Влияние лазерного излучения ближнего инфракрасного диапазона на мобилизацию 0034+-клеток костного мозга в периферическую кровь
Е.С. Головнева, А.О. Гужина, Т.Г. Кравченко,
Г.К. Попов, М.Г. Баранова ОГУ ЦОСМП Челябинский государственный институт лазерной хирургии, г. Челябинск
В последние годы активно изучаются различные способы обогащения периферической крови стволовыми клетками (СК) костного мозга, что имеет большое значение для терапевтического лечения целого ряда гематологических, сердечно-сосудистых и ревматологических заболеваний. Однако предлагаемые методы чаще всего дорогостоящи либо токсичны и инвазивны. Целью нашей работы являлось изучение возможностей применения лазерного излучения для стимуляции миграции СК в периферическую кровь.
Эксперимент проводился на 22 белых беспородных крысах и 12 белых мышах. Использовались диодные лазеры АЛТО — «Кристалл» (Россия) с длинами волн 805, 970 нм. Клиническая апробация метода проведена на 10 больных с хронической ишемией нижних конечностей. Лазерное воздей
ствие осуществляли бесконтактным путем на области локализации красного костного мозга, в течение 1—2 минут на одну облучаемую зону, при плотности мощности излучения, не выходящей из терапевтического диапазона. У животных проводилось морфологическое изучение препаратов костного мозга бедренных костей, оценка относительной площади сосудистого русла, дегрануляции тучных клеток и локальной активности матриксных металлопротеиназ. Забор проб периферической крови больных осуществляли до лазерного воздействия и через 1 час после воздействия. Оценивали общий анализ крови, лейкоцитарную формулу, относительное содержание СБ34+-клеток методом ПЦР.
Результаты исследования показали, что у животных через час после воздействия лазером происходило нарастание относительной площади сосудистого русла косного мозга, усиление дегрануляции тучных клеток и рост протеолитической активности, что в комплексе могло способствовать мобилизации СК в синусы косного мозга и затем в периферическую кровь. У пациентов через час после лазерного воздействия, наряду с небольшим приростом общего количества лейкоцитов, происходило значительное нарастание относительного содержания СБ34+ в лейкоцитарной фракции (в 5—15 раз).
Таким образом, лазерное воздействие является эффективным неинвазивным способом обогащения периферической крови СК.
Хорошо известно прогностическое значение числа грану- лоцитов в периферической крови для оценки риска развития инфекций. Однако не всегда на фоне агранулоцитоза у пациента, получающего химиотерапию, развивается генерализованная инфекция.
Целью исследования явилось определение количества СБ34+-клеток в периферической крови детей с гемобласто- зами при развитии инфекций на фоне агранулоцитоза.
Проспективно изучено 50 эпизодов агранулоцитоза, развившихся у 40 детей с острым лимфобластным лейкозом и не-В-клеточными неходжкинскими лимфомами, получавших химиотерапию по протоколам BFM-группы. На момент обследования все дети были в состоянии клинико-гематологической ремиссии и получали идентичную сопроводительную терапию. Забор венозной крови осуществляли в течение 72 часов с момента развития агранулоцитоза. Содержание СБ34+-клеток в периферической крови определяли методом непрямой иммунофлюоресценции. Все эпизоды агранулоцитоза были разделены на 2 группы: 1-я группа («нереализованного» риска) — 25 эпизодов агранулоцитоза, на фоне которого у детей в последствии не развились инфекционные осложнения; 2-я группа («реализованного» риска) — 25 эпизодов агранулоцитоза, на фоне которых у детей впоследствии развились инфекционные осложнения с признаками синдрома системного воспалительного ответа и сепсиса.
В результате установлено, что у детей группы «реализованного» риска относительное количество СБ34+-клеток в периферической крови достоверно повышается. Данный показатель может быть использован при стратификации пациентов, получающих химиотерапию, на группы риска: если у ребенка на фоне агранулоцитоза содержание СБ34+-кле- ток составляет более 7,0 %, имеется угроза развития генерализованной инфекции.
Возможно, одной из причин возрастания числа СБ34+-кле- ток в периферической крови является формирование доклинических проявлений неконтролируемого инфекционного процесса. Дальнейшие исследования могут помочь объяснить феномен повышенной мобилизации СБ34+-клеток на фоне цитопении у детей с гемобластозами.
Л.М. Фрегатова, Б.В. Афанасьев, А.А. Тотолян Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова
Использование гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) является современным видом цитотерапии многих гематологических и негематологических заболеваний. При планировании трансплантации ГСК (ТГСК) необходима точная информация о количестве жизнеспособных CD34+- клеток. Основными преимуществами ПЦР по сравнению с другими методами количественного определения ГСК являются высокая точность результатов и скорость их получения. Разработанная нами модификация протокола ISHAGE позволила оценить ГСК в различном биологическом материале, в том числе, в периферической и пуповинной крови, костном мозге и аферезном продукте. Для точного определения области негативных событий включен изотипический контроль; для анализа жизнеспособности фракции мононуклеаров использован 7-аминоактиномицин
Для исключения наложения спектров флюоресценции при анализе двух малоклеточных популяций (ГСК и нежизнеспособные клетки) 7-AAD был использован нами не в качестве третьего компонента сочетания CD45 и CD34, а в комбинации CD45FITC/7-AAD, что позволяло определять жизнеспособность лейкоцитов вне зависимости от количества ГСК. На основании анализа 360 образцов периферической крови и продукта афереза выявлено, что данные
об объеме фракции мононуклеаров недостаточны для предварительного определения качества аферезного продукта (р > 0,05) при планировании аутологичной и аллогенной родственной ТГСК для пациентов гематологического и негематологического профиля. Количество ГСК в аферезном продукте в значительной мере зависит от относительного содержания CD34+CD45+-клеток фракции мононуклеаров периферической крови (р < 0,05). При планировании алло- генной родственной ТГСК количество процедур афереза, необходимых для получения достаточного количества ГСК, было достоверно меньше по сравнению с планированием аутологичных ТГСК (р < 0,05).
Ю.С. Титков, Е.Е. Халайчев Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН;
Центр клеточной и генной терапии; Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург
Инфаркт миокарда — наиболее частое проявление ишемической болезни сердца. Альтернативой трансплантации стволовых клеток (СК) служит методика стимуляции выброса из костного мозга в кровоток мобилизованных аутологичных стволовых клеток (МАСК) при помощи ростового гра- нулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), который является цитокином, регулирующим пролиферацию и дифференцировку СК. У больных ишемической болезнью сердца при назначении G-CSF происходит выброс МАСК в периферическую кровь из костного мозга. При этом уменьшается зона повреждения и некроза, восстанавливаются кар- диомиоциты, формируется полноценный миокард. G-CSF человека является О-гликозилированным 19,6 кДа гликопротеином с р1 5,5, биологически активен в мономерной форме. G-CSF состоит из 207 аминокислот. Ген G-CSF картируется на хромосоме 17q21-q22. Рецептор G-CSF (CD114) человека относится к мембранным белкам I типа, 130 кДа, состоит из 836 аминокислот, картирован на хромосоме 1q35-34,3. Связывание G-CSF с рецептором индуцирует димеризацию последнего с последующей трансдукцией сигнала роста и диф- ференцировки. G-CSF активирует JAK-семейство киназ, которые вызывают фосфорилирование тирозина фактора
транскрипции STAT3. После этого STAT3 стимулирует пролиферацию и индуцирует дифференцировку стромальных стволовых клеток.
Целью нашего исследования явилось изучение влияния МАСК, выброс которых стимулирован ростовым фактором G-CSF, на клиническое, гемодинамическое течение инфаркта миокарда. После введения G-CSF максимальная концентрация его в сыворотке крови достигается в пределах 2-8 часов, период полувыведения 3-4 часа.
Под нашим наблюдением находились 48 пациентов инфарктом миокарда. 14 больным инфарктом миокарда (группа исследования) лечение проводили при помощи стандартной терапии и терапии МАСК. 34 пациентам инфарктом миокарда (группа контроля) проводилось только стандартное лечение. Стимуляция G-CSF выброса МАСК костного мозга вызывает быструю положительную динамику личностного адаптационного потенциала вследствие психотропного эффекта ци- токиновой терапии при инфаркте миокарда. МАСК костного мозга останавливают процессы ремоделирования сердца при инфаркте миокарда, восстанавливают систолическую функцию сердца, увеличивая количество нормально функционирующих кардиомиоцитов, предотвращая процессы формирования рубцовой ткани на месте некроза.
Т.Д. Колокольцова, И.Ф. Радаева НИИ клеточных культур; Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» наукоград Кольцово, Новосибирская обл.
Недостаток органов для органной трансплантации, к сожалению, приводит к тому, что многие пациенты умирают, не дождавшись операции. С годами серьезность проблемы возрастает. Число пациентов, ожидающих органы для трансплантации, прогрессивно растет. Для тех, кто страдает широко распространенными и смертельно опасными заболеваниями, особенно связанными с большой потерей ткани или органной недостаточностью, биология стволовых клеток и открывающаяся перспектива их применения для заместительной терапии представляет новый медицинский рубеж.
Благодаря развитию современных наук и, в частности, биотехнологии, на современном этапе стало возможным получать и культивировать клетки отдельных тканей и органов человека. Показана высокая потребность и возможность культивирования in vitro клеток поджелудочной железы, клеток кожи человека, миокардиоцитов и миобластов человека; подтверждена уникальная способность гепатоцитов к регенерации ткани. Одними из наиболее перспективных в этом ряду клеток являются фибробласты человека. Показано, что фибробласты обладают уникальной способностью к культивированию in vitro, менее требовательны к составу питательной среды и высокоэффективны при лечении ожоговых и других ран. Появились данные, свидетельствующие о том, что фибробласты обладают полипотентными свойствами и способны дифференцироваться в другие типы клеток.
Возможность культивирования диплоидных фибробластов человека, сохраняющих стабильные свойства в течение десятков пассажей in vitro, подчеркивает перспективность наработки большого количества стандартных по биологическим свойствам клеток человека, создания на их основе аттестованных банков клеток, пригодных для широкого применения в медицинской практике. Перспективность данных исследований обусловлена, кроме того, высоким потенциалом жизнеспособности фетальных клеток и способностью восстанавливать кожный покров без образования рубцов. Актуальность и высокая значимость направления подчеркивается возможностью использования аллофибробластов при определенных показаниях: дефицит донорских ресурсов при обширных и глубоких ожогах, у больных с поливалентной аллергией, а также у лиц пожилого и старческого возраста при показаниях, не позволяющих осуществлять аутодермопластику, в детской ком- бустиологии и в случаях неизлечимых инфекций.
В ГНЦ «Вектор» в течение последних 10 лет ведутся исследования по выделению клеток из разных тканей и органов, отработке технологии их культивирования и создания аттестованных банков клеток, перспективных для заместительной терапии. Получен ряд уникальных штаммов диплоидных клеток человека, свободных от микоплазменной, грибковой и вирусной контаминации, созданы и аттестованы рабочие и посевные банки фибробластов человека, пригодных для восстановления кожного покрова на ранах. В настоящее время созданы более 10 посевных и рабочих банков диплоидных клеток человека, клетки аттестованы в соответствии с современными требованиями и могут быть использованы для научных и медицинских исследований.
Использование клеток из аттестованных банков позволит создать новые способы лечения больных, решить проблему дефицита донорского материала. Разработка нового метода применения клеток человека, заранее аттестованных и заложенных на хранение в ампулах в достаточном количестве, позволит обеспечивать стандартным клеточным материалом больных с тяжелыми ожогами при чрезвычайных ситуациях.