Институт иммунологии АН Республики Узбекистан, г. Ташкент, Узбекистан
Ранее было установлено, что препарат Лакто Флор обладает свойством стимулировать пролиферацию эндогенных и экзогенных кроветворных стволовых клеток.
В работе приводятся результаты по изучению эффекта Лакто Флора, выделенного из молозива коров, на дифферен- цировку кроветворных стволовых клеток. Для этого мышей линии BALB/c облучали тотально в сублетальной (6,5 Гр) дозе и вводили Лакто Флор в дозе 15 и 1,5 мг/кг однократно внутрибрюшинно. На 9-е сутки мышей умерщвляли и подсчитывали число макроколоний на поверхности селезенки. Затем проводили гистологические исследования серийных срезов селезенки, в которых подсчитывали число эритроид- ных, гранулоцитарных, мегакариоцитарных, недифференцированных и смешанных микроколоний.
Установлено, что при введении Лакто Флора в дозе 15 мг/кг число макроколоний на поверхности селезенки увеличивается в
раза, а при дозе 1,5 мг/кг — в 2,5 раза, по сравнению с контролем. Гистологические исследования показали, что под воздействием препарата Лакто Флор происходит повышение общего количества микроколоний в селезенке облученных мышей, причем стимуляция выявлена во всех ростках кроветворения: эритроидном, гранулоцитарном и ме- гакариоцитарном. Наибольшая стимуляция выявлена в красном ростке кроветворения. Полученные результаты свидетельствуют о способности препарата Лакто Флор влиять на пролиферацию и дифференцировку кроветворных стволовых клеток.
Г.К. Закирьянова, Р.Т. Тлеулиева Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина, г. Алматы, Казахстан
В настоящее время феномен натуральной супрессии (NS), изучаемый уже более 35 лет, связывают с популяцией ранних гемопоэтических предшественников миелоидного ряда, несущих маркер CD34. Нами были проведены комплексные исследования NS-клеток костного мозга мышей, касающиеся их субпопуляционного фенотипического разнообразия, специфической чувствительности к различным индукторам, продукции супрессорных цитокинов и их влияния на Th, CTL и NK-клетки.
Используя разделение на градиентах перкола, мы получили три фракции NS-клеток (NS1 = 1,08, NS2 = 1,09 и NS3 = 1,095 г/мл), испытание влияния которых на продукцию антипролиферативных факторов в условиях in vitro показало, что индукцию супрессорной активности NS1 вызывают IL-2, IFNy, гистамин и альфа-фетопротеин (АФП),
NS2 — IL-3, GM-CSF и АФП, а NS3 — только IL-2, GM-CSF и АФП. NS-фракции также отличались по спектру секре- тируемых факторов. Вся супрессорная активность NS1, индуцируемая IL-2, гистамином или АФП, зависела исключительно от TGFp. Супрессорная активность NS2, индуцированная IL-3, полностью была связана с TGFp, а индуцированная АФП — лишь частично с TGFp, а также с IL-10, IL-6 и другими неидентифицированными цитокинами. NS3 в ответ на IL-2 секретировала, помимо TGFp, IL-6 и IL-13. Супрессорная активность NS3, стимулированной АФП, не была связана с TGFp, а зависела от IL-6, IL-10, IL-13 или другого неидентифицированного фактора. Все цитокины синтезировались de novo, о чем свидетельствовало появление соответствующих мРНК. Отмечался также высокий уровень продукции NO всеми фракциями NS-клеток в ответ на любые индукторы. Все три фракции NS, активированные АФП, секретировали факторы, существенно снижающие активность как NK-клеток, так и CTL. Воздействие NS-факторов на СБ4+-спленоциты приводило к резкому изменению соотношения IFNy- и IL-4-синтези- рующих клеток с Th1-типа (1,69) в сторону Th2-типа (NS1 = 0,21; NS2 = 0,27; NS3 = 0,29). Фенотипический анализ показал, что ни одна из NS-фракций не имеет маркеров зрелых Т-, В-клеток и моноцитов (CD3, CD19, CD11b), а также маркеров коммитированных предшественников (CD10, IL-7R, TER-119), но на 73,5 % состоит из CD34+-клеток. NS1 и NS3 имеют маркер CD117(c-kit), а небольшая часть NS1-клеток несет маркер CD133. NS2-по- пуляция несет маркеры CD123 и CD135. Полученные данные позволяют отнести изучаемые NS-клетки костного мозга к ранним мультипотентным гемопоэтическим стволовым клеткам.
I. Bilko3, S.V. Vasilovska O.J. Doroshenko1, O.O. Barash1,
A. Votjakova1, N.M. Bilko2
Center of tissue and cell therapy «Embriotechk»;
Kiev-Mohyla Academy, Kiev, Ukraine; 3 1 University of Hull, Great Britain
The differentiation of hematopoietic stem cells from embryonal stem cells (ES) in vitro may hold the key to the problem of generating of highly proliferative hematopoietic stem cells.
The development of human ES cells derived from aborted material of 4—5 weeks old embryos was studied by «hangigng drop» cultural technique. Embryonal cells were maintained in the feeder layer-free culture system by supplementing media with of the polypeptide cytokines leukemia inhibitory factor, otherwise known as differentiation inhibiting activity (DIA). Embryioid bodies (EB) have been generated over 14 days and morphology of EB-derived cells during further differentiation in to various lineages including hematopoietic, cardiomiocyt- ic and neuronal differentiation. Cloning efficiency of hemato
poietic cell after induction of embryonal bodies’ differentiation was investigated and granulomonocytic and erythroid progenitors were found. These properties allow using ES cells as model system for investigation of early embryonic development and for the generation of somatic precursors or differentiated cells as a potent source of stem cells for transplantation. This approach represents indirect strategy for deriving hematopoietic stem cells and other progenitors from ES cells.
Перспективы применения мембранотропных анти-ВИЧ-соединений, сорбированных на стволовых клетках человека для лечения ВИЧ-инфекции
У.А. Боярских, Д.В. Субботин, И.В. Тимофеев
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»,
ЗАО «Вектор-Бест», наукоград Кольцово, Новосибирская обл.
В настоящее время в практической медицине все большее применение находят аутологичные стволовые клетки человека (СКЧ). Мы полагаем, что СКЧ могут занять важное место и в лечении некоторых тяжелых инфекционных заболеваний, в частности ВИЧ/СПИД. Использование СКЧ для терапии ВИЧ-инфекции, с одной стороны, позволит решить вопрос эффективной репарации популяций «выбитых» вирусом иммунодефицита клеток, как лимфоцитарного, так и мак- рофагального ряда, а с другой, решить насущную проблему защиты вновь образующихся лимфоидных клеток от вирусной инфекции.
Ввиду того, что мультипотентные СКЧ находятся в стадии покоя (отсутствие деления) и на ранних этапах своей дифференцировки экспрессируют на поверхности клеток ограниченный круг рецепторов (CD34, Fc-рецептор CD32, в1-интегриновый рецептор, ламинин связывающий, CD46, хемокиновые рецепторы — CXCR2 и CXCR4 и т. д.), можно предположить, что до момента начала дифференциров- ки нативных СКЧ по определенному гистотипу имеется весьма незначительная вероятность их инфицирования ВИЧ-1/2. Поскольку только на последующих стадиях диф- ференцировки СКЧ по гематологическому направлению на их поверхностной мембране появляются специфичные для ВИЧ-1/2 рецепторы лимфоидных клеток — СD4, а также еще один важный для инфекции — хемокиновый CCR5 рецептор.
С нашей точки зрения, разработанные в ГНЦ ВБ «Вектор» оригинальные анти-ВИЧ-эффективные мембрано- тропные препараты могут быть сорбированы на поверхностной мембране СКЧ за счет нековалентного взаимодействия отрицательно заряженной клеточной мембраны клетки с гидрофобными фармакофорами (адамантан/нор- борнан). На начальных сроках инкубации с мембранотроп- ными препаратами в таких СКЧ индуцируется синтез ин- терферонов I типа, в частности IFNa и IFNв, которые также обеспечивают неспецифическую противовирусную резистентность этих клеток. Специально обработанные и подготовленные таким образом СКЧ становятся полностью резистентны к ВИЧ-1/2-инфекции и могут быть введены эн- долимфально либо непосредственно в основной очаг поражения. За счет предварительной обработки анти-ВИЧ-со- единениями они могут обеспечить как ингибирование репродукции вируса в дифференцирующихся СКЧ, так и препятствие его репродукции в близко расположенных чувствительных клетках и тканях инфицированного макроорганизма.
Таким образом, нагруженные анти-ВИЧ-препаратом клетки могут быть не только сами устойчивы к поражению опасным вирусом, но и могут доставить в очаг инфекции эффективный противовирусный препарат. При этом важно учитывать, что для мультипотентных СКЧ потенциально возможен путь их непосредственной дифферен- цировки в лимфобластоидные клетки, способные к делению и восстановлению имеющихся дефектов в Т-клеточ- ной субпопуляции.
Увеличение колониеобразующей активности стволовых элементов кишечника под действием кондиционных сред, полученных от мышиных эмбриональных клеток печени
Известно, что помимо способности к самоподдержанию, пролиферации, дифференцировке и миграции, стволовые клетки человека (СК) обладают другой важной характеристикой — свойством «пластичности». Изучение этой способности СК взрослого организма является интересным направлением, имеющем практическое значение при использовании в клеточной заместительной терапии. Учитывая филогенетическое значение кишечника в процессе гемопоэза, а также и тот факт, что СК кишечного эпителия обладают самой высокой пролиферативной активностью, мы предположили, что в определенных условиях стволовые элементы кишечника могут генерировать клетки кроветворного ряда. В наших предыдущих в работах было показано присутствие в кишечном эпителии клеток-предшественников гемопоэза, образующих селезеночные колонии на 8-е сутки. В настоящем исследовании были изучены влияния кондиционных сред, полученных от эмбриональных мышиных клеток печени, на способность СК кишечной стенки к образованию гемопоэтичес- ких колоний. Мы исходили из того, что в эмбриональной печени мышей в период активного гистогенеза кроветворной ткани эти клетки продуцируют все необходимые ростовые факторы для дифференцировки кроветворных клеточных элементов. В нашей работе было продемонстрировано, что предварительная инкубация стволовых клеток тонкого кишечника мышей (самцов) в среде, содержащей 30 % кондиционной среды, полученной от эмбриональных мышиных клеток печени, перед трансплантацией приводит к достоверному увеличению колониеобразования в селезенке на 9-е сутки у летально облученных мышей-реципиентов (самок). Подтверждение происхождения полученных гемопоэтических колоний от клеток кишечного эпителия донора были получены с помощью маркера У-хромосомы ПЦР-анализом. Более того, потомки клеток кишечной стенки были обнаружены через 2, 4 и 6 месяцев у мышей-реципиентов в гемопоэ- тических и других тканях. Таким образом, кондиционная среда от клеток эмбриональной печени в период активного гемо- поэза содержит необходимые медиаторы, которые стимулируют способность СК кишечника к образованию гемопоэти- ческих колоний. Полученные данные открывают новые механизмы участия гуморальных факторов в явлении «пластичности» СК.