С.Г. Злотин, Б.Б. Смирнов ГУ Медицинский радиологический научный центр РАМН, г. Обнинск, Калужская обл.;
Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, Москва
В 70 — 80-е годы прошлого столетия в Институте органической химии был синтезирован препарат метапрогерол, который затем прошел клинические испытания в качестве фармпрепарата для лечения острых инфарктов и других поражений сердечной мышцы. К сожалению, промышленное производство и использование этого препарата в широкой медицинской практике в нашей стране не началось. Механизмы терапевтического эффекта метапрогерола были связаны со значительной стимуляцией пролиферативных процессов в поврежденной мышце сердца, однако природа этой симуляции в те годы оставалась недостаточно изученной.
Проведенные нами в последнее время исследования показали, что однократное или многократное введение мета- прогерола лабораторным животным (мыши и крысы) значительно активирует пролиферацию стволовых клеток в различных системах клеточного организма и приводит к увеличению размера их пула. Этот эффект выявлен для плюрипо- тентных и коммитированных гемопоэтических и стромальных стволовых клеток костного мозга (КОЕ-С, КОЕ-ГМ и КОЕ-Ф), а также для стволовых клеток эпителия тонкого кишечника. Эффект стимуляции может быть выявлен также и методом ПЦР по содержанию в костном мозге мышей клеток с маркером СБ34+. При предварительном общем гамма-облучении крыс в дозе 4 Гр введение метапрогерола один раз в двое суток в течение первых 4 суток после облучения значительно ускоряло пострадиационную регенерацию пулов КОЕ-ГМ и КОЕ- Ф. Также было показано, что введение метапрогерола крысам с индуцированной доксорубицином кардиомиодистрофи- ей на фоне произведенной трансплантации сингенных кар- диомиобластов, полученных из культуры мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, значительно ускоряет восстановление поврежденной сердечной мышцы.
Полученные данные о стимулирующем действии введения метапрогерола на самые различные типы стволовых клеток, находящихся на разном уровне свого коммитирования, позволили нам предположить, что в этом случае эффект реализуется неким общим механизмом, затрагивающим состояние «микроокружения» стволовых клеток, находящихся в стационарном состоянии в т. н. «нишах», и включает стимуляцию продукции ключевых цитокинов и ростовых факторов.
Эти данные послужили основой для использования ме- тапрогерола у больных, которым в недавно начавшихся ог
раниченных клинических испытаниях трансплантировали культуры аутологичных мезенхимальных стволовых клеток или полученных из них кардиомиобластов. Больные хорошо переносили 3 инъекции препарата в ранний период после трансплантации клеток. Заключение об эффективности клеточной трансплантации требует более длительного наблюдения.
В настоящее время на основе метапрогерола были синтезированы новые соединения, некоторые их которых также оказались эффективными в отношении стимуляции стволовых клеток. Учитывая то, что в ближайшие 20—30 лет основные успехи медицины в лечении хронических заболеваний могут быть достигнуты на пути трансплантации стволовых клеток, следует обратить внимание не только на получение новых клеточных культур и разработку методов их трансплантации, но и на разработку препаратов сопровождения пересадок таких клеток. Метапрогерол является первым соединением такого класса и, по-видимому, он и его производные могут оказаться перспективными агентами для сопровождения трансплантаций стволовых клеток.
О возможном использовании трансплантаций клеточных культур, полученных из мезенхимальных стволовых клеток аутологичного костного мозга, при комплексной терапии лекарственно-устойчивых деструктивных форм туберкулеза легких
А.И. Садовский, Г.Н. Саженин ГУ Медицинский радиологический научный центр РАМН, г. Обнинск, Калужская обл.; ГУ ЦНИИ туберкулеза РАМН, Москва
В настоящее время в связи с увеличением частоты развития лекарственно резистентных форм туберкулеза легких (ТЛ), агрессивным течением заболевания и неэффективными результатами стандартной терапии возникла необходимость поиска новых путей терапии больных ТЛ. При этом основные надежды возлагаются на методы повышения неспецифической резистентности организма к развитию туберкулезного процесса. Одним из перспективных путей в этом направлении является трансплантация больным мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, результатом которой может быть восстановление популяций стромальных клеток в различных органах, в том числе в костном мозге и легких. Стромальные клетки являются источником важных цитокинов и ростовых факторов, которые способствуют нормализации иммунного ответа, сниженного у туберкулезных больных, а также развитию регенераторных процессов в поврежденной легочной ткани. В опытах на но- каутных мышах с выключенной продукцией колониестимулирующего фактора гранулоцитов хронические бактериальные инфекции развивались быстрее, чем у мышей дикого типа (Mannering E.A., 2000) и при этом значительно изменялся профиль естественных защитных агентов, продукция которых в организме во многом определяется клетками стромального типа. Соображения о перспективности трансплантации мезенхимальных стволовых клеток в организм больного ТЛ подтверждают также результаты неоднократно проводившихся экспериментальных и клинических работ по трансплантации в пораженный организм ге- мопоэтических стволовых клеток без пересадки стромаль- ных клеток-предшественников. В этих случаях был достигнут только слабый лечебный эффект, т. к. стромаль- ный компонент в кроветворной ткани реципиента (источнике клеток кроветворной и иммунной систем) оставался поврежденным. Немногочисленные клинические испытания метода трансплантации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга при различных заболеваниях уже показали способность активировать иммунную систему реципиента и повышать потенциал регенерации различных поврежденных тканей и органов. Поэтому проведение ограниченных клинических испытаний метода аутотрансплантации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека у больных ТЛ, представляется актуальной научной задачей.
В совместно проводимой работе ГУ МРНЦ РАМН и ГУ ЦНИИ туберкулеза РАМН в рамках исследований по утвержденной Президиумом РАМН программе «Клеточные технологии — медицине» был разработан протокол ограниченных клинических испытаний метода трансплантации клеточных культур, полученных из мезенхимальных стволовых клеток аутологичного костного мозга, при комплексной терапии лекарственно-устойчивых деструктивных форм туберкулеза легких и проведены трансплантации таких клеток у первых 5 пациентов. Больные перенесли трансплантации без осложнений, изучение антиоксидантных свойств периферической крови пациентов через 3 месяца после пересадки клеток показало улучшение показателей у всех пациентов. При проведении контрольных рентгенологических исследований у некоторых из больных наблюдалась выраженная положительная динамика. Однако небольшой срок наблюдения и небольшое количество пациентов не позволяют в настоящее время сделать окончательное заключение о перспективах этого нового подхода в комплексной терапии пациентов с лекарственно-устойчивыми деструктивными формами ТЛ.
Изучение экспрессии прогениторными нейроклетками маркерных протеинов in vitro
Л.Д. Любич, Н.И. Лисяный Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова АМН Украины, г. Киев
Уникальные свойства стволовых клеток являются основой для разработки методов лечения широкого круга заболеваний человека. Современные методы клеточной и генной терапии патологии нервной системы предусматривают применение нейральных стволовых клеток (НСК) благодаря их способности к дифференцировке во все клеточные типы в ЦНС. В связи с перспективой использования культур НСК для трансплантации при нейродегенеративных заболеваниях возникает необходимость изучения закономерностей их развития и подбора адекватных условий культивирования.
Цель нашего исследования заключалась в изучении экспрессии белков-маркеров нейральной дифференцировки при культивировании эмбриональных нейроклеток in vitro.
Использовали эмбриональные нейроклетки человека из нативного абортивного материала (5 — 12 недель гестации). Клетки культивировали в бессывороточной среде ДМЕМ/F^ («Sigma», Германия) с добавлением препарата инсулин- трансферрин-селенит (1ТС) (PanEco Ltd., Россия) и ретинола ацетата (0,2 мг/мл) (Киевский витаминный завод). Каждых 3 дня половину культуральной среды обновляли, а часть клеток из суспензии переносили пипетированием в чашки Петри со стеклами, покрытыми полиэтиленими- ном. Культуры содержали в СО2-инкубаторе при постоянной t°, влажности и газовом составе. Живые культуры наблюдали под инвертированным микроскопом. По завершению срока культивирования культуры клеток фиксировали формальдегидом. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов на виментин и глиальный фибриллярный кислый протеин проводили с помощью наборов «Sigma». Цитологические препараты исследовали в цитоанализаторе изображения «IBAS-2000» (Германия) с последующей фоторегистрацией.
Данные наших исследований в длительной культуре in vitro за динамикой количества эмбриональных нейроклеток- предшественников свидетельствуют о том, что к 9-м суткам культивирования в бессывороточной среде DMEM/F12 дифференцированные клетки погибают, а остаются, очевидно, стволовые нейральные клетки, преимущественно жизнеспособные переживающие малодифференцированные или недифференцированные клетки (рис. 1).
Морфологическое изучение культур эмбриональных нейроклеток показало, что в течение всего периода наблюде
ния (до 22 сут) такие клетки сохраняли шаровидную форму без видимых признаков дифференцировки. В культурах нейроклеток, культивированных в среде с добавлением ретинола ацетата, а потом перенесенных на подложку, на 15-е сутки культивирования наблюдалось формирование многоклеточных шаровидных агрегатов, описанных в литературе как нейросферы.
С целью иммуногистохимического изучения экспрессии маркеров прогениторных нейральных клеток и клеток, прошедших определенный этап дифференцировки, на разных стадиях культивирования в суспензии в среде DMEM/F12 клетки отбирали и переносили в чашки Петри. На 2—4-е сутки культуры фиксировали 4%-ным нейтральным формалином и проводили иммуногистохимическое окрашивание на ви- ментин — маркер стволовых/прогениторных клеток — и глиальный кислый фибриллярный протеин (GFAP) — маркер глиобластов и астроцитов [K. Barami et al., 2000;
L. Stemple, N.K. Mahanthappa, 1997]. Установлено, что в процессе культивирования эмбриональных нейроклеток в среде DMEM/F12 с увеличением срока культивирования растет доля клеток, экспрессирующих виментин (рис.2). При этом экспрессия виментина достигает максимума к 9-м суткам культивирования. Экспрессия GFAP в процессе культивирования эмбриональных нейроклеток в среде DMEM/F12 практически не изменялась с увеличением срока культивирования (рис.2).
Наши данные согласуются с данными других исследователей (О.В. Подгорный и др., 2004; Almazryn G. еt а1., 2001), установивших при изучении культур клеток мозга эмбрионов человека 9 — 10 недель гестации, что при окраске клеток антителами на виментин выявляется наибольшее количество положительных клеток, при этом виментин коэк- спрессирован в большинстве нестин-положительных клеток. Как известно, нестин маркирует нейральные стволовые клетки, а виментин — клетки-предшественники. Кроме того, часть GFAP-положительных клеток также экспрессирует и виментин, эти клетки имеют астроцитоподобную морфологию с крупными ядрами. Двойная экспрессия эмбриональными нейроклетками GFAP и виментина может объясняться тем, что для НСК характерна определенная астроцитар- ная мимикрия (А. Alvarez-Buylla et а1., 2001; В.1. Цимбалюк,
В.В. Медведев, 2003).
Таким образом, наши данные, как и данные других авторов, свидетельствуют о том, что культуры эмбриональных нейроклеток состоят из клеток, находящихся на разных стадиях развития: стволовые клетки, прогениторы, нейроблас- ты и глиобласты. Мы считаем, что возрастание количества виментин-положительных клеток с увеличением срока культивирования эмбриональных нейроклеток в бессывороточной среде DMEM подтверждает предположение о том, что в процессе длительного культивирования в указанных условиях дифференцированные клетки гибнут, а остаются преимущественно жизнеспособные, переживающие малодифференцированные или недифференцированные клетки, стволовые или прогениторные нейральные клетки.
Таким образом, нами установлено, что на 9-е сутки культивирования эмбриональных нейроклеток в среде DMEM/F12 можно получить суспензию, обогащенную (на 80—85 %) про- гениторными нейроклетками (виментин-положительными).
О.В. Маркова, Н.И. Лисяный Институт нейрохирургии имени акад. А.П. Ромоданова АМН Украины, г. Киев, Украина
Достижением современной медицины стала разработка концепции стволовых клеток (СК) и их трансдифферен- цировки в клетки различных гистологических типов для заместительной терапии при тяжелых заболеваниях человека. Не вызывает сомнений тот факт, что в будущем единственным приемлемым с точки зрения этических норм источником СК станет кордовая кровь, содержащая стволовые гемопоэтические клетки (СГК) (Н.М. Б^ько та ш., 2003). Актуальной задачей является разработка способов направленной трансдифференцировки СГК в клетки других гистологических типов. Для заместительной терапии при заболеваниях ЦНС целесообразно применение СГК, прошедших трансдифференцировку в направлении отдельных типов клеток паренхимы мозга (нейроны, олигоденд- роциты). Разрабатываются клеточные технологии, включающие этапы получения СГК, экспансии их ш vitro и направленной трансдифференцировки ш vitro в присутствии специфических факторов.
Цель работы — сравнительное исследование возможности трансдифференцировки ш vitro CD34+-клеток в клетки с маркерами ткани ЦНС под действием ретиноевой кислоты и лизата клеток головного мозга эмбриона человека (КГМЭЧ).
Источником CD34+-клеток была печень эмбриона человека 6—8 недель гестации, полученная во время медицинских абортов. В качестве факторов трансдифференцировки использовалась ретиноевая кислота (Е.А. Щегельская и др., 2002) и лизат КГМЭЧ, полученный аналогично препарату «Трофин» (В.И. Цымбалюк, И.Г. Васильева, 2000). Маркером клеток ткани ЦНС была избрана молекула клеточной адгезии (CD56+), которая экспрессируется на клетках ЦНС и натуральных киллерах. Исходную суспензию гепатоцитов эмбриона человека обогащали CD34+-клетками в условиях культивирования, затем в среду ДМЕМ добавляли ретиноевую кислоту (2 х 10-6М) или лизат КГМЭЧ (10 % от общего объема среды) и продолжали культивирование. На 12-е сутки количество CD56+-кле- ток увеличивалось в 6 раз при добавлении лизата КГМЭЧ и в
раза при добавлении ретиноевой кислоты.
Результаты дают основание считать, что культивирование CD34+-клеток в питательной среде, содержащей лизат
КГМЭЧ, более продуктивно для получения СБ56+-клеток, чем культивирование в присутствии ретиноевой кислоты.
А.С. Андрюшкова, Г.А. Невинский, В.А. Козлов ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск
Некоторые авторы рассматривают системные и органоспецифические аутоиммунные заболевания (АИЗ) как «болезнь стволовой клетки». Действительно, иммунопатологические состояния часто сопровождаются нарушениями в системе гемопоэза. Мыши MRL/MpJ-lpr, несущие мутантный 1рг ген, имеют дефект Fas-молекулы клеточной поверхности. Нарушение апоптоза иммунокомпетентных клеток приводит к появлению аутореактивных популяций клеток, а также большого количества специфических для аутоиммунного процесса субпопуляций СВ4"СВ8" Т-клеток, результатом чего является формирование тяжелой лимфоа- денопатии. Ранее было показано, что стволовые клетки мышей MRL-lpr значительно более радиорезистентны, чем у нормальных мышей. С возрастом также отмечается увеличение количества КОЕс.
С помощью СБ34^1ТС антител было показано, что в процессе развития заболевания количество СБ34+-предше- ственников, пребывающих в (G0+G1) фазах сокращается, и увеличивается их число в ^+М) фазах клеточного цикла; количество апоптирующих СБ34+-клеток достоверно снижается.
Нами обнаружено изменение пролиферативно-дифферен- цировочных потенций СГК уже на ранней стадии заболевания, до клинических проявлений АИЗ (протеинурия) в костном мозге мышей MRL/MpJ-lpr (увеличение количества и клоногенности ранних предшественников — КОЕ-ГЭММ, количества эритроидных предшественников — БОЕ-Э; снижение уровня апоптоза костномозговых клеток, содержащих гемо- поэтические предшественники). На стадии манифестации заболевания (выраженная протеинурия) эти изменения сохранялись, что может быть следствием возрастания пролиферативной активности СГК у стареющих мышей MRL/MpJ-lpr.
С целью иммуногистохимического изучения экспрессии маркеров прогениторных нейральных клеток и клеток, прошедших определенный этап дифференцировки, на разных стадиях культивирования в суспензии в среде DMEM/F12 клетки отбирали и переносили в чашки Петри. На 2—4-е сутки культуры фиксировали 4%-ным нейтральным формалином и проводили иммуногистохимическое окрашивание на ви- ментин — маркер стволовых/прогениторных клеток — и глиальный кислый фибриллярный протеин (GFAP) — маркер глиобластов и астроцитов [K. Barami et al., 2000;