О.В. Повещенко, В.В. Сенюков ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск
Из ядросодержащих эритроидных клеток выделен водорастворимый цитостатический фактор (И^ир), обладающий им- мунорегуляторными и противоопухолевыми свойствами. Определены свойства и параметры И-зир: молекулярная масса около 0,5 кДа, чувствительность к нейраминидазе, резистентность к липазе и протеолизу. И^ир имеет положительный заряд и сорбируется на ионообменных сорбентах. В процессе дополнительной очистки ультрафильтрацией через мембрану УМ 05 (Аткоп), а затем на колонке с обращеннно-фазовым сорбентом, выделен пик, соответствующий активному веществу. Пик элюируется в начале градиента ацетонитрила, что говорит о гидрофильной природе исследуемого вещества. Получен спектр поглощения в ультрафиолетовом диапазоне, максимумы 206 и 280 нм, что соответствует гликопептидной природе исследуемого вещества. Данные тонкослойной хроматографии на силикагеле также не противоречат этому предположению.
За период с 1996 по 2004 гг. подвергались лечению 53 ребенка в возрасте от 6 до 14 лет с разлитым аппендикулярным перитонитом (РАП).
Исходно наблюдали снижение СБ3, СБ4 и СБ8, повышение функциональной активности нейтрофилов крови, со снижением резерва их бактерицидности в индуцированном НСТ- тесте. Местный иммунитет характеризовался резким снижением показателей фагоцитоза, в особенности бактерицидно- сти нейтрофилов и макрофагов перитонеального экссудата. Функция фагоцитов была изучена оригинальным микрометодом с использованием аутоштамма бактерий, выделенных из очага воспаления.
Иммунотерапию осуществляли в основной группе (12 детей) посредством внутрибрюшного введения супернатанта активированных аутонейтрофилов (СААН). Последний получали из нейтрофилов крови больного. В первой группе сравнения пациентам в/м вводили циклоферон (16 детей), во второй — лечение проводили в соответствии с современными требованиями, за исключением иммунотерапии.
После окончания иммунотерапии наблюдали повышение показателей Т-звена иммунитета, более выраженное у детей, получавших циклоферон. Нарушения функциональной активности нейтрофилов крови по НСТ-тесту сохранялись.
В очаге воспаления у детей, получавших СААН, наблюдали повышение функции фагоцитов перитонеального экссудата, особенно макрофагов, до уровня идентичных показателей в крови у здоровых детей. В группах сравнения большинство показателей местного иммунитета остались сниженными.
Клинически у больных основной группы быстрее купировался интоксикационный синдром, уменьшилась частота гнойно-воспалительных осложнений. Побочных реакций от использования СААН и циклоферона не было. Все дети выздоровели.
Таким образом, местное применение СААН у детей с РАП направлено на коррекцию не только системных, но и местных нарушений иммунитета, что позволяет рекомендовать его к широкому использованию в клинической практике.
ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск
Целью работы стала оценка эффективности препарата рекомбинантного IL-2 человека (Ронколейкина) в профилактике развития инфекционных осложнений у радикально оперированных онкологических больных в дизайне рандомизированных, двойных слепых, плацебо-контролируемых клинических испытаний.
Курс иммунопрофилактики включал две в/в инфузии Рон- колейкина (0,5 млн ЕД, на 2-е и 5-е сутки после операции) либо плацебо. В исследование были включены 109 больных раком желудка (РЖ, n = 59) и колоректальным раком (КРР, n = 50). Основная (n = 55) и контрольная группы (n = 54) были однородны по полу и возрасту пациентов, основным нозологическим формам заболевания и стадиям опухолевого процесса.
Применение Ронколейкина характеризовалось отчетливым иммунокорригирующим эффектом, который проявлялся увеличением относительного и абсолютного количества лимфоцитов, нормализацией субпопуляционного состава Т-кле- ток и уровня апоптоза лимфоцитов, усилением митогенной реактивности Т-клеток. В группе плацебо исходно выявленные иммунные дисфункции сохранялись и при повторном иммунологическом обследовании. Кроме того, дополнительно отмечалось снижение количества HLA-DR+-моноцитов, а также прогрессия цитокинового дисбаланса в виде усиления супрессорной активности сывороточных факторов. Нарастание степени тяжести иммунодепрессии было выявлено у 36 % больных группы плацебо, тогда как в основной клинической группе только в 7% случаев (pz2 = 0,009). Иммунопрофилактика позволила в 3 раза (с 20,4 % до 7,3 %, pz2 = 0,04) снизить частоту развития послеоперационных инфекционных осложнений. При этом среди пациентов с КРР не было выявлено ни одного случая с осложненным течением послеоперационного периода, тогда как в группе плацебо частота инфекционных осложнений составила 23,8 % (pz2 = 0,005). Иммунопрофилактика с использованием Ронколейкина была эф
фективна также у больных с высоким уровнем активности симпатического отдела ВНС, которые относились к группе повышенного риска развития послеоперационных осложнений. У данной категории больных по сравнению с группой плацебо использование Ронколейкина приводило к снижению частоты развития инфекционных осложнений с 39,0 до
% (p%2 = 0,0009), в том числе при КРР с 44,4 до 0 % (p%2 = 0,0004), а при РЖ с 36,0 до 15,4 % (p%2 = 0,23).
И.А. Гольдина, И.В. Сафронова, А.П. Лыков, С.Б. Милакин, Е.В. Гойман ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск; ООО «АБОЛмед», Москва
Имеющиеся на сегодня иммунодепрессивные средства, используемые при трансплантации тканей и органов, лечении аутоиммунных, лимфопролиферативных заболеваний, обладают поликлональными иммуносупрессивными свойствами, высокой токсичностью и, вследствие этого, побочными эффектами. Актуальной проблемой является разработка новых технологий иммунокоррекции, заключающаяся в создании новых лекарственных средств для лечения расстройств иммунитета. Создание новой технологии иммунокоррекции имеет два аспекта: во-первых, необходима разработка новой методологии скрининга иммуноактивных средств, поскольку прежняя методология, базирующаяся на поиске иммуностимуляторов/иммунодепрессантов «широкого профиля», на сегодняшнем этапе развития иммунологии себя не оправдывает; во-вторых, необходим поиск новых химических групп соединений, перспективных для создания оригинальных лекарственных средств иммунотропного действия.
Предварительные данные свидетельствуют о возможности создания малотоксичных иммунодепрессантов с селективным механизмом действия на основе арилгетероалканкар- боновых кислот, которые могут быть использованы для патогенетической терапии широкого круга заболеваний, связанных с Т-зависимой активацией В-системы иммунитета (аллергические заболевания, вирусные гепатиты, аутоиммунные, лимфопролиферативные заболевания).
Наибольшие сложности при поиске селективных иммуносупрессоров представляет интегральная оценка их эффекта (преимущественное влияние на баланс цитокинов Th1/Th2) на экспрессию мРНК и синтез цитокинов в МНК крови здоровых лиц in vitro. Установлено, что соединение, обладающее ингибирующим эффектом на Т-зависимую активацию В- системы иммунитета, подавляет экспрессию мРНК и спонтанную/стимулированную продукцию IL-4, но при этом стимулирует спонтанную/стимулированную продукцию IL-6.
Ф.Ю. Гариб, А.П. Ризопулу Центр по молекулярной медицине МЗиСР РФ при Санкт-Петербургском Государственном медицинском университете им. акад. И.П. Павлова
Учитывая широкий спектр биологических эффектов индукторов IFN и вовлеченность системы IFN в сано- и патогенез заболеваний, а также перспективу их практического использования, стало очевидным, что поиск новых интерфе- роногенов, изучение механизмов их действия и обеспечение пролонгации синтеза эндогенного IFN, представляются весьма актуальными.
Целью работы стало изучение влияния Саногена, Цикло- ферона и Беталейкина на интерфероногенез и противовирусную защиту при раздельном и сочетанном их введении.
Разработанный нами синтетический пептидный аналог фетального тимуса — Саноген, обладает индукторными свойствами. При раздельном введении Циклоферона, Беталей- кина и Саногена сроки максимальной активности IFN в сыворотке регистрировались через 48, 24 и 12 часов, соответственно. Отмечено, что кооперативный эффект проявляется не только однонаправленностью действия препаратов, но и превышением аддитивного действия, в связи с чем был рассчитан индекс синергизма (Ис) по формуле: Ис = А:(Б+В), где А — результат действия сочетанного введения препаратов; Б и В — при их раздельном введении. При сочетанном использовании Саногена с Беталейкином было выявлено резкое усиление интерфероновой активности сыворотки подопытных животных на сроки 48, 72, 96 и 120 часов, с максимальным Ис — 64 через 2 суток и весьма высоким — по 32 на 3, 4 и 5-е сутки после воздействия. Сочетание Саноген+ Беталейкин имело значительно более высокий средний Ис на все сроки наблюдения — 26,2 ±2 по сравнению с другими: Беталейкин+Циклоферон — 9 ± 1,5 и Саноген+Циклофе- рон — 5 ± 0,4. Различия между группами достоверны (р < 0,001).
Антивирусное действие изучали на модели гепатита мышей (штамм «Мищерина»). Максимальный защитный эффект проявился в сочетании Саноген+Беталейкин, когда из числа смертельно зараженных мышей в опыте выжило на 60 % больше, чем в контроле. Полученные нами данные о достаточно выраженных интерферониндуцирующих свойствах Са- ногена и его комбинаций с известными индукторами — Цик- лофероном и Беталейкином могут иметь практическое применение при лечении инфекционной патологии.
Е.В. Гойман, О.Т. Кудаева, О.П. Колесникова, А.П. Лыков ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск
При индукции хронической РТПХ трансплантацией клеток в системе БВА/2а (DBA/2 х C57Bl/6)F1 реакция может идти по двум направлениям, несмотря на генетическую однородность реципиентов (DBA/2 х C57Bl/6)F1: у части мышей развивается аутоиммунный гломерулонефрит (GN) (lupus+), как и описано в литературе; у остальных мышей отсутствует заметное поражение почек, но наблюдается глубокое подавление гуморального ответа на Т-зависимый антиген (lupus-), при этом в первом случае реакция идет преимущественно по Th2-, а во втором — по ТЫ-пути (О.Т. Кудаева и др., 1993; В.А. Козлов и др., 2002). Введение плазмиды, стимулирующей синтез IL-12 в организме, приводит в этой модели к изменению соотношения lupus+/lupus" мышей в пользу последних, направляя течение реакции по ТЫ-пути (В.В. Власов и др., 2002). В данной работе изучалась возможность изменения течения реакциии в противоположном направлении — в сторону активации №2-зависимых процессов. В качестве модуляторов использовались препараты, сдвигающие соотношение Th1/Th2 в сторону Th2. Все препараты вводили только во время индукции реакции.
Бисфенол А обладает способностью связываться с рецепторами к эстрогенам, при этом наблюдается снижение продукции IFNy и синтеза IgG2a (C. Sawai е! al., 2003). В наших экспериментах введение низких доз ВРА (2,5 мкг/кг) per os мышам-реципиентам увеличивает частоту развития GN с 33,3 % до 63,6 %. Пентоксифиллин (PTX), лекарственный препарат, улучшающий микроциркуляцию и реологические свойства крови, ингибирует продукцию провоспалительных цитокинов, в том числе IFNy, и подавляет развитие ТЫ-зависимого экспериментального аллергического энцефаломиелита у мышей (Y. Okuda et al., 1996). Введение PTX per os в дозе 1 мг/кг мышам-реципиентам увеличивает частоту развития GN с 25 % до 75 % . Мурамилдипептид, дериват клеточной стенки бактерий, обладает адъювантным действием, стимулирует активированные В-лимфоциты и продукцию IgG1 у мышей (V. Souvannavong et al., 1990; P.D. Becker et al., 2001). Введение MDP в/б в дозе 0,5 мг/кг мы- шам-реципиентам увеличивает частоту развития GN с 18 % до 75 %; доза MDP 1,0 мг/кг приводит к возрастанию частоты гломерулонефрита до 83,3 %.
Таким образом, воздействие на активность Th1 или Th2 на начальных стадиях РТПХ позволяет индуцировать развитие Th1- или Th2-зависимых иммунопатологических процессов.
К. Мак Косланд, Э. Оганова Алтайский государственный медицинский университет, г. Барнаул; Алтайский краевой центр профилактики и борьбы со СПИДом; Компания «4-Life Research» (США), г. Барнаул
Являясь сигнальными иммуноактивными молекулами, факторы переноса (трансфер-факторы) «обучают» и «тренируют» незрелые иммунные клетки, т. е. активируют иммунитет.
Под нашим наблюдением находилось 20 больных ВИЧ-инфекцией (17 мужчин и 3 женщины) в возрасте от 19 до 56 лет, преимущественно 21 — 25 лет (15 больных). В соответствии с классификацией ВИЧ-инфекции В.И. Покровского (1989) у 7 диагностирована стадия 2Б, у 10 — 2В, у 2 — ЗА и у 1 — 3Б. Давность инфицирования составила: у 9 — 1 год, у 4 — 2 года, у 4 — 3 года, у 1 — 5 лет и у 2 — 6 лет. Антиретровирусная и иммунокорригирующая терапия не проводилась. Трансфер- фактор назначался по 1 капсуле 2 раза в день в течение
дней. Контрольную группу составили 10 больных ВИЧ-инфекцией, получавших Циклоферон в дни 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 и 14. Перед лечением и через 7 — 10 дней после его окончания проводилось исследование иммунного статуса и определение цитокинов, в частности IL-1 p, TNFa и IFNy. У 13 из 20 больных после лечения трансфер-фактором отмечен рост числа лимфоцитов, у 15 — рост CD3, у 14 — рост CD4, у 12 — рост CD8. Иммунорегуляторный индекс (ИРИ) у 3 больных оставался на прежнем уровне, у 10 возрастал и у 7 снижался. У 16 больных отмечено снижение IgG. IgM был у всех в пределах нормы. ЦИК у 50 % больных снизился до нормы. В контрольной группе повышение числа лимфоцитов отмечено лишь у 3 из 10 больных, у 6 имело место снижение CD3, CD4, CD8. ИРИ не изменялся или снижался, а ЦИК снизились до нормы у 3 больных, повысились у 6 и не изменились у 1. С одинаковой частотой отмечено как снижение, так и рост IgG. У больных, получавших трансфер-фактор, имело место повышение IL-Ip и IFNy.
Таким образом, терапия трансфер-фактором существенно улучшает иммунный статус у больных ВИЧ-инфекцией и может быть рекомендована в качестве патогенетической. Необходимы дальнейшие исследования в этом направлении, в частности, определение оптимальной продолжительности лечения, необходимости повторных курсов и их кратности.
В.О. Сидельников, О.В. Чичков Комитет по Здравоохранению Ленинградской области
Резкое угнетение иммунного ответа при обширных ожогах и комбинированных ожоговых поражениях происходит в большей степени за счет подавления хелперной функции Т-лимфоцитов при их взаимодействии с функционально более сохранными В-лимфоцитами (Ю.В. Юркевич и соавт., 1998). Патогенетически оправданным в этих условиях может быть применение иммуномодуляторов, восстанавливающих регуляторные функции Т-лимфоцитов, в частности, препаратов на основе IL-2, дерината и тималина.
Опыты проводили на 120 белых крысах массой 200—210 г, доставляемых из питомника РАН «Рапполово» (Ленинградская обл.). Анестезию осуществляли внутримышечным введением кетамина и дроперидола (70 и 1 мг/кг, соответственно). Ожоги воспроизводили галогеновой осветительной лампой КГ 220-1000-4, мощностью 1 кВт. Время экспозиции —
сек, площадь — 20 % поверхности тела. Радиационный компонент поражения моделировали путем общего однократного гамма облучения в дозе 6,5 Гр. Ожоговую травму наносили непосредственно после облучения. Ронколейкин, тимо- ген, деринат вводили внутрибрюшинно. Животным контрольной группы внутрибрюшинно вводили эквивалентный объем хлорида натрия. Оценивали выживаемость и среднюю продолжительность жизни животных.
Установлено, что после изолированного ожога на фоне введения Ронколейкина в дозе 250000 ЕД/кг выживаемость животных составила 25 %. При двухразовом применении Ронко- лейкина через 0,5 и 4 ч после нанесения ожога выживаемость среди крыс возрастала с 25 % до 70 %, а продолжительность их жизни увеличивалась в среднем на 2,6 сут (р < 0,05). Однократное введение тимогена и дерината повышало устойчивость крыс после обширного ожога не более чем на 10 % и оказалось недостоверным (р > 0,05). Таким образом, при обширном ожоге кожи из испытанных нами препаратов отчетливым лечебным эффектом обладал лишь Ронколейкин.
В ходе работы также выявлено, что, как и при термической травме, при комбинированном поражении введение Рон- колейкина приводило к увеличению частоты случаев благоприятных исходов. Степень выраженности терапевтического действия препарата была, однако, ниже, чем при изолированном ожоге. Двукратная инъекция Ронколейкина, независимо от дозы (25000 и 250000 ЕД/кг) спустя 0,5 ч и 4 ч после комбинированного поражения способствовала повышению выживаемости крыс с 33 % до 66 % (р < 0,05), а также увеличению средней продолжительности жизни с 4 сут до 12 сут (р < 0,05). Применение тимогена и дерината в ранние сроки оказалось неэффективным, незначительное увеличение выживаемости и средняя продолжительность жизни на фоне лечения являются недостоверными (р > 0,05).
Таким образом, из испытанных иммунотропных препаратов Ронколейкин обладает наиболее выраженным терапевтическим действием, что позволяет рассматривать его в качестве перспективного средства раннего лечения пострадавших при обширных ожогах и комбинированных ожоговых поражениях.
Санкт-Петербургская Медицинская Академия последипломного образования МЗ РФ;
ГНЦ ГосНИИ особо чистых биопрепаратов;
Городской диагностический центр (вирусологический), Санкт-Петербург
До сих пор остается не решенным вопрос об эффективной терапии хронического гепатита С (ХГС). Основным препаратом в лечении больных ХГС остается рекомбинантный IFNa, который не дает стабильных положительных результатов. Учитывая ведущую роль иммунной системы в развитии и прогрессировании патологического процесса при ХГС, целесообразно применение иммуномодуляторов широкого спектра действия, таких как ^-1р (Беталейкин).
Целью нашего исследования была оценка терапевтической эффективности и перспективности применения отечественного препарата Беталейкин в комбинации с IFNa у больных ХГС.
Всего было обследовано 115 больных хроническим вирусным гепатитом С, по принципу случайной выборки больные были разделены на три группы. Первую группу составили 39 больных, получавших Беталейкин в дозе 8 нг/кг/сут в/в капельно 10 инъекций через день. Во вторую группу вошли больные, получавшие Беталейкин по схеме (см. выше) в сочетании с №^, который вводили внутримышечно по 3 млн МЕ 3 раза в неделю, в течение 4 месяцев — 41 пациент. Третью группу составляли 35 больных ХГС, получавших монотерапию IFNa в стандартной дозе в течение 6 месяцев. Всем больным выполнялось количественное определение уровня РНК вируса гепатита С в сыворотке крови и качественное определение РНК ВГС в лимфоцитах до и после лечения. После окончания
курса терапии через 1 год в первой группе полное исчезновение РНК ВГС в сыворотке крови отмечалось у 18 % больных и у 49 % в лимфоцитах; во второй группе больных исчезновение РНК ВГС в сыворотке и в лимфоцитах 39 % и 29 %; а в третьей группе 30 % и 15 %, соответственно.
Таким образом, данные нашего исследования показали, что Беталейкин действует большей частью на внепеченоч- ную репликацию ВГС, в то время как IFN подавляет репликацию вируса непосредственно в ткани печени. Что предполагает возможную необходимость использования Беталей- кина в комбинированной терапии ХГС, учитывая внепече- ночную репликацию вируса гепатита С.
Н.В. Карбышева, Д.В. Киприянов Алтайский государственный медицинский университет;
Городская больница № 5, г. Барнаул
Проблема хламидийной инфекции привлекает пристальное внимание практических врачей и ученых-исследователей уже более 30 лет. Хламидии относятся к возбудителям, наиболее часто передающимся половым путем. Не менее 5—10% молодых сексуально активных людей поражены хламидийной инфекцией, которая среди пациентов дерматовенерологических учреждений встречается в 2—3 раза чаще гонореи. Наиболее серьезными и порой необратимыми последствиями не- леченной хламидийной инфекции является мужское и женское бесплодие, эктопическая беременность, неонатальная заболеваемость. Распространенность инфекции и продолжающийся рост заболеваемости в нашей стране и за рубежом, особенно среди лиц молодого и очень молодого возраста, не успевших создать семью и обзавестись детьми, вызывает тревогу медицинской общественности во многих странах. Кроме прямых проблем здоровья, хламидийная инфекция является также причиной экономических затрат, обусловленных лечением и медицинским обслуживанием. По данным статистики в нашей стране увеличивается рост бесплодных браков, и на сегодняшний день они составляют до 10—12%. Вследствие малочисленности симптомов и несвоевременности выявления заболевание часто принимает хроническое течение. По причине специфического внутриклеточного размножения хламидий, лечение антибиотиками не всегда с первого раза может полностью уничтожить инфекцию. Предлагаются все новые и новые поколения антибиотиков, схемы и методы лечения, но, тем не менее, заболеваемость продолжает повсеместно увеличиваться. Применение современных антибактериальных препаратов сформировало проблему «побочных эффектов», среди которых дисбактериозы, токсическое поражения печени, вторичные иммунодефициты. При разработке лечебных мероприятий необходимо учитывать цикл развития хламидий, возможность образования ими L-формы, персистенции в организме, что обуславливает наряду с выбором антибактериальных средств поиск эффективной иммунокоррекции. В этой связи представили интерес сообщения о препаратах трансфер-фактор, которые относятся к новому поколению БАД, зарекомендовавших себя как мощные природные иммуностимуляторы и адаптогены. Они способны «обучать» и «тренировать» незрелые иммунные клетки или, в случае хронических процессов, «научить» полноценно распознавать экзогенны. Они эффективны при лечении многих заболеваний.
Целью исследования явилась оценка взаимоотношения частоты возникновения побочных эффектов со стороны ЖКТ при лечении урогенитального хламидиоза комплексной терапией в сочетании с трансфер-фактором в сравнении с базовым лечением.
Под нашим наблюдением находилось 50 больных урогенитальным хламидиозом (все лица мужского пола в возрасте от 15 до 42 лет). Диагноз был верифицирован на основании клинико-эпидемиологических данных: жалоб (рези при мочеиспускании, скудные слизисто-гнойные выделения из уретры, покраснение головки полового члена), специфического анамнеза (случайный незащищенный контакт за 1,5—3 недели до появления симптомов), клинической картины (уретрит, баланопастит, орхоэпидидимит) и результатов лабораторных исследований: мазка из уретры (методом ПЦР ДНК хлами- дий). Определение ПЦР ДНК хламидий проводилось до начала и после лечения. В процессе проводимого лечения все больные были распределены на 2 группы: 24 пациента (1-я группа) получали только антибактериальную терапию по традиционным рекомендуемым схемам (последовательно назначались Кларитромицин 500 мг 2 раза в день (10—14 дней), Докси- циклин 100 мг 1 раз в день в течение 10 дней и Офлокса- цин 200 мг 2 раза в день на протяжении 10 дней); 26 больным (2-я группа) был сокращен курс антибактериальной терапии и проведено лечение трансфер-фактором (одновременно с первого дня лечения назначался Кларитромицин 500 мг
раза в день курсом на 10—14 дней и трансфер-фактор по 1 капсуле 3 раза в сутки в течение 10 дней). Таким образом, лечение 1-й группы занимало 30—34 дня, в то время как на лечение 2-й группы уходило 10—14 дней.
Проведенные наблюдения показали хорошую переносимость препарата трансфер-фактор. У пациентов 2-й группы после назначения антибиотика и приема трансфер-фактора при сравнении с первой группой практически не наблюдалось развитие «побочных эффектов», часто возникающих после проведения таким больным рекомендуемой схемы лечения (лишь у 4 % появилась тошнота, горечь во рту и в 8 % случаев развился кандидоз ЖКТ и гениталий).
У больных, получавших традиционное лечение без назначения трансфер-фактора (1-я группа), можно было отметить значительное развитие болезненных проявлений со стороны органов ЖКТ: тошноту и снижение аппетита отмечали каждый третий (32 %) пациент, в 88 % случаев зарегистрированы явления дисбактериоза кишечника с преобладанием грибкового поражения и кандидоз гениталий, у 12 % развилась рвота, у каждого второго (56 %) появилась горечь во рту, возник дискомфорт в эпигастрии у 72 %, а у 63 % — метеоризм, в 26 % случаев больных беспокоили головные боли и в 12 % — диарея.
Большой процент «побочных эффектов» у пациентов
й группы при приеме антибактериальных препаратов определял необходимость дополнительного лечения у гастроэнтерологов и назначения к основной терапии гепатопро- текторов, эубиотиков, энзимов и противогрибковых препаратов, что удлиняло сроки и стоимость лечения.
Напротив, пациенты 2-й группы крайне редко нуждались в дополнительной протективной терапии.
Контрольное исследование для оценки эффективности лечения методом ПЦР (мазок из уретры и секрет простаты) проводилось через 2 месяца после окончания лечения. В обеих группах эрадикация хламидий — в 100 % случаев.
Индивидуальной непереносимости препарата трансфер- фактор у пациентов 2-й группы не отмечено.
Таким образом, можно выделить основные преимущества применения препарата трансфер-фактор в комплексе лечения урогенитального хламидиоза:
Значительное сокращение сроков лечения (10—14 дней вместо 30—34 дней базовой терапии).
Наличие протективного эффекта от токсического действия антибактериальных препаратов.
Резкое снижение необходимости применения гепатопротек- торов, эубиотиков, противогрибковых препаратов и энзимов.
М.В. Киселевский, Е.О. Халтурина ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
В настоящее время стандартом хирургического лечения рака желудка является гастрэктомия, элементом которой является спленэктомия. Селезенка является иммунокомпетен-
тным органом, ее удаление ведет к сдвигу динамического равновесия в иммунной системе и усугублению иммунологической недостаточности, характерной для онкопатологии.
Нами была изучена и оценена эффективность применения препарата трансфер-фактор плюс (ТФП) («4-Life Research») как иммуномодулирующего средства, применяемого в составе метода комплексной адоптивной иммунотерапии рака желудка.
Клинические испытания препарата ТФП проведены на 25 больных раком желудка (экспериментальная группа) во 2—3-й клинических стадиях заболевания, в возрасте от 41 до 70 лет. Контрольную группу составили 25 пациентов, аналогичных по полу, возрасту, нозологической форме и стадии заболевания. Всем больным как экспериментальной, так и контрольной групп было проведено хирургическое лечение, включавшее в себя гастрэктомию (или проксимальную резекцию желудка) с лим- фодиссекцией в объеме D2, элементом которой являлась спле- нэктомия. Стандартная схема иммунотерапевтического лечения, применяемая в послеоперационном периоде, включала в себя проведение адаптивной IL-2/ЛАК иммунотерапии (терапия IL-2 и лимфокинактивированными киллерами — ЛАК- клетками, полученными путем экстракорпоральной активации мононуклеарных клеток крови) для стимуляции неспецифического звена иммунитета (в том числе и противоопухолевого иммунитета). Пациенты экспериментальной группы дополнительно к стандартной схеме лечения получали ТФП по
капсуле 3 раза в день в течение 30 дней.
В клинической картине у больных раком желудка 2—3-й стадии до начала проведения комплексной иммунотерапии в послеоперационном периоде преобладал интоксикационный синдром. При оценке параметров иммунного статуса было выявлено, что у большинства пациентов имел место иммунодефицит различной степени выраженности, который усугубился после проведения оперативного лечения. Отмечалось существенное снижение содержания Т-лимфоцитов, преимущественно за счет снижения CD4+ (Т-хелперы/индукторы) и CD8+ (Т-супрессоры/цитотоксические), а также изменение иммунорегуляторного индекса в сторону его снижения. При определении уровня сывороточных иммуноглобулинов было выявлено существенное снижение уровня иммуноглобулина М. При анализе результатов спонтанной и индуцированной продукции цитокинов было выявлено увеличение их концентрации в сыворотке крови и супернатантах после операции, что свидетельствует о сохранении способности к системному ци- токиновому ответу на хирургическую травму. Исследования, проведенные после окончания курса комплексной терапии с использованием ТФП, показали положительное влияние проводимой терапии на показатели иммунного, интерферонового и цитокинового статусов и клиническое течение заболевания. У 35 % больных раком желудка отмечалась положительная динамика. Увеличилось содержание CD3+, CD4+, CD8+ субпопуляций лимфоцитов крови, значительно повысилось содержание NK-клеток в крови, что свидетельствует об активации клеточного звена иммунной системы. В исследуемых показателях гуморального звена иммунитета также отмечается положительная динамика, которая выражается в нормализации уровней спонтанной продукции TNFa и IL-ф. В целом, можно отметить хорошую переносимость препарата ТФП, достаточно высокую его эффективность в составе комплексной иммунотерапии онкологических заболеваний, что позволяет рекомендовать его применение в широкой клинической практике.
Учитывая результаты проведенного исследования, следует отметить, что применение ТФП в комплексной (IL-2/ЛАК) терапии у онкологических больных после радикальных хирургических операций с явлениями выраженного иммунодефицита в 35 % случаев приводит к нормализации показателей иммунного статуса и улучшению общего состояния пациентов. Для оптимизации лечебно-профилактического действия ТФП рекомендуется увеличить дозу и кратность курсов. Для оценки длительности иммунокорригирующего действия ТФП у исследованной группы больных целесообразно дополнительное изучение показателей иммунитета через 3 месяца после окончания курса.
М.Б. Раев3, Е.Г. Орлова23, О.Л. Горбунова2, М.С. Красных2 1 Филиал Института иммунологии и физиологии УрО РАН, Екатеринбург;
ЗАО «Институт новых медицинских технологий», г. Краснокамск;
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь
Получение препарата альфа-фетопротеина (АФП) для создания лекарственного средства «Профеталь» диктует необходимость получения гипериммунной антисыворотки, что, по сути, является первым этапом в конструировании технологической цепи, обеспечивающей производство препарата.
В качестве животных-продуцентов гипериммунной сыворотки были использованы козы. Выбор был обоснован экономически — получение большого количества сыворотки в течение длительного времени от небольшого числа животных.
В качестве антигена применяли АФП, выделенный и очищенный до гомогенного состояния, из абортивной крови человека в ЗАО «Институт новых медицинских технологий».
Для получения антител против АФП иммунизировали коз в возрасте 2—8 лет, массой 30—35 кг. Была выбрана следующая схема: первичная иммунизация проводилась раствором АФП с полным адъювантом Фрейнда из расчета 0,3 мг/кг массы тела животного, который вводился в предлопаточный лимфатический узел и подкожно в область холки. Через три недели проводили повторную иммунизацию чистым АФП, который вводили внутривенно, внутримышечно и подкожно. Через четыре недели после второй иммунизации проводили забор крови для выделения антител. После отдыха животных иммунизировали по этой же схеме. Нарастание титра антител контролировали на каждом этапе иммунизации с помощью метода Оухтерлони и разработанного нами метода, основанного на принципе турбодиметрии.
Таким образом, использованная нами схема иммунизации коз позволила удовлетворить потребность в исходном материале технологического цикла серийного производства, а также стабилизировать воспроизводство первого звена технологической цепи — синтез аффинного сорбента.
ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН; 2 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; 3 Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
Показано, что пероральное введение антигенов или ци- токинов можно использовать для модуляции гемопоэза и иммунных реакций. Одним из возможных путей доставки антигенов или цитокинов может быть использование трансгенных растений. Исследования идут в направлении создания трансгенных растений, несущих опухолевые, инфекционные антигены или иммунорегуляторные цитокины с целью модуляции специфических иммунных реакций.
Целью нашего исследования являлось создание трансгенной по гену IL-18 человека моркови и изучение возможности ее перорального применения для модуляции иммунных реакций у мышей.
IL-18 — это белок, постоянного продуцирующийся различными клетками в организме человека и участвующий в формировании врожденного и приобретенного иммунного ответа. Этот медиатор регулирует функциональную активность ТЫклеток и определяющих путь, по которому будет преимущественно развиваться иммунный ответ. Основные эффекты IL-18 направлены на стимуляцию продукции таких цитокинов, как IFNy, TNFa, IL-1 в, а также молекул адгезии и факторов, стимулирующих апоптоз.
На базе Института цитологии и генетики СО РАН совместно с Новосибирском институтом химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН было получено трансгенное растение морковь — Daucas carota L. — продуцент IL-18 человека. Для трансформации растений методом агробактериаль- ного переноса использовали генетическую конструкцию, позволяющую проводить экспрессию IL-18 в виде гибридного белка, несущего N-терминальный HIS?-тракт нуклеотидную последовательность под управлением 35S промотора. Геномные ДНК отобранных растений были проанализированы на наличие последовательности IL-18 человека методом ПЦР. Во всех проанализированных растениях показано присутствие продуктов, соответствующих по размерам целевому гену IL-18.
Изучение иммунорегуляторных эффектов IL-18, экспрессирующегося в трансгенной моркови, проводилось на мышах линии С57В1/6 и (CBA4C57Bl/6)Fi, животные получали к стандартному рациону, в течение 16 дней трансгенную морковь в дозе 1,7—2 г/мышь ежедневно. В качестве контроля использовалась группа мышей, получавшая обычную морковь в той же дозе, а также группа мышей, содержавшаяся на стандартном рационе без добавок. Установлено, что прием в пищу моркови трансгенной по IL-18 в течение 16 дней не влияет на спонтанную и митоген индуцированную пролиферативную активность спленоцитов и тимоцитов. Определение продукции IFNy показало, что пероральный прием трансгенной моркови может достоверно стимулировать продукцию IFNy спленоцитами мышей. Влияние моркови, несущей ген IL-18, на развитие клеточного иммунного ответа, оценивалась по степени выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа на Т-зависимый антиген (эритроциты барана). Установлено, что добавление в пищу трансгенной моркови в указанной дозе в течение 16 дней достоверно стимулирует формирование клеточного иммунного ответа по сравнению с интактной (обычный рацион) и контрольной (добавление обычной моркови) группой. При изучении формирования гуморального иммунного ответа не выявлено достоверного влияния трансгенной моркови с IL-18 на уровень первичного гуморального ответа на Т зависимый антиген (ЭБ).
Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что пероральное введение моркови, несущей ген IL-18, достоверно стимулирует продукцию IFNy спленоцитами, а также стимулирует клеточный иммунный ответ, регистрируемый по увеличении. реакции гиперчувствительности замедленного типа.
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН;
OOO «Центр инженерной иммунологии», г. Новосибирск
IL-18 (или фактор, индуцирующий IFNy) — относится к семейству IL-1 и продуцируется конститутивно целым рядом клеток. Этот медиатор обладает плейотропными эффектами в отношении многих типов клеток и влияет на секрецию различных по своей функциональной направленности медиаторов. IL-18 играет важную роль в функционировании клеток ТЫ-типа, являясь ростовым и дифференцировочным фактором для них, а также индуктором продукции IFNy и TNFa. В комбинации с другими медиаторами (IL-12) он может оказывать влияние и на клетки ТЪ2-типа. Есть данные как о про-, так и противовоспалительной активности IL-18. В целом, большинство работ указывает, что IL-18 сдвигает баланс клеток в сторону активации клеточного звена иммунного ответа. IL-18, с одной стороны, участвует в противоин- фекционной и противоопухолевой защите организма, а с другой, в некоторых случаях является патогенетическим фактором формирования хронического воспаления (болезнь Крона, СКВ и др.). Растворимый IL-18 связывающий белок (IL-^СБ) был очищен и охарактеризован в человеческой моче и в сыворотке мышей после введения P. acnes и ЛПС. IL-^СБ, имеет молекулярный вес 38 кДа, конститутивно экспрессируется спленоцитами и относится к суперсемейству иммуноглобулинов. IL-^СБ связывает IL-18 с высокой аффинностью и играет роль физиологической растворимой ловушки рецептора, и, соответственно, регулирует биологическую активность IL-18.
В связи с вышесказанным, целью данной работы было исследование биологической активности рекомбинантных ци- токинов IL-18 и IL-^СБ с перспективой разработки, в дальнейшем, на их основе лекарственных препаратов. Рекомбинантные белки экспрессировали в клетках Е. coli, подвергали рефолдингу и хроматографической очистке до более 95 % гомогенности. При изучении биологической активности IL-18 было показано, что изучаемый белок стимулирует продукцию IFNy, TNFa и оксида азота (NO) мононуклеарами периферической крови человека, сдвигает баланс клеток CD4/CD8 в пользу последних и, кроме того, стимулирует реакцию гиперчувствительности замедленного типа у мышей. При исследовании его противоопухолевой активности использовалась мышиная перевиваемая клеточная линия меланома В16. В результате проведенных исследований показано, что рекомбинантный IL-18 человека тормозит рост опухолевых клеток, увеличивает инфильтрацию и снижает ангиогенез солидной опухоли. При изучении специфической биологической активности полученного IL-^СБ показано, что при добавлении его в культуру мононуклеаров периферической крови, он достоверно снижает спонтанную и стимулированную (р^-18, Конканавалин А) продукцию TNFa.
Таким образом, в наших исследованиях экспериментально показаны биологические и специфические эффекты рекомбинантных цитокинов IL-18 и IL-^СБ, описанные ранее в литературе.
А.В. Москалев, А.Н. Буйнова, О.Н. Осипова, Л.А. Потапова Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова;
ГУ Северо-Западный окружной медицинский центр, Санкт-Петербург
В настоящее время существует выраженная тенденция увеличения количества женщин репродуктивного возраста с папилломавирусной инфекцией (ПВИ), которая негативно сказывается на течении беременности. Персистирование ПВИ связывают с генетическими изменениями, приводящими к нейтрализации опухолевых супрессорных генов, снижению местного иммунитета, уменьшению количества и нарушению функции клеток Лангерганса. В результате такой иммуносупрессии существующие методы лечения не приводят к безрецидивному течению и нуждаются в иммунокоррекции.
Нами были обследованы 38 женщин с ПВИ, находящихся в фолликулярной или лютеиновой фазах менстуального цикла в возрасте 24,7 ± 5,2 лет с привычным невынашиванием. Давность заболевания от 3 до 5 лет, с ограниченными формами инфекции. 20 из них наряду с комплексной терапией вводили подкожно по разработанной нами методике Бета- лейкин. 18 больных получали только комплексную терапию.
У обследуемых изучали состояние цитокиновых профилей (IL-1?, IL-8, TNFa) в супернатантах с помощью диагностических тест-систем ООО «Протеиновый Контур». Уровни сывороточных иммуноглобулинов А, М, G определяли по Manchini.
У больных с ПВИ эндогенная продукция провоспалитель- ных цитокинов (IL-1?, IL-8, TNFa) была существенно снижена (р < 0,001), что характеризует обследуемых как больных со вторичными иммунодефицитными состояниями. Продукция сывороточных иммуноглобулинов также была снижена. Особенно была депрессирована продукция IgG — 7,79 ± 0,08 и 14,2 ± 1,4 г/л в контрольной группе (р < 0,001) и IgA — 0,51 ± 0,06 и 2,9 ± 0,05 г/л в контрольной группе (р < 0,001). Уровни IgM достоверно не различались, но у больных с ПВИ имели тенденцию к снижению.
Применение Беталейкина в комплексной терапии больных с ПВИ значительно ускоряло эпителизацию мест деструкции на 4,5 ± 0,6 сутки, в сравнении с больными, получавшими только комплексную терапию. Уровни провоспа- лительных цитокинов в данной группе также быстрее восстанавливались и достоверно не отличались от показателей контрольной группы. Уровни IgG были практически такими же, как в контрольной группе, а IgA оставались достоверно сниженными у больных, получавших только комплексную терапию.
При наблюдении в течение 1 года рецидив у больных, в комплексном лечении которых применялся Беталейкин, был выявлен у двух женщин (10 %), а в группе больных, находящихся только на комплексном лечении у 7 человек (38,9 %).
Клиническое течение ПВИ связано с выраженной иммуносупрессией. Различные классические способы лечения не предотвращают развитие рецидива заболевания. Применение Беталейкина в комплексной терапии восстанавливает функциональную активность иммунокомпетентных клеток и существенно препятствует развитию рецидива заболевания, благоприятствует течению беременности. В периоде динамического наблюдения целесообразно через 4—
месяцев проводить иммуномодулирующую терапию Бе- талейкином.
МУ городской кожно-венерологический диспансер, г. Липецк; 2 ООО «Биотех», Санкт-Петербург; 3 МУ Клиническая инфекционная больница, г. Липецк
Целью данного исследования является установление эффективности применения в лечении псориаза иммунотерапии Ронколейкином.
Больные с диссименированно папулобляшечной формой, частичной эритродермей были разделены на две группы по 10 человек. В 1-й группе пациенты получали комплексную терапию: глюконат кальция 10% 10,0 в/в № 10; гемодез 400,0 в/в № 5; эссенциале 10,0 в/в № 10; витамины B1, B6, B12 в/м № 15; никотиновая к-та 1 % по 1,0 в/м № 10; сульфат магния 25 % 5,0 в/м № 10; димедрол 1 % 1,0 № 10; феназе- пам по 1 таб. на ночь № 15; аскорбиновая к-та 0,3 3 раза в день № 30; фолиевая к-та 0,001 3 раза в день № 60; аевит
капс. 3 раза в день № 45; активированный уголь 6 т. на ночь № 42; липоевая к-та 0,025 по 3 раза в день № 60. Местно мази: 2%-ная салициловая мазь, локоид и элаком через день и УФО. Больным 2-й группы дополнительно к приведенной схеме вводился вв капельно в течение 4 часов Ронколейкин по 500 000 ЕД на 400 мл 0,9 % NaCl трехкратно через 48 часов.
До проведения терапии у больных выявлено повышенное содержание CD16+-лимфоцитов, а также числа активированных лимфоцитов CD25 и HLA-DR+. Отмечалось увеличение относительного и абсолютного количества CD19+-лимфоци- тов. Выявлена тенденция к увеличению содержания ЦИК в сыворотке крови, значительное повышение уровня лизоци- ма, а также напряженность фагоцитарных реакций. Имело место повышение концентрации иммуноглобулинов класса A, M, G и E в сыворотке крови.
В результате исследования было показано, что применение Ронколейкина в опытной группе привело к отсутствию или к значительному сокращению частоты рецидивов заболевания псориазом в 50 % случаев на протяжении наблюдения от 6 до 8 месяцев, в 2 раза уменьшилась степень тяжести рецидива, и они протекали в более легкой форме. Время купирования симптомов заболевания в группе с применением IL-2 было меньше.
У всех больных через 4—7 суток после окончания курса терапии наблюдалось отчетливое улучшение большинства параметров иммунного статуса: нормализация общего числа лейкоцитов в крови, увеличение функциональной активности лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов; нормализация значений иммунорегуляторного индекса с 0,8—1,0 (до лечения) до 1,2—1,5 (после лечения). Положительный эффект подтверждается клинической динамикой — исчезновением воспалительных проявлений кожного процесса и удлинением сроков ремиссии от 0,5 года и более.
Таким образом, Ронколейкин обладает выраженными иммуномодулирующими свойствами. Иммунотропное действие Ронколейкина при псориазе вызывает положительный клинический эффект, выражающийся в купировании активности воспалительного процесса, снижении степени тяжести рецидивов и более стойкой ремиссии.
А.А. Гражданцева, С.Н. Щелкунов, И.П. Гилева ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор», наукоград Кольцово, Новосибирская обл.
Гиперпродукция TNF играет патологическую роль при различных заболеваниях человека (ревматоидный артрит, менингит, септический шок, кахексия). В настоящее время в качестве TNF-антагонистов в клинической практике используются препараты инфликсимаб и этанерцепт, однако остается необходимость расширения ассортимента TNF-антагонистов, т.к. применение уже известных препаратов не является универсальными и имеет ряд противопоказаний. Одним из подходов к данной проблеме является изучение свойств ортопоксвирусных TNF-связывающих белков (CrmB) в качестве возможных средств для анти-TNF-терапии.
Нами получены препараты рекомбинантных CrmB вирусов натуральной оспы (VARV), оспы обезьян (MPXV) и оспы коров (CPXV). Биологические свойства препаратов рекомбинантных белков изучали in vitro по их способности нейтрализовать цитотоксические эффекты TNF на культуре L929 мышиных фибробластов и in vivo на модели LPS-индуциро- ванного септического шока. Показано, что рекомбинантные CrmB видоспецифически нейтрализуют цитотоксическое действие человеческого, мышиного, кроличьего TNF, некоторых форм мутантных человеческих TNF, а также человеческого лимфотоксина. Показано, что in vitro VARV-CrmB ингибирует цитотоксическое действие человеческого TNF на два порядка более эффективно, чем человеческий рекомбинантный рецептор TNF II («R&D systems», USA). In vivo VARV-CrmB, но не MPXV-CrmB и CPXV-CrmB увеличивали выживаемость животных в модели LPS-индуциро- ванного септического шока.
О.М. Перминова, В.В. Сенюков, Н.Н. Вольский ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск
Апоптоз лимфоцитов тимуса, вызываемый глюкокортико- идными гормонами (ГК), играет важную роль в реализации физиологических эффектов ГК. Ранее нами было показано, что индуцированный дексаметазоном апоптоз тимоцитов мыши опосредуется увеличением внутриклеточной продукции Н2О2, т. к. каталаза, снижающая концентрацию Н2О2, и дифенилениодониум — ингибитор НАДФ • Н-оксидазы, блокирующий стимуляцию дексаметазоном продукции активных кислородных метаболитов (АКМ), уменьшали интенсивность апоптоза. Известно также, что дегидроэпиандростерон (ДГЭА) и его сульфатированные производные являются физиологическими антагонистами ГК и способны ингибировать ГК-индуцированный апоптоз тимоцитов. На основании этих данных было предположено, что механизмом антиапоптоти- ческого действия ДГЭА является ингибирование им внутриклеточной продукции АКМ.
Для проверки этого предположения исследовано влияние ДГЭА на продукцию Н2О2 в тимоцитах мышей in vitro. Внутриклеточный уровень Н2О2 оценивали с помощью проточной
цитометрии, используя 2’7'-дихлорфлуоресцин диацетат, окисляющийся под действием Н2О2 до интенсивно флуоресцирующего продукта.
Обнаружено, что добавление в среду инкубации клеток Cu(Lys)2 (хелата меди, дисмутирующего супероксидный радикал в Н2О2) вдвое увеличивает стационарный уровень перекисей в тимоцитах. Этот факт можно рассматривать как подтверждение того, что основным источником перекисей в исследованных экспериментальных условиях являются супе- роксид-генерирующие ферментные системы клеток. ДГЭА в концентрациях от 50 мкМ до 200 мкМ дозозависимо ингибировал продукцию Н2О2 в клетках тимуса. При концентрации ДГЭА 200 мкМ скорость образования Н2О2 уменьшалась более чем в два раза (на 58 %).
Полученные результаты показывают, что одним из возможных механизмов действия ДГЭА на иммунную систему является его ингибирующий эффект на внутриклеточную продукцию АКМ.
И.Н. Пятакова, В.М. Женило, С.В. Здирук Ростовский государственный медицинский университет
В настоящий момент особый интерес представляет собой изучение цитокинов группы полипептидных медиаторов, участвующих в формировании и регуляции защитных реакций организма, именно поэтому интерлейкины находят применение в клинической практике как лекарственные препараты для коррекции гомеостаза и профилактики различных осложнений (А.С. Симбирцев, 2004).
В исследовании мы применяли препарат Ронколейкин (рекомбинантный ^-2), созданный на базе лаборатории генетики Санкт-Петербургского государственного университета. Рон- колейкин — полный структурный аналог эндогенного ^-2, обладающего способностью активировать процессы репарации и регенерации тканей, а также обеспечивать сопряженную работу биологических систем: иммунной, ПОЛ и антиоксидан- тной (Н.Н. Володин, 2003).
Целью исследования стало изучение динамики показателей ПОЛ и антиоксидантной системы при травматических оперативных вмешательствах на фоне тотальной внутривенной анестезии с Ронколейкином.
Проведено обследование 27 пациенток с миомой матки, разделенных на группы: 1 — женщины, оперированные под ТВА без использования цитокиновых препаратов, 2 — женщины, оперированные под ТВА на фоне Ронколейкина. Рон- колейкин вводился за 24 ч до операции в дозе 0,1 мг на 400 мл физиологического раствора с добавлением 4—8 мл альбумина. Всем пациенткам определялись следующие показатели: МДА, общая окислительная активность, общая антиокислительная активность, уровни каталазы и супероксиддисмутазы. Показатели определялись до операции, после травматического этапа оперативного вмешательства и через трое суток после него.
В 1-й группе во время общей анестезии и в раннем послеоперационном периоде концентрация МДА достоверно увеличивалась на 42,6 ± 3,8 % и 13,7 ± 12,6 %,что вызвало повышение общей окислительной активности на этих же этапах операции на 37,4 ± 3,7 % и 64,2 ± 4,1 %, соответственно. В тоже время наблюдалось снижение общей антиокислитель- ной активности на втором и третьем этапах на 21,3 ± 3,6 % и 18,4 ± 2,4 % (р < 0,05). Эти показатели свидетельствовали
об истощении антиоксидантной системы в основном за счет концентрации супероксиддисмутазы, которая уменьшилась на
± 7,9 %, а коэффициент каталаза/супероксиддисмутаза на 41,4 ± 3,8 % (р < 0,05). Во 2-й группе пациентов на тех же этапах исследования концентрация МДА увеличивалась на
± 2,6 % и 21,31 ± 3,6 %, общая окислительная активность на 12,7 ± 2,1 и 22,4 ± 3,6 %, а общая антиокислитель- ная активность снизилась на 7,6 ± 6,7 и 10,8 ± 4,3 %, соответственно (р > 0,05). Снижение ООА отмечалось за счет уменьшения активности супероксиддисмутазы на 18,4 ± 2,6 %, а коэффициента каталазы/супероксиддисмутазы на
± 3,2 %.
Тотальная внутривенная анестезия по традиционному варианту не защищает организм в полной мере во время операции и в раннем послеоперационном периоде от окислительного стресса, а вариант ТВА в сочетании с Ронколейкином обеспечивает адекватную защиту пациентов от операционного стресса и не вызывает грубых нарушений в системе ПОЛ и АОС. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости применения в ходе анестезиологического пособия препаратов супероксиддисмутазы.
Е.Г. Орлова23, М.С. Красных2, О. Л. Горбунова2, С.Ю. Родионов12 1 Институт иммунологии и физиологии УрО РАН;
ЗАО Институт новых медицинских технологий, г. Краснокамск;
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь
Получение альфа-фетопротеина (АФП) в настоящее время является перспективным направлением в биотехнологии, поскольку препарат используется как инъекционное лекарственное средство при аллергических, аутоиммунных и некоторых видах опухолевых патологий.
АФП выделяют из пуповинной, плацентарной и абортной крови человека с помощью аффинной хроматографии на сорбенте сефарозе CL-4B с ковалентно пришитыми козьими антителами против АФП человека. Несмотря на селективность иммунных сорбентов, в результате аффинной хроматографии выделенный АФП существенно контаминирован белками, которые в ходе специального исследования были идентифицированы как иммуноглобулины G человека. Для очистки препаратов от примесей подобного рода, учитывая что молекулярная масса АФП — 69 кДа, а IgG человека — 146 кДа, логично использование гель-фильтрации на сефадексе G-100 и/или Sephacryl S200 или ионообменную хроматографию на DEAE-сефарозе.
Электрофоретическое исследование препаратов, полученных в результате гель-фильтрации и ионообменной хроматографии, наглядно продемонстрировало неспособность этих методов решить проблемы очистки АФП и полностью удалить из препарата иммуноглобулины.
Задача доочистки препарата была решена при помощи негативной хроматографии, в которой в качестве иммуносорбента использовали сефарозу CL-4B, модифицированную кроличьими антителами к IgG человека. Высокая сорбционная емкость (до 5 мг/мл геля), а также низкий уровень неспецифической сорбции такого сорбента позволили решить проблему контаминации получаемого препарата АФП без потерь очищаемого белка.
Филиал Института иммунологии и физиологии УрО РАН, Екатеринбург;
ЗАО «Институт новых медицинских технологий», г. Краснокамск;
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь
Необходимым условием иммунизации животных является контроль уровня специфических антител в сыворотке крови. В настоящее время в лабораторной практике для оценки титра специфических антител наибольшее применение находит метод преципитации в геле по Оухтерлони. Однако этот метод мало чувствителен и не позволяет количественно оценить уровень специфических антител в сыворотке иммунизированных животных. Поэтому, целью исследования явилась сравнительная оценка чувствительности двух методов: пре
ципитации в геле по Оухтерлони и турбидиметрического метода на примере определения уровня специфических антител к альфа-фетопротеину (АФП) в сыворотке иммунизированных коз.
Титр специфических антител к АФП в сыворотке коз оценивали:
Методом преципитации в геле по Оухтерлони. Чашки Петри заливали 1 %-ным агаром. Через 30 мин. после застывания агара вырезали лунки. Лунки с раститрованной сывороткой располагали по окружности, а лунку с АФП — в центре. После внесения исследуемых образцов, чашки выдерживали во влажной камере при комнатной температуре в течение 24 ч. Оценку титра антител к АФП проводили по последней визуализируемой линии преципитации в ряду разведений сыворотки козы.
Турбидиметрическим методом. В 96-луночный полистироль- ный планшет вносили АФП с известной концентрацией и ра- ститрованную козью сыворотку. Измерение проводили через 30 мин. при длине волны 340 нм. По изменению оптической плотности оценивали титр специфических антител к АФП в сыворотке козы.
Таким образом, в ходе проведенных исследований установили, что чувствительность турбидиметрического метода, как минимум, на порядок превосходит чувствительность метода преципитации в геле по Оухтерлони. Также этот метод является существенно более оперативным в процедурном исполнении, дающим не только качественную, но и количественную оценку. Быстрота и простата исполнения турбиди- метрического анализа позволяет использовать его как экспресс-метод.
К вопросу о способах синтеза иммуносорбентов для аффинной хроматографии белков фетоплацентарного комплекса
М.Б. Раев3, Д.А. Суховая2, Л.Р. Хорошева2,
А.В. Зайцева2, С.Ю. Родионов12
Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, Екатеринбург;
ЗАО «Институт Новых медицинских технологий», г. Краснокамск, Пермская область;
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь
Одной из актуальных задач современной молекулярной биологии является выделение и очистка различных белков из биологических материалов. При этом существенное значение имеет возможность получения высоко очищенных препаратов в количествах, удовлетворяющих потребность серийного производства лекарственных средств на их основе. Наиболее перспективным на наш взгляд решением данной задачи может являться использование сорбционных процессов на основе стереоспецифических взаимодействий. Поэтому изучение и разработка методов синтеза иммуносорбентов для проведения аффинной хроматографии — одно из наиболее важных направлений в совершенствовании методов современной биотехнологии.
Для выделения и очистки одного из сывороточных белков фетоплацентарного комплекса — альфа-фетопротеина, обладающего иммунорегулирующими свойствами — использовали иммунносорбенты, полученные на основе ковалентного связывания поликлональных антител с нерастворимым носителем сефарозой CL-4B (CL-2B, CL-6B).
По мнению ряда авторов, при использовании метода эпоксиактивации белок связывается с оксиран-сефарозой несколько прочнее, чем в остальных случаях, поэтому именно этот метод использовался нами для получения иммунносорбента.
Процесс синтеза на основе сефарозы путем ее эпоксиактивации включает в себя следующие основные стадии:
активация сефарозы эпихлоргидрином;
вторая активация амино-сефарозы — посадка спейсера;
конъюгирование белка;
блокирование непрореагировавших групп.
В результате проведенной работы был получен иммунно- сорбент для проведения аффинной хроматографии с целью выделения из фетальной сыворотки крови человека и очистки белка — альфа-фетопротеина. Количество конъюигоро- ванных антител составило 11 мг на 1 мл носителя. Емкость синтезированного сорбента составила 0,5 мг/мл, что позволяет использовать процесс иммунной сорбции для получения указанного белка в количестве, достаточном для серийного производства препарата.
Использование безинструментальных тест-систем для определения уровня специфических антител
М.Б. Раев, Е.Г. Орлова, О.Л. Горбунова,
М.С. Красных, С.Ю. Родионов
ЗАО «Институт новых медицинских технологий», г. Краснокамск
Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, г. Екатеринбург
Институт экологии и генетики микроорганизмов, УрО РАН, г. Пермь
При иммунизации животных тем или иным антигеном актуальна проблема количественной оценки уровня специфических антител. Широко используемый в настоящее время метод преципитации в геле по Оухтерлони имеет низкую чувствительность, что ограничивает его применение.
Целью работы стало конструирование и применение бе- зинструменальной тест-системы для определения количества специфических антител.
Козы иммунизировались альфа-фетопротеином (АФП) человека. Уровень специфических антител к АФП оценивали в «сэндвич» варианте дот-блотинга на непористой твердой фазе (полистирол) и пористой твердой фазе (нитроцеллюлоза). АФП сорбировали на твердой фазе. Затем твердофазные носители инкубировали в сыворотке иммунизированных коз. Положительным контролем служили очищенные козьи антитела против АФП человека. В качестве детектирующего реагента использовали конъюгат белка G с углеродом. Известно, что белок G обладает высокой аффинностью к иммуноглобулинам G человека, кролика, крысы, мышей и коз. Оценку результатов проводили визуально по черному окрашиванию зоны специфического связывания конъюгированного с углеродом белка G и козьих антител комплексиро- ванных с АФП. Параллельно титр специфических антител к АФП определяли методом преципитации в геле по Оухтер- лони по стандартной методике.
Полученные результаты позволяют заключить, что чувствительность предложенной системы значительно превосходит чувствительность метода преципитации в геле по Оух- терлони и позволяет выявлять иммуноглобулины G в концентрации до 1 нг/мл. Использование пористой твердой фазы повышает уровень чувствительности описываемой системы. Следует отметить, что разработанный вариант тест-системы является универсальным и позволяет количественно детектировать в сыворотке антитела человека, кролика, крысы, мышей и коз любой специфичности, а также выявлять примеси иммуноглобулинов G, контаминирующих препараты, получаемые из сыворотки крови.
Коррекция иммунных нарушений у больных язвенной болезнью 12-перстной кишки, ассоциированной с Helicobacter pylori иммуномодулятором трансфер-фактор плюс
А.Б. Рейзин, Ю.В. Тельных Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова
Целью нашего исследования явилось изучение эффективности препарата трансфер-фактор плюс™ (ТФП), являющегося БАД, производства фирмы «4-Life Research» (США), при проведении у 20 больных язвенной болезнью 12-перстной кишки (ЯБ12ПК) 10-дневной эрадикационной терапии Helicobacter pylori (Hp).
Пациенты с ЯБ12ПК в течение 10 дней получали омеп- разол по 20 мг 2 раза в день, амоксициллин по 2 г в день, кларитромицин по 1 г в день и ТФП по 2 капс. 3 раза в день, а затем последующие 20 дней по 1 капс. 3 раза в день. Контрольную группу из 15 человек составили больные, не получавшие ТФП. Все больные были комплексно обследованы с определением иммунного статуса до и после лечения.
До лечения у больных обеих групп отмечалось повышение в крови CD8, снижение количества CD16 (до 7,5 ± 0,5 %), после проведения эрадикации Нр у пациентов контрольной группы иммунный статус значительно ухудшился. В частности, уменьшилось содержание в крови нейтрофилов (40,0 ± 3,0 %), Т-лимфоцитов CD4, тогда как количество CD8 еще больше увеличилось (36,0 ± 2,0 %), в связи с чем иммунорегуляторный индекс стал ниже 1,0 (0,8 ± 0,08 %). В тоже время у больных основной группы, получавших ТФП, практически все показатели пришли к норме. Кроме того, у них на 4 дня раньше купировался болевой синдром и на 4,5 дня диспептический синдром, а также на 21,7 % увеличилась частота успешной эра- дикации Нр по сравнению с пациентами контрольной группы.
У больных ЯБ12ПК, ассоциированной с Нр и длительностью заболевания свыше 15 лет развивается вторичный иммунодефицит, который усугубляется проведением эрадика- ционной терапии антибиотиками. Включение в схему лечения ТФП приводит к нормализации показателей иммунного статуса.
Н.Б. Серебряная, М.А. Прокопьева, Н.В. Матвеев НИИ особо чистых биопрепаратов; Санкт-Петербургская Медицинская академия последипломного образования МЗ РФ; Городская больница № 26, Санкт-Петербург
Эритропоэтин (Epo) — один из первых цитокинов, получивших широкое клиническое распространение с середины 80-х гг. 20 века. Наличие у Epo свойств ростового фактора эритроидных клеток сделало его незаменимым препаратом для лечения анемий различного генеза. Однако в последнее десятилетие у Epo выявлен ряд принципиально новых свойств.
Продукция Epo и/или наличие рецептора к нему (Epo-R) выявлены в тканях головного и спинного мозга, сетчатки глаза, яичек, простаты, яичников, фоллопиевых труб, матки, плаценты, на клетках эндотелия, гемопоэтических неэритро- идных клетках и некоторых злокачественно трансформированных клетках [T.R. Lappin et al., 2002]. Взаимодействие Epo с его рецептором приводит к запуску многообразных клеточных ответов, таких как митогенез, хемотаксис, ангиогенез, мобилизация внутриклеточного кальция, а также ингибиция апоптоза и увеличение синтеза антиоксидантных ферментов [M.G. Weis, 2003].
Взаимодействие Epo с эндотелиальными клетками усиливает продукцию последними эндотелина-1, важного ангиоген- ного фактора [Cfrlini et al., 1995]. Epo стимулирует пролиферацию миоцитов сосудистой стенки, что может приводить к повышению резистентности сосудов и определять развитие гипертензии. В условиях гипоксии, дефицита нервного ростового фактора и воспаления Epo защищает нейроны от токсического действия глутамата и препятствует их апоп- тозу [Sasaki et al., 1995]. Наличие Epo-R на клетках Лейдига в тестикулярной ткани делает их чувствительными к введению экзогенного Epo, который стимулирует продукцию тестостерона, повышая его уровень в сперме, но не в циркуляции, вследствие чего секреция гонадотропина не угнетается [C. Foresta, 1996]. Чувствительными к Epo оказались также энтероциты тонкого кишечника. Интересно, что Epo, присутствуя в грудном молоке, модулирует интестинальную функцию новорожденных [Juul et al., 1999].
Выявление новых форм активности Epo способствовало изучению возможностей его использования для лечения рассеянного склероза, ишемических повреждений головного, спинного мозга и сетчатки глаза. Существуют результаты клинического использования Epo у 12 нейрохирургических больных с тяжелой черепно-мозговой травмой и острым нарушением мозгового кровообращения по геморрагическому типу. Результаты клинических исследований свидетельствуют, что Epo проявляет защитные свойства при аутоиммунных, воспалительных и гипоксических повреждениях ЦНС, что открывает новые области для его терапевтического применения.
Д.А. Кириллов, Е.Е. Халайчев Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург
Мобилизированные аутологичные стволовые клетки (МАСК) костного мозга способствуют репарации миокарда в зоне инфаркта, улучшая тем самым функцию сердца. Целью работы было изучение динамики изменения уровня МАСК, выброс которых стимулирован гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (G-CSF). 24 больным инфарктом миокарда (ИМ) (группа исследования) лечение проводили при помощи базовой терапии и терапии МАСК. 28 пациентам ИМ (группа контроля) проводилось традиционное лечение. Динамику изменения количества стволовых клеток крови оценивали по данным проточной цитометрии. Ее выполняли на проточном цитометре FACScan фирмы «Becton Dickinson» с использованием тройной комбинации прямых моноклоальных антител CD34FITC/CD38 PE/CD45 PerCP.
У 11 пациентов группы исследования отмечался Q-инфаркт миокарда, а у 13 не^-инфаркт миокарда. У больных ИМ исследовали уровень стволовых клеток периферической крови до лечения. Он составил по клеткам: CD34+CD38 + — 0,07 ± 0,02 %, CD34+CD38- — 0 % при Q-инфаркте миокарда. При не^-инфаркте миокарда: CD34+CD38+ — 0,15 ± 0,02 %, CD34+CD38- — 0,02 ± 0,001 %. После стимуляции G-CSF уровень стволовых клеток составил: CD34+CD38+— 0,71 ± 0,04%, CD34+CD38- — 0,58 ± 0,05 % (p < 0,0,001) — при Q-инфаркте миокарда. При не^-инфаркте миокарда после стимуляции G- CSF уровень клеток составил: CD34+CD38+ — 0,99 ± 0,03 %, CD34+CD38- — 0,75 ± 0,02 % (p < 0,05).
Таким образом, у больных ИМ в периферической крови в течение первых суток заболевания отмечено отсутствие стволовых клеток при Q-инфаркте миокарда и весьма незначительное количество при не^-инфаркте миокарда. Уровень МАСК, выброс которых стимулирован G-CSF, был выражен в обоих случаях ИМ, но больше при не^-инфаркте миокарда. Выброс стволовых клеток также наблюдался и в группе контроля, после стандартной терапии ИМ, но он был в 2,7 раза ниже. Включение в стандартную терапию инфаркта миокарда G-CSF позволяет избежать инвалидизации пациентов, полностью восстановить поврежденный орган. Содержание стволовых клеток в периферической крови больных ИМ является важным прогностическим признаком течения заболевания.
В.И. Масычева, П.Н. Мирошников НИИКТИ биологически активных веществ ГНЦ ВБ «Вектор», г. Бердск, Новосибирская обл.
В последние годы в лекарственной терапии ревматических заболеваний достигнуты определенные успехи за счет расширения арсенала лекарственных препаратов. Длительные клинические испытания показали, что перспективными средствами лечения являются препараты IFNy, как природные, так и полученные с использованием рекомбинантных технологий.. Однако использование препаратов IFNy существенно ограничено их малой доступностью и высокой степенью деградации в организме под действием протеаз крови, что обусловливает необходимость повторных введений препаратов в высоких дозах для поддержания эффективных концентраций. В ГНЦ ВБ «Вектор» разработана технология получения аналога рекомбинантного IFNy с повышенной устойчивостью к протеазам, препарата дельтаферон. Дельта- ферон представляет собой С-концевой делеционный мутант природного белка человека, экспрессируется в клетке E. coli
в растворимой форме, что значительно упрощает технологию получения и повышает выход целевого белка.
Целью данной работы являлось изучение иммуномодулирующей и противовоспалительной активности дельтаферона на модели экспериментального адъювантного артрита (АА).
В работе была использована лекарственная форма дель- таферона с содержанием основного белка 0,5 мг/мл и показателями специфической активности 5 х 105 ЕД/мг. Экспериментальный АА вызывали введением белым беспородным мышам 0,05 мл полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) в подошву правой задней лапы; в противоположную (контрольную) лапку вводили физиологический раствор. Дельтаферон вводили внутрибрюшинно в дозах 103 и 105 ЕД/мышь, через 24, 48 и 72 ч после индукции артрита. Препаратом сравнения был выбран нестероидный противовоспалительный препарат ортофен. Контролем служили животные, которым инъецировали физиологический раствор. Развитие воспаления тестировали по разнице в толщине опытной и контрольной лап, которую устанавливали с помощью микрометра МКО-25 мм.
Для оценки влияния препаратов на интенсивность воспалительной реакции, помимо регистрации клинических признаков, использовали иммунологические параметры. Функциональную активность макрофагов определяли с помощью спектрофотометрического варианта теста с нитросиним тетразолиевым (НСТ). Уровень восстановления НСТ макрофагами оценивали in vitro, при постановке спонтанного теста, а также в условиях активации метаболического дыхания, вызванного зимозаном. Пролиферативную активность лимфоцитов селезенки мышей исследовали с использованием МТТ-теста.
Было показано, что дельтаферон обладает способностью тормозить развитие локальной воспалительной реакции, вызванной введением ПАФ. Введение препарата мышам с АА приводило к изменению функционального состояния клеток иммунной системы, участвующих в реализации воспалительной реакции. В острой фазе процесса препарат снижал активность как перитонеальных макрофагов, так и лимфоцитов селезенки. Полученные данные позволяют предполагать, что дельтаферон, воздействуя на функциональное состояние иммунокомпетентных клеток, способен восстанавливать нарушенный баланс иммунных реакций и тем самым снижать активность воспалительного процесса, в том числе, и аутоиммунного характера.
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН;
ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН;
OOO «Центр инженерной иммунологии», г. Новосибирск
В настоящее время рекомбинантные цитокины широко используются в медицинской практике для лечения и коррекции различных патологий. IL-18 является важным регулятором врожденного и приобретенного иммунного ответа. Благодаря его биологическим свойствам IL-18 является весьма перспективным препаратом при терапии ряда серьезных заболеваний.
Целью данной работы являлось создание бактериального продуцента IL-18 на основе экспрессирующей системы E. coli.
Для выполнения этой задачи нами было проведено клонирование фрагмента кДНК кодирующего IL-18 человека (nIL18). Кроме этого, нами был синтезирован и клонирован синтетический ген IL18 (sIL18), оптимизованный под экспрессию в E. coli. Клонированные последовательности перенесли в плазмиду pET15b(+), позволяющую проводить экспрессию IL18 в виде гибридного белка, несущего N-терминальный Н^б-тракт и в плазмиду pET23b(+) для синтеза белка без дополнительных аминокислот, максимально приближенного к природному.
Для проведения экспрессии IL18 трансформировали штамм
coli BL21(DE) полученными рекомбинантными плазмидами. Для сравнения процентного содержания рекомбинантного белка при экспрессии sIL18 и nIL18 генов использовали плазмиды pET15b(+)sIL18, pET15b(+)nIL18, pET23b(+)sIL18, pET23b(+)nIL18. Полученные электрофореграммы оцифровывали и обсчитывали. При экспрессии pET23b(+)sIL18 нарабатывается около 34 % рекомбинантного белка IL-18 (от суммарного белка), тогда как в pET23b(+)nIL18 только 19 % (различия статистически достоверны). Не получено различий в уровне экспрессии «синтетического» и «природного» генов при использовании pET15b(+). Это можно объяснить наличием N-терминального гистидинового домена, который уже оптимизован под экспрессию в E. coli, а также доминирующим влиянием именно трансляции именно N-конца белка.
Также мы проводили сравнение уровня экспрессии IL18 в pET23b(+) совместно с плазмидой, кодирующей редкие для
coli т-РНК. При этом в pET23b(+)sIL18 количество рекомбинантного белка упало до 22 %, тогда как в pET23b(+)nIL18 выросло до 23%, т. е. выравнялось. Рекомбинантный IL-18 в клетках E. coli в основном накапливался в виде телец включения. Белок выделяли из телец включения после их отмывки и растворения в 10 М мочевине с помощью ионообменной и гидрофобной хроматографии. Далее рекомбинантный белок подвергали рефолдингу путем диализа с последовательным уменьшением концентрации денатурирующего агента с применением окисленного и восстановленного глутатиона или путем разбавления в буфере без денатурирующего агента.
Препарат рекомбинантного IL-18, как несущий N-терминальный Н^б-тракт, так и без дополнительных аминокислот обладал иммунохимической и биологической активностью.
Е.Н. Шамова, С.В. Сибиряк, Э.А. Нигматуллина Институт биохимии и генетики УНЦ РАН; Лаборатория иммунофармакологии и
иммунотоксикологии института иммунологии и физиологии УроРАН, г. Уфа
Изучено влияние рекомбинантного IL-2 (Ронколейкина) на пролиферативную активность, апоптоз в лимфоидных органах (тимус и селезенка) и морфо-функциональное состояния печени у интактных крыс линии WAG/Rij. При введении в диапазоне доз от 2,5 х 10б ЕД/кг до 5 х 105 ЕД/кг ронколей- кин не влиял на пролиферативную активность и апоптоз ти- моцитов (окрашивание йодистым пропидием с последующей проточной цитофлюориметрией FACSCalibur, BD). В дозе
х 10б ЕД/кг Ронколейкин снижал количество G0-G1 сплено- цитов и вызывал тенденцию к увеличению содержания SG2 М спленоцитов. При дальнейшем снижении дозы препарата появлялось тимус-стимулирующее действие рекомбинантного IL-2. В диапазоне доз от 2,5 х 105 ЕД/кг до 6 х 104 ЕД/кг рекомбинантный IL-2 вызвал тенденцию к снижению апоптоза тимоцитов и статистически значимое увеличение числа ми- тотически активных (SG2M) тимоцитов. Доза 6 х 104 ЕД/кг Ронколейкина вызвала тенденцию к увеличению апоптоза спленоцитов и статистически значимо снизило количество покоящихся спленоцитов и увеличение митотически активных клеток селезенки. Трехкратное ежедневное введение ронколейкина в дозе 1 х 105 ЕД/кг не вызвало изменении клеточного цикла тимоцитов и спленоцитов. Весовые коэффи- центы тимуса и селезенки значимо не изменялись.
При введении Ронколейкина в дозах от 6 х 104 ЕД/кг до
х 105 ЕД/кг морфологические изменения в печени носили примерно одинаковый характер. Отмечались умеренные дистрофические изменения цитоплазмы гепатоцитов (вакуолизация цитоплазмы вплоть до ее деструкции), хотя при этом ядра в клетках были неизмененными. Наблюдался стаз крови в расширенных синусоидах и сосудах портального тракта и центральных вен. Выявлялись отдельные мелкие лимфоцитарные инфильтраты. Также наблюдалась незначительная тенденция к увеличению массы печени. Напротив, при воздействии на крысу ронколейкина от 5 х 105 и выше (1 х 106 и
х 106 ЕД/кг) морфологических изменений паренхимы печени практически не наблюдались. Отмечалась гипертрофия
ядер отдельных гепатоцитов и незначительное увеличение количества двуядерных клеток при воздействии Ронколей- кина в дозе 5 х 106 ЕД/кг. Введение Ронколейкина во всем диапозоне доз не вызывало статистически значимых изменений содержания общего билирубина, активности аланина- минотрансферазы (АЛТ) в сыворотке крови и интенсивности гиперпироксидации печени (содержание МДА). Анализ фармакометаболизирующей функции (активности цитохром Р-450 зависимых монооксигеназ) не выявил статистически значимых отличии от контроля при введении препарата во всем диапазоне доз.
Клинико-иммунологическая эффективность гормона эпифиза мелатонина при стресс-индуцированных психонейроиммунных нарушениях
И.В. Ширинский, В.С. Ширинский ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск
В задачу работы входило изучение клинико-иммунологической эффективности применения синтетического аналога мелатонина (МЛТ) у лиц с психонейроиммунными нарушениями при хроническом стрессе.
В исследовании приняли участие 11 учителей общеобразовательных школ г. Новосибирска со стажем работы более
лет и признаками хронического психоэмоционального стресса и лабораторными признаками иммунодепрессии. Обследуемые были рандомизированы к приему МЛТ в дозе 3 мг в сутки (n = 6, опытная группа) или a-токоферола в дозе 200 мг
раза в день (n = 5, контрольная группа) непрерывно в течение месяца. Показано, что после лечения МЛТ статистически значимо повысилось содержание CD3+ клеток с 65 % (61 — 72) до 72 % (65 — 74), снизилось содержания IL-4 как в сыворотке (в двенадцать раз), так и в супернатантах культур мононуклеаров периферической крови (МНК ПК) (в пять раз). Положительная динамика показателей иммунного статуса ассоциировалась с улучшением психоэмоциональных параметров и вегетативных расстройств. В a-токоферола после лечения достоверных изменений показателей иммунного статуса, психоэмоциональной и вегетативной сферы выявлено не было.
Данные этого пилотного исследования свидетельствуют о том, что МЛТ может быть эффективным средством профилактики и лечения стресс-индуцированных изменений в иммунной системе.
Влияние гормона эпифиза мелатонина на пролиферацию мононуклеаров периферической крови и продукцию IL-4 и IFNy в модели стресса in vitro
И.В. Ширинский, В.С. Ширинский ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск
Изучалось влияние гормона эпифиза мелатонина (МЛТ) на кортизол-индуцированное снижение КонА-стимулированной пролиферации мононуклеаров периферической крови (МНК ПК) здоровых людей и вызванные кортизолом изменения продукции цитокинов профиля ТЫ-лимфоцитов — IFNy и Th2-лимфоцитов — IL-4. Показано, что кортизол угнетает продукцию IFNy КонА-стимулированными МНК ПК и не влияет на содержание IL-4 в супернатантах культур. МЛТ в физиологических концентрациях частично отменял вызванное кортизолом снижение КонА-индуцированной пролиферации МНК ПК. Этот эффект МЛТ не был сопряжен с изменением продукции IL-4 и IFNy. Показано, что стимулирующее действие МЛТ на пролиферативный ответ МНК ПК проявляется после ингибиции кальмодулина. Предполагается, что влияние МЛТ на иммунокомпетентные клетки является результатом двух сигналов — ингибирующего, опосредованного антикальмодулиновой активностью МЛТ, и активирующего, обусловленного взаимодействием МЛТ с мембранными рецепторами.
Роль ацетилхолина и С-реактивного белка в регуляции воспаления при индукции адъювантного артрита
Реализация холинергического противовоспалительного механизма подразумевает, что ацетилхолин (Ach), влияя на ре- тикулоэндотелиальную систему, модулирует активность реактантов острой фазы воспаления и функции иммунной системы, опосредуя эти эффекты через н-холинорецепторы (AchR) на лимфоцитах и других клетках иммунной и ретикулоэндотели- альной системы. Из опытов in vivo известно, что основной позитивный реактант острой фазы воспаления С-реактивный белок (CRP) изменяет физиологические функции Ach, в частности, его сосудистые реакции. Также известно, что при индукции у крыс артрита полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) содержание CRP в плазме крови увеличивается через 24 ч в
раза и остается на этом уровне до развития системного воспалительного ответа, но роль взаимодействия Ach и CRP в регуляции воспалительного ответа остается не изученной.
Целью работы явилось изучение на модели адъювантного артрита у крыс Wistar влияния фармакологической блокады периферических м-AchR с одновременной стимуляцией н-AchR и увеличением концентрации CRP на локальное и системное воспаление. Адъювантный артрит индуцировали введением ПАФ под апоневроз лап. Части крыс вводили метацин (2 мг/кг, за 40 мин до ПАФ) и неостигмин (0,02 мг/кг, за 15 мин до ПАФ). Как известно, блокада периферических м-AchR метацином под защитой ингибитора холинэстеразы неостигмина обеспечивает переключение ацетилхолина на преимущественную стимуляцию н-AchR, что позволяет рассчитывать на противовоспалительный эффект, т. к. стимуляция н-AchR подавляет синтез провоспалительных цитокинов (TNFa, IL-1p). Другой части крыс одновременно с ПАФ вводили очищенный CRP человека (1 мг/кг). Еще одна группа получала CRP вместе с комбинацией холинер- гических препаратов (метацина и неостигмина).
Результаты исследования показали, что усиление холинер- гического тонуса на фоне введения CRP при индукции адъювантного артрита существенно изменяет клиническую картину заболевания. На стадии локальной неспецифической воспалительной реакции (3 сут) комбинация метацина с неостигмином, повышающая концентрацию Ach в области н-AchR, или введение одного CRP мало влияли на отеки лап, но ускоряли развитие локального эпидермального некроза (до 20—26 % случаев) по сравнению с контролем (введением только ПАФ). Сочетанное введение холинергических препаратов вместе с CRP модифицировало сосудистую реакцию, приводя к существенному снижению отека лап и предупреждению некроза тканей: индекс реакции (ИР, %) снижался с 133 ±4 в контроле до 115 ± 3 (n = 10, р < 0,001). Что касается отека голеностопных суставов, то блокада м-AchR с одновременной стимуляцией н-AchR приводила к его увеличению на 3 сут с 68 ± 4 в контроле до 93 ± 4 (n= 10, р < 0,001) — возможно, за счет стимуляции аце- тилхолином н-AchR аутореактивных Т-лимфоцитов. В отличие от этого, введение одного CRP при индукции артрита приводило к снижению воспаления суставов на 3 сут ниже контроля (до 57 ± 2, n = 10, р < 0,01). Введение CRP в сочетании с холинергическими препаратами снижало артритную реакцию на
сут по сравнению с холинергическими препаратами (до 75 ± 2, n = 10, р < 0,01), возможно, за счет взаимодействия CRP с Ach.
Вместе с тем, на специфической стадии локального воспаления (7-е сутки), при системном ответе (14—21-е сутки) и на пике артрита (25—28-е сутки) влияние холинергических препаратов или CRP сказывалось в существенном уменьшении отека лап и суставов и снижении степени некрозов. Наиболее выраженный противовоспалительный эффект получен при сочетанном введении холинергических препаратов и CRP.
Таким образом, взаимодействие Ach и CRP проявляется в усилении противовоспалительного эффекта на всех стадиях патологического процесса, начиная с самой ранней, в получении более выраженного противоартритного эффекта со снижением отека мягких тканей лап и суставов и предупреждением некроза тканей.
Ответственность за достоверность информации, содержащейся в рекламных материалах, несут рекламодатели.
Издание Северо-Западного отделения РАМН и Российского цитокинового общества. Журнал зарегистрирован в Министерстве Российской Федерации по делам печати, телерадиовещания и средств массовых коммуникаций. ПИ № 77-11439 от 21 декабря 2001 г. Рассылка целевая.
Журнал включен ВАК Минобразования РФ в «Перечень периодических научных изданий, рекомендуемых для публикации научных работ, отражающих основное научное содержание докторских диссертаций».
Подписка осуществляется:
через Агентство «Роспечать». Годовой индекс — 81745, полугодовой — 81395.
через ООО «Корпоративная Почта». Тел.: (095) 953-92-62, 953-93-20.
Адрес редакции: 194100, Санкт-Петербург, Кантемировская ул., д. 7, оф. 1412, тел./факс: (812) 331-79-41, 245-47-93. E-mail: ,
Подписано в печать 13.06.05. Формат бумаги 60 x 901/8. Печать офсетная. Отпечатано с готовых диапозитивов в типографии «Белл». Тираж
1. Мезенцева М.В., Наровлянский А.Н., Щербенко В.Э. и др. Оценка интерфе- ронового статуса и цитокинового профиля у больных генитальным герпесом // Rus. J. Immunol. — 2002. —• Vol. 7, № 2. — P. 167-174.
3. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thyocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. — 1987. — Vol. 162, № 1. — Р. 156-159.
4. Gaede K.I., Mamat U., Schlaak M. et al. Analysis of differentially regulated mRANs in monocytic cells induced by in vitro stimulation // J. Mol. Med. — 1999. — Vol. 77, № 12. — Р. 847-852.
5. Gelder С.М., Thomas P.S., Yates D.H. et al. Cytokine expression in normal, atopic, and asthmatic subject using the combination of sputum induction and the polymerase chain reaction // Thorax. — 1995. — Vol. 50, № 10. — P. 1033-1037.
6. Granados-Loarca E.A., Estrada-Barrondo E.A. Tratamiento del herpes genital con interferon alfa-2b. [Treatment of genital herpes with alfa-2b interferon] // Actas Urol. Esp. — 2000. — Vol. 24, № 5. — Р. 388-392.
7. Halford W.P., Gebhardt B.M., Carr D.J. Persistent cytokine expression in trigeminal ganglion latently infected with herpes simplex virus type 1 // J. Immunol. — 1996. — Vol. 157, № 8. — Р. 3542-3549.
8. Han X., Lundberg P., Tanamachi B. et al. Gender influences herpes simplex virus type 1 infection in normal and gamma interferon-mutant mice // J. Virol. —