайсинге. Для исследования экспрессии ^-4 и ^-452 в мононуклеарных клетках (МНК) человека разработан метод количественной оценки уровня их мРНК и оценена кинетика накопления специфических транскриптов.
МНК выделяли из цельной периферической крови здоровых индивидов стандартными методами. Клетки культивировали в среде ЯРМ1-1640, содержащей 10 % ЭТС и 2 мМ L-глутамина, при 37 °С и 5 % СО2. Митогенную стимуляцию проводили конканавалином А в дозе 5 мкг/мл, концентрация клеток составляла 106 кл/мл. Часть свежевыделенных клеток, а также клетки, культивированные 1, 3, 6, 18, 24 и 48 ч использовали для выделения РНК стандартным методом фенольной экстракции, синтез кДНК проводился в реакции обратной транскрипции. Уровень мРНК ^-4 и ^-452 оценивался методом конкурентной ПЦР с синтетическими внутренними стандартами.
Установлено, что исходный уровень мРНК ^-4 превышает уровень мРНК ^-452 во всех исследованных образцах не- стимулированных клеток, количественное соотношение мРНК ^-452/^-4 при этом составляло от 15 до 30 %. При культи
вировании клеток в присутствии митогена уровень ^-452 значительно возрастал уже в течение 1 ч и начинал заметно снижаться через 6 ч культивирования. Уровень мРНК ^-4, напротив, достаточно плавно возрастал, достигая своего максимального уровня в течение первых 6 ч культивирования, а затем столь же плавно понижался. Количественное соотношение мРНК ^-452/^-4 имело максимальное значение (60 — 75 %) в клетках, культивированных 1 ч в присутствии митогена, далее наблюдалось практически линейное понижение соотношения, и исходный уровень восстанавливался в 24—48-часовых культурах.
Таким образом, кинетика изменения уровня для мРНК ^-4 и ^-452 различается, что свидетельствует об изменении активности альтернативного сплайсинга пре-мРНК гена ^-4 в клетках человека при активации.
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск
Альтернативный сплайсинг — способ процессинга пре- мРНК, посредством которого может увеличиваться разнообразие белковых продуктов, кодируемых одним геном. Сплайсинг пре-мРНК по-разному происходит в различных тканях, может изменяться при патологических состояниях. ^-4 и ^-6, являясь полифункциональными белками, участвующими в иммунорегуляции, дифференцировке клеток и развитии тканей в эмбриогенезе, широко используют этот механизм. В результате образуются белки с отличающимися свойствами. Так, ген ^4 у человека экспрессируется в виде двух форм мРНК: полноразмерной формы (^-4мРНК) и изоформы со сплайсированным вторым экзоном (^-452мРНК). Белок, образующийся вследствие трансляции ^-452мРНК, является естественным антагонистом ^-4. Данные о спектре изоформ ^-6 у человека на сегодня весьма противоречивы. Показано существование ^-652мРНК, ^-652,4мРНК и ^-654мРНК, содержащих делеции 2-го; 2-го и 4-го; 4-го эк- зонов, соответственно.
Целью данного исследования стало изучение особенности экспрессии изоформ мРНК ^-4 и ^-6 у человека в период эмбриогенеза. На препаратах мРНК, выделенных из тканей эмбрионов человека со сроком гестации 24 недели, в реакции ОТ-ПЦР с использованием специфических праймеров исследовали наличие всех возможных форм мРНК ^-4 и ^-6. При электрофоретическом разделении продуктов амплификации детектировали присутствие двух форм матричных РНК ^-4 в тканях эмбриона человека. Причем, в некоторых тканях мы наблюдали экспрессию только ^-4мРНК (печень, легкое, ребро, скелетная мускулатура) или только ^-452мРНК (тимус, мозг). В ткани щитовидной железы, поджелудочной железы и яичника обнаруживались обе изоформы в сравнимых количествах. В тканях эмбрионов нам удалось обнаружить тот же спектр матричных РНК ^-6, что и в предварительных экспериментах с митоген-стимулированными мононуклеарами периферической крови человека. При этом в ткани поджелудочной железы и мозга обнаруживался только полноразмерный вариант, ^-6мРНК; в яичнике и коже — только альтернативные варианты: ^-652мРНК и ^-652,4мРНК. В тканях щитовидной железы, надпочечника, миокарда и почки выявлялись ^-6мРНК и ^-652мРНК, причем интенсивность сигнала была приблизительно одинаковая для обеих изоформ.
Таким образом, нами показано, что в эмбриональных тканях человека наблюдаются качественные и количественные различия в экспрессии изоформ мРНК ^-4 и ^-6.
