загрузка...
 
Морфометрическое исследование клеток иммунорегуляторного и эффекторного звеньев иммунитета в аорте и парааортальных лимфатических узлах при атерогенезе у человека
Повернутись до змісту

Морфометрическое исследование клеток иммунорегуляторного и эффекторного звеньев иммунитета в аорте и парааортальных лимфатических узлах при атерогенезе у человека

 

П.В. Пигаревский

ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург

 

Целью работы явилось изучение иммунорегуляторного и эффекторного звеньев иммунитета в динамике атеросклероза у человека. Иммуноморфологическое и морфометрическое исследования с использованием моноклональных антител к различным субпопуляциям Т- и В-лимфоцитов показали, что в возрастной группе 31-60 лет по мере прогрессирования атеросклероза в интиме и адвентиции аорты, а также в Т-зоне регионарных к этим участкам сосуда парааортальных лимфатических узлов резко увеличивается численность Сй4+ лимфоцитов и НЬА-йК/ мононуклеар-ных клеток при неизменном содержании Сй8+ лимфоцитов. Указанные изменения сопровождаются увеличением численности 1дС-синтезирующих В-лимфоцитов в тех же участках сосудистой стенки и в В-зоне парааортальных лимфатических узлов. В селезенке, периферическом лимфо-идном органе, отдаленном от аорты, отмеченные выше иммуноморфологические перестройки отсутствуют. Полученные данные указывают на возможные механизмы и новые специфические черты развития иммунного воспаления в динамике атеросклероза у человека.

Ключевые слова: атерогенез, парааортальные лимфатические узлы, Т- и В-лимфоциты.

В начале 90-х гг. была обоснована концепция, позволяющая рассматривать становление и развитие атеросклеротических поражений артерий с позиций развития иммунного воспаления в сосудистой стенке [2, 8]. Центральным положением о возможной роли аутоиммунитета в атерогенезе является определение природы антигенов и характера клеточных взаимодействий.

В настоящее время установлено, что модифицированные путем перекисного окисления (окси-генации) липопротеиды низкой плотности (мЛПНП) присутствуют в большом количестве в интиме артерий уже на ранних стадиях атероге-неза и активируют экспрессию лейкоцитарных адгезивных молекул [11, 12, 13]. Это является стимулом для миграции в места отложения мЛПНП моноцитов, а также Т- и В-клеток и продукции антител in situ [1, 5, 7, 17]. Показано, что в атеро-склеротических бляшках присутствует большое число CD4+ Т-клеток и макрофагов, что послужило основанием для утверждения о важной роли клеточного иммунитета в атерогенезе [6, 10, 16]. Более того, получены факты, которые позволяют считать, что Т-клетки могут выступать инициаторами иммунного воспаления при атерогенезе в ответ на мЛПНП, а их медиаторы — как растворимые, так и контактзависимые — играть решающую роль в формировании атеросклеротических поражений артерий [4, 18]. Вместе с тем, оставалось неясным, что вызывает активацию СБ4+ Т-клеток (и где она происходит) и формирование эффекторных иммуноглобулинсинтезирующих В-лимфоцитов, которые обнаруживаются в зоне атеросклеротических поражений. Неясным оставался также вопрос, в какой степени периферические органы иммунной системы вовлечены в этот процесс — является ли аутоиммунный ответ на мЛПНП местной реакцией сосудистой стенки или он носит генерализованный характер.

Целью настоящей работы явилось изучение иммунорегуляторного и эффекторного звеньев иммунитета в динамике атеросклероза у человека. Были проведены сравнительное иммуномор-фологическое и морфометрическое исследования хрена (Dako). IgG в В-лимфоцитах выявляли с помощью прямого метода Кунса с использованием козлиных моноспецифических антител (Sigma, USA), меченных пероксидазой хрена и ФИТЦ. Для контроля специфичности свечения в качестве промежуточной наносили неиммунную сыворотку, а в качестве меченой — антисыворотку несоответствующей специфичности.

Препараты просматривали в световом микроскопе Axiomat (Opton, Germany) и в люминесцентном микроскопе МЛ-4 с входными светофильтрами ФС1-2 и СЗС7-4, запирающим фильтром ЖЗС19-ЖС18.

Проводили морфометрический подсчет CD4+, CD8+ и HLA-DR+ Т-клеток в паракортикальной зоне лимфатических узлов и в Т-зоне белой пульпы селезенки, а IgG-синтезирующих В-лим-фоцитов — в мозговых тяжах лимфатических узлов и В-зоне белой пульпы селезенки, не содержащей лимфоидных фолликулов с герминативными центрами. Кроме этого, все перечисленные выше клеточные формы подсчитывали в интиме и ад-вентиции аорты. Численность изучаемых клеток определяли в 10 полях зрения светового микроскопа без морфометрической сетки (об. х 100, ок. х 10 ) и их количество выражали в абсолютных числах. Значимость различий между изучаемыми выборками определяли с помощью t-критерия Стъюдента.

 

Результаты и обсуждение

 

В результате проведенного исследования удалось установить, что в возрастной группе 31-60 лет в Т-зоне парааортальных лимфатических узлов, контролирующих сегменты аорты с начальными изменениями, в 2 раза (p < 0,05) по сравнению с нормой увеличивается число CD4+ Т-клеток (табл. 1, 2). В еще большей степени этот процесс оказывается выражен в узлах, регионарных к участку аорты с фиброзной бляшкой, где содержание CD4+ Т-лимфоцитов возрастает в 3 раза (p < 0,05) по сравнению с нормой и почти в 1,5 раза по сравнению с начальной стадией (табл. 3, рис. 1, а, б). В возрастной группе 61-75 лет изменения численности хелперных лимфоцитов носят аналогичный характер, но выражены они в меньшей степени (см. табл. 1-3). Важно, что одновременно в Т-зоне парааортальных лимфатических узлов в обеих возрастных группах, но особенно резко у лиц в группе 31-60 лет, увеличивается рециркуляционная и миграционная активность лимфоцитов, о чем свидетельствует появление в паракортикальной зоне многочисленных посткапиллярных венул с резко расширенными просветами, заполненными лимфоидными клетками (рис. 1, в).

В отличие от хелперных лимфоцитов, достоверное изменение численности CD8+ Т-клеток (цито-токсических/супрессорных) обнаруживается в Т-зоне парааортальных лимфатических узлов только на выраженной стадии атерогенеза в возрастной группе 31-60 лет, где их содержание более чем в 2 раза (p < 0,05) снижается по сравнению как с нормой, так и с начальной стадией заболевания (см. табл. 1-3).

а, б — иммунопероксидазный метод с докраской ядер гематоксилином. х 1000; в етиловым-зеленым и пиронином по Браше. х 400.

В отличие от парааортальных лимфатических узлов, в Т-зоне селезенки колебания численности CD4+ и CD8+ Т-клеток на разных стадиях заболевания были незначительными и практически не отличались от нормального уровня (см. табл. 1-3).

Полученные данные свидетельствуют об изменении численного состава среди иммунорегуля-торных субпопуляций Т-лимфоцитов в регионарных к местам атеросклеротических поражений лимфатических узлах. Причиной этих изменений могут быть как мЛПНП, так и неоантигены из сосудистой стенки. Увеличение содержания CD4+ Т-клеток в Т-зоне лимфатических узлов, как правило, связано с начальной стадией иммунного ответа и предшествует иммуноморфологическим перестройкам в В-зоне [5]. Кроме этого, образующиеся в Т-зоне CD4+ Т-лимфоциты могут поступать в местный воспалительный очаг, способствуя развитию иммуновоспалительных реакций in situ [16]. Поэтому на следующем этапе работы важно было провести иммуноморфологическое исследование сосудистой стенки.

Одновременно с изменениями в регионарных лимфатических узлах существенные клеточные перестройки наблюдаются в контролируемых ими участках сосудистой стенки. Так, в возрастной группе 31-60 лет на начальной стадии в интиме аорты с липидными пятнами численность СБ4+ Т-лимфоцитов возрастает в 3,3 раза (р < 0,05) по сравнению с нормой, а на выраженной стадии, преимущественно в транзиторной зоне и в основании липидно-фиброзных бляшек, — в 6 раз (р < 0,05; рис. 2, а, б). Интересно, что не только в интиме, но и в подлежащих участках адвентиции на начальной стадии — в 2 раза (р < 0,05), а на выраженной — в 2,6 раза (р < 0,05) по сравнению с нормой также увеличивается число СБ4+ Т-кле-ток (см. табл. 1-3). В возрастной группе 61-75 лет изменения выражены в меньшей степени. В отличие от хелперных лимфоцитов, достоверных изменений численности СБ8+ Т-клеток в стенке аорты на разных стадиях атерогенеза по сравнению с неизмененными участками сосуда установить не удалось (см. табл. 1-3).

Обнаружение Т-клеток в очагах атерогенеза еще не дает основания утверждать, что они иммунологически активны. Этот вопрос может быть решен при анализе на поверхности активированных Т-лимфоцитов белков, отсутствующих у клеток в норме, таких, как НЬЛ-БИ, БО [15]. Выяснение этого вопроса важно, поскольку известно, что только активированным Т-лимфо-цитам макрофаги могут презентиро-вать местные антигены и только активированные Т-клетки могут принимать участие в эффектор-ном звене реакций типа ГЗТ [3]. Следует отметить, что НЬЛ-БИ и НЪА-БО-антигены могут экспрес-сироваться не только активированными Т-лимфо-цитами, но и моноцитами/макрофагами, и на основании иммуногистохимических реакций их разделение не представляется возможным. Поэтому клетки, у которых были выявлены эти антигены, мы называем в дальнейшем мононуклеарными клетками. Используя моноклональные антитела против НЬЛ-БИ антигена, удалось установить, что в интиме и адвентиции неизмененных участков сосуда мононуклеарные клетки, экспрессиру-ющие НЬЛ-БИ, отсутствуют полностью (см. табл. 1). По мере прогрессирования атеросклероза их удается выявить в основном только в возрастной группе 31-60 лет и только в интиме аорты (рис. 3, а; см. табл. 2, 3).

Не исключено, что активация мононуклеарных клеток происходит непосредственно в сосудистой стенке, хотя вполне вероятно, что этот процесс начинается в регионарных лимфатических узлах. Результаты проведенных исследований показали, что в норме в Т-зоне парааортальных лимфатических узлов число активированных мононукле-арных клеток невелико (см. табл. 1). По мере про-грессирования атерогенеза, одновременно с ростом общего числа СБ4+ Т-клеток увеличивается содержание активированных мононуклеаров, причем только в возрастной группе 31-60 лет (рис. 3, б). Так, на начальной стадии количество эк-спрессирующих НЬЛ-БИ мононуклеарных клеток в Т-зоне парааортальных лимфатических узлов возрастает в 3 раза (р < 0,05) по сравнению с нормой, а на выраженной стадии — в 4 раза (р < 0,05; см. табл. 1-3). В возрастной группе 61-75 лет численность этих клеток крайне мала и не подвержена количественным изменениям.

В Т-зоне белой пульпы селезенки колебания численности НЬЛ-БИ-позитивных клеток на разных стадиях заболевания практически не отличаются от нормального уровня, а в В-зоне всех изученных периферических лимфоидных органов эти клетки не обнаруживаются (см. табл. 1-3).

Регуляторный потенциал лимфоцитов мы рассматриваем как важное звено атерогенеза. Известно, что от функционального состояния иммуноре-гуляторных лимфоцитов напрямую зависит эф-фекторное звено иммунитета. Анализ структурных компонентов В-зоны парааортальных лимфатических узлов показал, что на начальной стадии заболевания в поверхностной части коры и мозговом слое число ^О-продуцирующих В-клеток возрастает в 4 раза (р < 0,05) по сравнению с нормой, а на выраженной стадии — в 5 раз (р < 0,05) (см. табл. 1-3, рис. 4, в). В отличие от лимфатических узлов, в В-зоне белой пульпы селезенки содержание функционально активных В-лимфоцитов практически не отличается от нормального уровня.

В аорте функционально активные В-лимфоци-ты обнаруживаются редко, их численность составляет в среднем менее 1 % от общего количества клеток интимы [2]. Наши морфометрические данные подтверждают этот факт, и тем не менее, прежде всего в возрастной группе 31-60 лет, на начальной и особенно на выраженной стадиях атеросклероза в интиме аорты и подлежащих участках адвентиции ]^О-продуцирующие лимфоциты встречаются чаще, чем в неизмененной сосудистой стенке (см. табл. 1-3; рис. 4, а, б). В возрастной группе 61-75 лет изменения носят аналогичный характер, но проявляются в меньшей степени; исключение составляет адвентиция аорты на выраженной стадии атеросклероза (см. табл. 3).

Не исключено, что увеличение численности им-муноглобулин-продуцирующих лимфоцитов в па-рааортальных лимфатических узлах и стенке сосуда в самой начальной стадии атерогенеза связано с развитием иммунного ответа на образующиеся аутоантигенные формы мЛПНП. В дальнейшем, по мере формирования атеросклероти-ческих поражений артерий, к этому процессу, по-видимому, присоединяется развитие сенсибилизации к антигенам сосудистой стенки.

Заключение 

Таким образом, в результате проведенного исследования на начальной и выраженной стадиях атерогенеза выявлен сочетанный характер изменений в лимфатических узлах и контролируемых ими участках сосудистой стенки. В парааорталь-ных лимфатических узлах обнаружены иммуно-морфологические перестройки, свидетельствующие о развитии иммунного ответа. В Т-зоне узлов резко увеличивается содержание CD4+ Т-лимфо-цитов при одновременном росте численности активированных мононуклеарных клеток, экспрес-сирующих HLA-DR-антиген, усиливается рециркуляционная и миграционная активность лимфо-идных клеток, причем эти изменения происходят на фоне резкого увеличения в В-зоне числа функционально активных В-лимфоцитов, продуцирующих IgG.

Одновременно в интиме и адвентиции аорты в зоне атеросклеротических поражений обнаружено достоверное увеличение численности CD4+ Т-клеток, активированных мононуклеаров, эксп-рессирующих HLA-DR, и IgG-синтезирующих В-лимфоцитов при неизменном содержании CD8+ Т-клеток. Как в аорте, так и в парааортальных лимфатических узлах в наибольшей степени им-муноморфологические перестройки были выражены в возрастной группе 31-60 лет. Такой характер изменений может свидетельствовать в пользу гипотезы, высказанной G.K. Hansson и S. Stemme [9, 14], о том, что В-клеточный ответ зависит от Т-клеточной реакции и присутствующие в атерос-клеротических очагах CD4+ лимфоциты могут инициировать аутоиммунный ответ к мЛПНП.

До сих пор было неясно, где конкретно происходит активация CD4+ Т-клеток и где образуются IgG-синтезирующие В-лимфоциты при атеро-генезе. После изучения участков аорты и регионарных к ним групп лимфатических узлов можно предполагать, что после контакта с антигеном, наряду с другими мононуклеарами, активация

Т-клеток, и, скорее всего СБ4+ Т-лимфоцитов, происходит в Т-зоне именно параортальных лимфатических узлов. Учитывая высокую рециркуляционную активность этих узлов на начальной и выраженной стадиях атерогенеза, вполне вероятно, что активированные и неактивированные СБ4+ Т-клетки из Т-зоны, а также ]^О-продуци-рующие В-лимфоциты из В-зоны мигрируют в соответствующие участки сосудистой стенки.

На основании изложенного можно заключить, что наиболее выраженные и существенные клеточные перестройки происходят в регионарных к аорте лимфатических узлах и коррелируют с тяжестью атеросклеротических поражений интимы сосуда. Можно полагать, что эти реакции тесно связаны с особенностями развития иммунного воспаления в липидных пятнах и атеросклеротичес-ких бляшках.

 

 

ЛИТЕРАТУРА

Климов А.Н., Нагорнев В.А. О необычном пути выведения клеткой синтезированного белка // Бюл. эксперим. биол. — 1996. — № 9. — С. 268-270.

Нагорнев В.А. Атерогенез и иммунное воспаление // Бюл. эксперим. биол. — 1996. — № 7. — С. 4-8.

Нагорнев В.А., Анестиади В.Х., Зота Е.Г. Атерогенез (аспекты патобиоло-гии). — Кишинев-Санкт-Петербург, 2001. — 330 с.

Нагорнев В.А., Кетлинский С.А. Клеточно-молекулярные механизмы становления и развития атерогенеза (С040-С0401_-иммунорегуляторныш сигнал) // Бюл. эксперим. биол. — 1999. — № 10. — С. 364-371.

Пигаревский П.В. Функциональная морфология лимфоидных органов и им-мунорегуляторных лимфоцитов человека в норме и при атеросклерозе: Ав-тореф. дис. ... д-ра биолаук. — Санкт-Петербург, 1991. — 41 с.

Пигаревский П.В., Нагорнев В.А. Функциональная морфология лимфатических узлов и селезенки при атерогенезе // Арх. патол. — 1995. — № 3. —

С. 44-49.

BeviLacqua M.P. EndotheLiaL-Leukocyte adhesion molecules // Annu. Rev. Immunol. — 1993. — Vol. 11. — P. 767-804.

Hansson G.K. Immune and inflammatory mechanisms in the development of atherosclerosis // Br. Heart. J. — 1993. — Vol. 69 ( Suppl. 1). — P. 38-41.

Hansson G.K., Stemme S. Immunity, inflammation, and the role of T lymphocytes in atherosclerosis. — Jn:Atherosclerosis X / Eds. by F.P. Woodford, J. Davignon and S. Sniderman. — Elsevier Sci. B.V. —

1995. — P.61-65.

Jonasson L, Holm J., Skalli 0. et al. Regional accumulation of T cells, macrophages and smooth muscle cells in the human atherosclerotic plaque // Arteriosclerosis. — 1986. — Vol. 6. — P. 131-138.

Jurgens G., Chen Q., Esterbauer H. et al. Immunostaining of human autopsy aortas with antibodies to modified apolipoprotein B and apolipoprotein (a) //

Arterioscler. Thromb. — 1993. — Vol. 13. — P. 1689-1699.

Ku G., Thomas C.E., Akeson A.L. et al. Induction of interleukin 1 expression from human peripheral blood monocyte-derivied macrophages by 9-hydroxyoctadec-adienoic acid // J. Biol. Chem. — 1992. — Vol. 267. — P. 14183-14188.

Steinberg D. Lipoprotein modification and atherogenesis //Atheroscler. Rev.1991. — Vol. 23. — P. 115-121.

Stemme S., Hansson G.K. Immune mechanisms in atherogenesis // Ann. Med.

1994. — Vol. 26. — P. 141-146.

Stemme S., Holm J., Hansson G. T lymphocytes in human atherosclerotic plaques are memory cells expressing CD4+R and the integrin VLA-1 // Arterioscler.Thromb. — 1992. — Vol. 12. — P. 206-211.

Watanabe T., Shimokama T., Haraoka S. et al. T lymphocytes in atherosclerotic lesions // Ann. N.-Y. Acad. SQi. — 1995. — Vol. 748. — P. 40-45.

Wick G., Xu Q. Atherosclerosis — an autoimmune disease // Exp. Gerontology.

1999. — Vol. 34. — P. 559-566.

Zhou X., Stemme S., Hansson G.K. Evidence for a local immune response in atherosclerosis. CD4+ T cells infiltrate lesions of apoprotein-E-deficient mice //

Am. J. Pathol. — 1996. — Vol. 149. — P. 359-366.

 

 

УДК 577.1:616-006.81-092-037

 



загрузка...