Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова;
Городская инфекционная больница № 2, Нижний Новгород;
Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского
С помощью иммуноферментного метода исследовано сывороточное содержание растворимых антигенов CD50 (ICAM-3), CD95 (Fas) и растворимых молекул HLA I класса в сыворотке крови больных манифестными и инаппарантными формами гепатита А. Обнаружено многократное статистически достоверное повышение их содержания, превышающее уровень данных антигенов при вирусных гепатитах В и С. У реконвалесцентов нормализовался только уровень растворимого CD95-антигена. Содержание растворимого антигена CD50 и молекул HLA I класса оставалось увеличенным. Предполагается, что высокий уровень тестированных растворимых антигенов при вирусном гепатите А отражает напряженность иммунного ответа с последующим его самоограничением, что приводит к сравнительно быстрой и эффективной санации организма. (Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 3. С. 25-27.)
Вирусный гепатит А — кишечная инфекция с фекально-оральным механизмом передачи возбудителя. Для гепатита А характерны сравнительная легкость течения, редкое развитие тяжелых форм, быстрое купирование инфекционного процесса с ранней реконвалесценцией и полным выздоровлением в сроки до 2 мес. от начала болезни без угрозы хронизации. Быстрый интенсивный иммунный ответ блокирует репликацию вируса, ограничивает его дальнейшее распространение на неинфицированные гепатоциты [5, 7].
Важную роль в реализации иммунного ответа на вирусные агенты играют молекулы гистосовместимости I класса, белки адгезии, в частности, антиген ICAM-3 (CD50), участвующий в инициации иммунного ответа, и антиген CD95 (Fas), опосредующий апоптоз. Наряду с мембранными антигенами в осуществлении иммунных реакций принимают участие растворимые формы вышеприведенных антигенов. Они образуются в результате протеолитического отщепления мембранных антигенов с поверхности клетки либо за счет альтернативного сплайсинга матричной РНК, приводящего к продукции растворимой формы мембранного антигена [3]. Обнаружено изменение сывороточного содержания растворимых антигенов CD50 и CD95 и молекул HLA I класса при вирусных гепатитах В, С и G, свидетельствующее об их участии в развитии данных заболеваний [4, 9]. Целью работы явилось исследование сывороточного уровня растворимых антигенов CD50, CD95 и молекул HLA I класса при вирусном гепатите А.
В работе использовали образцы сыворотки крови 66 больных манифестной формой гепатита А, 33 — инаппарантной, 40 — реконвалесцентов и 80 — здоровых доноров. Диагноз гепатита А был подтвержден путем дополнительного определения антител класса IgM против вируса гепатита А, содержание которых определяли с помощью иммунофермент- ной тест-системы фирмы «Вектор-Бест». Образцы сыворотки больных с признаками аутоиммунных заболеваний в анамнезе в работе не использовали. Больные проходили лечение в городской инфекционной больнице № 2 Нижнего Новгорода. Образцы сыворотки крови доноров были получены из Нижегородской областной станции переливания крови.
Сывороточное содержание растворимых антигенов ICAM-3 (sCD50), CD95 (sCD95) и растворимых молекул HLA I класса (sHLA-I) определяли иммуноферментным методом с использованием моноклональных антител серии ИКО и поликлональных антител, направленных против антигенов мононуклеарных клеток периферической крови человека. Для определения антигенов sCD50 и sCD95 поликлональные антитела в объеме 100 мкл сорбировали в лунки планшетов в течение 24 ч при температуре 18-22 °С. Для определения антигенов sHLA-I в лунки планшетов вносили по 100 мкл раствора моноклональных антител ИКО-53 против тяжелой цепи антигенов HLA I класса [2] с последующей инкубацией планшетов в тех же условиях. Не- связавшиеся антитела 5-кратно отмывали фосфатно-солевым раствором (ФСР-Т), содержащим 0,9 % NaCI, 0,1 % Na2HPO4 и
1 % твина-80. Затем в лунки вносили исследуемые образцы сыворотки крови с последующей инкубацией планшетов в течение 16-18 ч при 25 °С во влажной камере. Потом планшеты отмывали ФСР-Т, как указано выше, и в лунки добавляли по 100 мкл рабочего раствора конъюгированных с пероксидазой хрена моноклональных антител и инкубировали 1 ч при 37 °С. Для определения антигенов sCD50, sCD95 и sHLA-I использовали конъюгаты, содержащие моноклональные антитела ИК0-60, ИК0-160 и моноклональные антитела ИКО-216 (против р2-мик- роглобулина), соответственно [1]. После отмывания несвязав- шегося конъюгата реакцию проявляли раствором 0,1%-ного ортофенилендиамина в 0,05 М цитратном буферном растворе, рН 5,0, содержащем 0,01 % перекиси водорода и через 20 мин останавливали 5%-ным раствором Н2SO4. Учет результатов проводили спектрофотометрически, при длине волны 492 нм с использованием фотометра АИФ-М/340. Сывороточные уровни растворимых антигенов оценивали, переводя единицы оптической плотности в условные единицы (ЕД/мл), используя рас- титровку положительной контрольной сыворотки.
Статистическую обработку результатов проводили при помощи программы Biostat с использованием критериев Стью- дента, Крускала—Уоллиса и Манна—Уитни.
У здоровых доноров сывороточный уровень растворимого CD50-антигена составил 301,5 ± 67,0 ЕД/мл, у больных манифестной формой гепатита А —
± 145,1 ЕД/мл, что в 4,2 раза превышает его сывороточное содержание у здоровых доноров (р < 0,05). При инаппарантной форме гепатита А сывороточный уровень растворимого CD50-антигена был в 3,6 раза выше нормы (р < 0,05). В образцах сыворотки крови реконва- лесцентов средний уровень растворимого антигена sCD50 был повышен в 1,8 раза (р < 0,05) (табл. 1). У больных манифестной формой гепатита А содержание антигена sCD50 было в 2,4 раза выше, чем у реконвалесцентов, а при инаппарантной форме — в 2,0 раза (р < 0,05).
Сывороточный уровень молекул HLA I класса (sHLA-I) у здоровых доноров равнялся
± 197,8 ЕД/мл. При манифестной форме вирусного гепатита А их сывороточное содержание увеличивалось в три раза и составляло
± 564,4 ЕД/мл. Инаппарантная форма приводила к повышению сывороточного содержания sHLA-I в 2,2 раза. Реконвалесценция не приводила к снижению сывороточного уровня sHLA-I; сывороточный уровень sHLA-I статистически достоверно не отличался от уровня при манифестной и инап- парантной формах. Содержание растворимого антигена CD95 (sCD95) в сыворотке крови здоровых доноров составляло 346,5 ± 60,3 ЕД/мл.
Манифестная форма гепатита А сопровождалась увеличением уровня антигена sCD95 в 2,9 раза (р < 0,05). Инаппарантная форма характеризовалась повышением сывороточного уровня антигена sCD95 в 2,8 раза (р < 0,05) и составляла 972,3 ± 294,7 ЕД/мл. У реконвалесцентов содержание антигена sCD95 снижалось до
± 180,7 ЕД/мл. Статистически достоверных различий между здоровыми донорами и реконва- лесцентами не было выявлено.
Полученные результаты показывают, что как манифестная, так и инаппарантная формы вирусного гепатита А характеризуются значительным статистически достоверным повышением сывороточного содержания растворимых антигенов CD50, CD95 и молекул HLA I класса. У реконвалесцентов сывороточный уровень антигена sCD95 падает до нормы, но содержание sCD50 и sHLA-I остается повышенным.
Известно, что антиген CD50 в мембранной форме так же, как и молекулы HLA I класса, участвует в инициации иммунного ответа. Содержание их растворимых форм в биологических жидкостях можно рассматривать как показатели выраженности процессов инициации иммунного ответа. С другой стороны, они функционально выполняют роль ограничителей (блокаторов) иммунного ответа. Увеличение концентрации sCD50 в биологических жидкостях может приводить к ингибированию взаимодействия молекул DC-SIGN (CD209) и LFA-1 с мембранной формой !САМ-3, блокируя тем самым адгезию покоящихся лимфоцитов на антиген-презентирующих дендритных клетках. Следствием этого могут явиться изменения в уровне активации Т-клеток.
Растворимые молекулы HLA I класса, повышенная концентрация которых формируется в результате активации клеток иммунной системы, могут связываться с молекулой CD8 на мембране активированных CD8+ Т-лимфоцитов и вызывать секрецию растворимого Fas-лиганда, запускающего, в свою очередь, апоптоз CD8+CD95+ Т-клеток. Растворимые молекулы HLA I класса играют т. о. существенную роль в контроле за экспансией CD8+ цитотоксических клеток [10]. Кроме того, молекулы sHLA-I взаимодействуют с мембранным CD8- антигеном, и КШ-рецепторами натуральных киллеров, что также приводит к продукции растворимого Fas-лиганда с последующим запуском апоптоза CD95-положительных клеток [8, 11].
Высокий сывороточный уровень sCD50-антигена и молекул sHLA-I отражает активное привлечение клеточного звена иммунитета для защиты организма. Следствием является быстрая элиминация вируса из организма и выздоровление без угрозы хро- низации. Сохранение повышенного уровня sCD50 и sHLA-I у реконвалесцентов свидетельствует о стойком ограничении инициации иммунного ответа.
Повышенный уровень ингибирующего апоптоз sCD95-антигена у больных вирусным гепатитом А свидетельствует об активации процессов, направленных на защиту гепатоцитов от цитоток- сического действия МК и CD8+ Т-клеток. Последующее падение содержания антигена sCD95 у реконвалесцентов до уровня здоровых доноров указывает, в свою очередь, на нормализацию апоптотических процессов гепатоцитов.
Обращает на себя внимание более значительное повышение сывороточного содержания антигенов sCD50, sCD95 и молекул sHLA-I при манифестной и инаппарантной формах гепатита А в сравнении с вирусными гепатитами В и С. Если при манифестном и инаппарантном гепатите А уровень антигена sCD50 статистически достоверно повышался в 4,2 и 3,6 раза, соответственно, то, по результатам наших предыдущих исследований, при гепатитах В и С он поднимался не выше, чем в 2,3 раза (хронический гепатит С). Сходным образом при гепатитах В и С изменялось содержание растворимых молекул HLA I класса, в то время как при манифестном гепатите А их уровень увеличивался в 3 раза. Аналогичным образом при гепатите А происходит более значительное повышение уровня антигена sCD95 [4, 9].
Интересным представляется также сравнение сывороточного уровня антигенов sCD50, sCD95 и молекул sHLA-I при гепатите А и вирусном гепатите G, характеризующемся длительной пер- систенцией вируса без развития иммунного ответа и без клинических проявлений с последующей самопроизвольной санацией организма. Как показано нами ранее, сывороточный уровень антигенов sCD50 и sCD95 у лиц, инфицированных вирусным гепатитом G, повышался в такой же мере, как и при вирусном гепатите А [4, 6]. Однако содержание sHLA-I не только не повышалось, но имело тенденцию к снижению, что, с нашей точки зрения, свидетельствует о недостаточности процессов инициации иммунного ответа, с чем, видимо, связана длительная бессимптомная персистенция вируса гепатита G в организме. Высокий уровень всех трех тестированных растворимых антигенов при вирусном гепатите А отражает напряженность иммунного ответа с последующим его самоограничением, что приводит к сравнительно быстрой и эффективной санации организма.
Contini P., Ghio M., Poggi A. et al. Soluble HLA-A,-B,-C and -G molecules induce apoptosis in T and NK CD8+ cells and inhibit cytotoxic T cell activity through CD8 ligation // Eur. J. Immunol. — 2003. — Vol. 33, № 1. — Р. 125-134.
Ptitsyna Yu.S., Bornyakova L.A., Baryshnikov A.Yu. et al. A soluble form of Fas/ Apo-1 (CD95) antigen in the serum of viral hepatitis patients // Int. J. Immu- norehabil. — 1999. — № 14. — P. 110-110.
Puppo F., Contini P., Ghio M. et al. Soluble human MHC class I molecules induce soluble Fas ligand secretion and trigger apoptosis in activated CD8+ Fas (CD95)+ T lymphocytes // Int. Immunol. — 2000. — Vol. 12, № 2. — Р. 195-203.
Spaggiari G.M., Contini P., Dondero A. et al. Soluble HLA class I induces NK cell apoptosis upon the engagement of killer-activating HLA class I receptors through FasL-Fas interaction // Blood. — 2002. — Vol. 100, № 12. — Р. 4098-4107.
V. Evsegneeva, E.A. Manakova, V.V. Novikov,A.V. Karaulov1 1 I.M. Sechenov Moscow Medical Academy; 2 The 2nd City Isolation Hospital, Nizhni Novgorod;
Nizhni Novgorod State University
The level of soluble CD50 (ICAM-3) and CD95 (Fas) antigens and HLA class I molecules in serum of patients with manifestative and inapparent forms of viral hepatitis A has been determined by ELISA. A multifold statistically significant increase of soluble antigens level exceeding the level of these antigens in viral hepatitis B and C was revealed. At convalescence the serum level of soluble CD95 antigen was normal while the contents of soluble CD50 antigen and HLA class I molecules remained elevated. It is suggested that high levels of aforesaid soluble antigens in viral hepatitis A reflect the tension of immune response which leads to comparatively quick and effective elimination of viral agent. (Cytokines and Inflammation. 2005. Vol. 4, № 3. P. 25-27.)
Key words: viral hepatitis A, soluble CD50 (ICAM-3), soluble CD95 (Fas), soluble HLA class I molecules.