загрузка...
 
Клиническое значение некоторых цитокинов при злокачественных неходжкинских лимфомах
Повернутись до змісту

Клиническое значение некоторых цитокинов при злокачественных неходжкинских лимфомах

 

Н.Б. Серебряная, А.А. Новик, С.В. Волошин, А.В. Новицкий

Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования,

 Военно-медицинская академия, Санкт-Петербург

 

Для выявления взаимосвязи цитокинового статуса с клиническими особенностями заболевания при неходжкинских лимфомах (НЛ) определяли сывороточную концентрацию цитокинов у 72 пациентов с В-клеточными НЛ. Отмечено, что значительное повышение сывороточного уровня И-6 характерно преимущественно для больных с НЛ высокой степени злокачественности (ВСЗ), с генерализованными стадиями заболевания и наличием общих симптомов интоксикации (В-симптомов). При генерализации НЛ существенно повышается сывороточная концентрация 1^а. Повышение продукции ^N7 МНПК ассоциировано с высокой вероятностью метастазирования лимфомного процесса. Повышение сывороточного уровня И-6 при снижении уровня И.-1ГЗ ассоциировано с преимущественным метастатическим поражением печени, тогда как для поражения костного мозга высокие уровни И-6 не характерны. Таким образом, исследование цитокинов может дать дополнительную информацию о степени злокачественности, стадии заболевания, вероятности метастазов и экстранодальных поражений в некоторых органах.

Ключевые слова: неходжкинские лимфомы, цитокины, интерфероны, В-симптомы,

метастазирование.

Злокачественные лимфомы — группа гетерогенных лимфоидных опухолей, преимущественно В-клеточной природы, в которой выделяют более 40 различных нозологических форм. Многообразные клинические и гистопатологические изменения, наблюдаемые при неходжкинских лимфомах (НЛ), могут определяться различными нарушениями цитокинового статуса [9]. Лимфомные клетки, как правило, сохраняют способность продуцировать цитокины, а при прогрессировании заболевания гетерогенность цитокиновой продукции усиливается [17]. Цитокиновый статус пациента при НЛ в значительной степени определяется количеством клеток, продуцирующих цитокины (в том числе и злокачественно трансформированных), их способностью отвечать или не отвечать на регуля-торные сигналы, а также реакциями на эти цито-кины клеток различных типов, имеющих соответствующие рецепторы [13, 19, 22]. Наличие широкого спектра цитокинов потребовало проведения многочисленных работ, направленных на установление роли каждого из них в пролиферации и дифференцировке нормальных и злокачественно трансформированных Т- и В-лимфоцитов. Оказалось, что такие плейотропные цитокины, как фактор некроза опухолей а (TNFa), интерлейкин 1? (IL-1?) и интерлейкин 6 (IL-6), функции которых в регуляции иммунного ответа, гемопоэза и противоопухолевого иммунитета широко известны [23], являются также паракринными и/или ауто-кринными ростовыми факторами клеток неходж-кинских лимфом [5, 12, 13, 14, 16].

Особая роль в развитии лимфом принадлежит системе интерферонов (IFN), так как все основные типы интерферонов (a, ? и у) обладают выраженным противовирусным, иммуномодулирующим и антипролиферативным действием [1]. Синтез ин-терферонов может регулироваться рядом цитоки-нов (IL-1, IL-2, TNF), и, в свою очередь, интерфе-роны индуцируют или усиливают продукцию ряда цитокинов, участвующих в иммунном ответе (IL-1,TNF и др.) [8, 10].

Задачей настоящего исследования являлось определение связей уровней продукции цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови и их концентрацией в сыворотке крови (TNFa, И-1-1Р, ]Ъ-6, №N01 и общего сывороточного интерферона) с важнейшими клиническими параметрами, характеризующими размер опухолевой массы и вовлечение в лимфомный процесс некоторых органов и тканей у больных c НЛ. Такая информация является необходимым шагом для построения развернутой картины патологического процесса у каждого пациента.

Материалы и методы

Больные с НЛ (69 чел.), госпитализированные в клинику гематологии и клинической иммунологии ВМА и стационары, работающие в составе Санкт-Петербургской группы по изучению лимфом, были обследованы до начала терапии. Контрольную группу составили 25 здоровых доноров крови. Морфологические варианты заболеваний у обследованных больных были распределены следующим образом:

—        НЛ низкой степени злокачественности (НСЗ) — 43 пациента, в том числе:

лимфоцитарные и пролимфоцитарные — 11,

центробластно-центроцитарные — 14,

лимфоплазмоцитоидные — 5,

ангиоиммунобластные — 3,

центроцитарные (мантийной зоны) — 6,

моноцитоидные (маргинальной зоны) — 4;

—        НЛ высокой степени злокачественности (ВСЗ) — 26 пациентов, в том числе:

центробластные —18,

иммунобластные — 4,

полиморфноядерные из крупных и средних клеток — 2,

крупноклеточные анапластические — 2.

При определении продукции цитокинов мононуклеары периферической крови (МНПК) выделяли на градиенте плотности фиколл-пака («Pharmacia») по методу А. Boyum и культивировали in vitro в концентрации 1 х 106/мл в U-образных 96-луночных планшетах в течение 18-20 ч при 37 °С в атмосфере 5 % СО2. Исследовали спонтанную продукцию цитокинов и стимулированную липополисахарид-содержащим препаратом пирогеналом в концентрации 5 мкг/мл (в случае изучения IL-1P и TNFa) или фитогемагглютинином в концентрации 20 мкг/мл (при исследовании IL-6).

Содержание общей фракции сывороточного интерферона (IFN общ.), продукцию IFNy МНПК определяли биологическим методом в лаборатории Российского НИИ гриппа РАМН (руководитель — Р.А. Ариненко). Концентрацию IFN общ. и IFNy выражали в МЕ/мл.

Определение концентрации IL-1P, IL-4 и TNFa в сыворотках крови и супернатантах МНПК осуществляли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. Чувствительность наборов для IL-1 р, TNFa и IFNa («Протеиновый контур», Санкт-Петербург) — 10 пг/мл. Концентрацию IL-6 определяли с помощью стандартного теста поддержания пролиферации IL-6-зависимой мышиной гибридомной линии В9. Единицы биологической активности IL-6 рассчитывали, сравнивая значения со стандартным препаратом IL-6 («Sigma») — одна единица соответствует концентрации 1 пг/мл. Чувствительность метода — 1 ед./мл.

Статистическую обработку результатов проводили с применением t-критерия Стъюдента-Фишера и U-критерия Вилкок-сона-Манна-Уитни.

 

Результаты и обсуждение

В связи с тем, что НЛ чрезвычайно гетероген-ны, мы проанализировали сывороточные уровни цитокинов у больных с НЛ низкой и высокой степени злокачественности.

Приведенные в табл. 1 средние значения кон-центрации цитокинов у больных с НЛ свидетель-ствуют об их большом отличии от параметров ци-токинового статуса у здоровых лиц. Так, сыворо-точная концентрация TNFa была значительно по-вышена в обеих группах больных. Содержание1Ъ-1р в сыворотках больных с НЛ достоверно неотличалось от показателей в контрольной группе(можно отметить лишь некоторую тенденцию к ихповышению у больных с НЛНСЗ). Показатели системыинтерферона были измененынеоднозначно: IFN общ. былдостоверно повышен, а уро-вень   — снижен в обеихгруппах пациентов. В то жевремя можно отметить, что поуровню этих цитокинов небыло достоверных отличиймежду группами больных сразличной степенью злокаче-ственности заболевания. Од-нако такие отличия были за-регистрированы по содержа-нию в сыворотках -6. Сред-няя концентрация -6 у боль-ных с НЛ ВСЗ была достовер-но выше, чем в группе больных с НЛ НСЗ. Кроме того, этот цитокин определялся в крови больных с НЛ ВСЗ достоверно чаще, чем у больных с лимфомами НСЗ (23 против 61 %, p<0,05). Это свидетельствует о том, что в тех случаях, когда при установлении степени злокачественности заболевания имеются противоречивые клинические и лабораторные данные, определение сывороточной концентрации IL-6 может дать дополнительную информацию. Более подробное изучение связи морфологических форм заболевания с уровнем этого цитокина, проведенные в исследовании [4], показали, что уровень IL-6 повышен у большинства пациентов с лимфомами из клеток фолликулярного центра. Причем у пациентов с лимфомами из крупных клеток фолликулярного центра это повышение более выраженное, чем у пациентов с морфологическими вариантами лимфом из мелких клеток с расщепленным ядром [18].

Среди больных с НЛ НСЗ целесообразно выделить в особую группу пациентов с лимфоплазмо-цитоидным вариантом заболевания. Из обследованных нами 6 больных с этой формой заболевания IL-6 был выявлен у 5, и его средний уровень у этих лиц составил 7,6 ± 3,2 ед./мл, что значительно выше, чем в группе НЛ НСЗ в целом. Морфологический субстрат этого типа лимфомы — лим-фоплазмоцитоидные клетки — гистологически наиболее близок к злокачественным плазматическим клеткам, составляющим морфологический субстрат множественной миеломы (ММ). Для клеток плазмоцитомы, как и миеломных клеток, IL-6 является паракринным и аутокринным ростовым фактором [16]. При ММ этот цитокин продуцируется в избыточных количествах, и повышение его уровня ассоциировано с агрессивным клиническим течением заболевания [21, 24]. Высокая частота обнаружения IL-6 при лимфоплазмоцитоид-ных НЛ свидетельствует о его важной роли в развитии этой формы заболевания.

Значительные трудности при обследовании больных с НЛ часто возникают при стадировании заболевания. Приведенные в табл. 2 данные демонстрируют различия в сывороточных уровнях исследуемых цитокинов на локализованных и генерализованных стадиях. Выявлено, что при генерализации заболевания происходит увеличение сывороточных концентраций TNF и IL-6. Однако у некоторых (~ 35 %) пациентов, независимо от стадии заболевания, IL-6 в сыворотке крови не определяется, что делает невозможным использование этого параметра при стадировании заболевания. Напротив, TNF в сыворотке крови выявляется у всех пациентов, причем на локализованных стадиях его концентрация, как правило, не превышает 150 пг/мл. В связи с этим уровень TNF является параметром, информативным при стади-ровании заболевания.

Таблица 3

Спонтанная продукция IL-1? и TNFa мононуклеарами периферической крови больных с неходжкинскими лимфомами в зависимости от стадии заболевания

 

Продукция

I и II стадии,

III-IV стадии,

Критерий

Р

цитокинов

п = 10

п = 59

 

 

IL-1?

98,3 ± 10,9

67,6 ± 4,0

t

< 0,05

TNFa

197,0 ± 14,2

94,3 ± 6,2

t

< 0,01

 

Полезную дополнительную информацию при стадировании заболевания можно получить и при определении продукции TNFa и IL-1? мононукле-арами периферической крови. Данные табл. 3 свидетельствуют о том, что способность к продукции этих цитокинов МНПК достоверно снижается на генерализованных стадиях заболевания. Известно, что на способность синтезировать цитокины влияют не только сывороточные концентрации этих ци-токинов, но и другие факторы (например, растворимые рецепторы этих цитокинов, другие цитоки-ны, обладающие синергизмом или антагонизмом по отношению к указанным) [11, 13]. Диапазон изменения концентраций TNF в супернатантах культур мононуклеаров, определяемый стадией заболевания, оказался существенно шире, чем диапазон концентраций этого цитокина в сыворотке крови. Кроме того, по мере прогрессирования заболевания концентрация TNF в сыворотке повышается, а способность к его продукции МНПК существенно снижается. Этот факт указывает на то, что сывороточный TNF, вероятно, не является продуктом МНПК, а синтезируется локально (то есть опухолевыми клетками и/или их микроокружением). Это предположение подтверждает исследование [7], в котором определили, что по мере увеличения массы опухоли происходит снижение функциональных возможностей МНПК к продукции TNF и некоторых других цитокинов.
Важным фактором при стадировании заболевания является наличие симптомов общей интоксикации (так называемых В-симптомов). Проведенный нами анализ уровней цитокинов, в зависимости от наличия или отсутствия В-симптомов, показал, что их появление было тесно связано с подъемом уровня IL-6. Так, у 23 из 31 пациента (75 %) с наличием этого признака в сыворотке крови определялся IL-6, а средняя концентрация этого цитокина составила 9,7 ± 3,3 ед./мл. При этом у лиц без В-симптомов IL-6 определялся только у 6 из 39 пациентов (15 %), и его концентрация, как правило, не превышала 3 ед. (в среднем — 1,48 ± 1,2 ед./мл). Связь повышения уровня IL-6 с развитием В-симптомов ранее была определена и при лимфомах Ходжкина (лимфогранулематозе) [19]. Учитывая тот факт, что наличие В-симп-томов существенно влияет на прогноз заболевания, представляется актуальным исследование этого цитокина для определения вероятности их развития. Таким образом, при стадировании заболевания является информативным определение сывороточных концентраций TNF и IL-6, причем достоверность полученной информации возрастает при ее сопоставлении с показателями продукции TNF (и/или IL-1) МНПК.

Стадия заболевания напрямую связана с распространением лимфомного процесса в организме. Из исследованных нами параметров интерфе-ронового статуса наибольшую связь с распространенностью (диссеминацией) заболевания имел показатель стимулированной продукции IFNy. Данные, представленные в табл. 4, свидетельствуют о том, что наличие значительной локальной опухолевой массы («bulky disease») ассоциировано со снижением продукции IFNy МНПК, в то время как вовлечение в процесс печени, костного мозга и наличие экстранодальных поражений — с увеличением этого параметра.

При НЛ экстранодальные очаги метастазирова-ния опухоли чаще всего выявляются в печени и костном мозге [2]. В группах больных с поражением печени и костного мозга концентрация общего сывороточного IFN в сыворотке крови была ниже, а концентрация IFNa — выше, чем у пациентов без вовлечения в процесс этих органов (табл. 5 и 6). Необходимо отметить, что все определяемые нами параметры интерферонового статуса связаны между собой, причем повышение сывороточной концентрации IFNa достоверно отрицательно коррелирует с продукцией МНПК IFNa и IFNy при НЛ НСЗ [3]. Известно, что способность опухолевых клеток к метастазированию усиливается при воздействии TNF и IFNy [20]. По-видимому, из исследованных нами параметров интерферонового статуса у больных с НЛ со способностью к метаста-зированию главным образом связана продукция IFNy МНПК, а изменения других параметров ин-терферонового статуса сопряжены (связаны) с этим параметром.

Поражения печени и костного мозга, наряду с параметрами системы интерферона, ассоциированы с изменением уровня IL-1?, IL-6 и TNF. Представленные в табл. 5 данные о связи сывороточного уровня IL-1 ? с поражением печени отражают влияние этого цитокина на состояние печеночных клеток. Известно, что повышенные количества сывороточного IL-1 ? усиливают транскрипцию и синтез фактора роста гепатоцитов [12]. При снижении сывороточного уровня IL-1 ? (и/или его продукции мононуклеарами), вероятно, не обеспечивается адекватная стимуляции продукции фактора роста гепатоцитов, что снижает регенераторные способности печеночной ткани и приводит к нарушению ее морфологических и функциональных свойств.

Одной из основных причин снижения уровня IL-1 ? может быть значительное повышение уровня IL-6, наблюдаемое в данной группе больных (табл. 5). Известно, что между этими цитокинами существуют тесные взаимосвязи, причем IL-1 ? стимулирует продукцию IL-6, а IL-6 по механизмам обратной связи угнетает продукцию IL-1? [15].

Сопоставление данных таблиц 5 и 6 свидетельствует о том, что при метастатических поражениях, каковыми у больных с НЛ являются поражения печени и костного мозга, сывороточные уровни TNF изменяются однонаправленно, что в целом соответствует высказанным ранее предположениям о связи этих параметров с величиной опухолевой массы. Однако, такие параметры, как концентрация IL-1 ? и IL-6 у больных с поражениями печени и костного мозга, изменены разнонаправленно: так, концентрация IL-1? у пациентов с поражением печени ниже, а при поражении костного мозга — выше, чем у больных без указанных поражений. И напротив, концентрация IL-6 при вовлечении в процесс печени повышена, а при поражении косного мозга — снижена. Это наблюдение совпадает с клиническими данными, свидетельствующими о том, что поражения костного мозга у больных с НЛ развиваются преимущественно при заболеваниях с НСЗ [2], тогда как высокие концентрации IL-6 в сыворотке крови встречаются главным образом у больных с заболеванием

ВСЗ [4].

Известно, что успешность метастазирования злокачественных клеток в различные органы определяется как свойствами самих злокачественных клеток, так и способностью микроокружения поддерживать их жизнеспособность [6]. Вероятно, способность к конститутивной секреции IL-6 клетками НЛ является тем фактором, который определяет хоминг и выживание лимфомных клеток в печени, но не в костном мозге. Таким образом, изучение сывороточной концентрации IL-1? и IL-6 является информативным при прогнозировании вовлечения в процесс печени или костного мозга у больных с НЛ.

Суммируя приведенные данные, можно заключить, что исследования параметров цитокинового статуса могут дать дополнительную информацию о степени злокачественности, стадии заболевания, вероятности метастазов и экстранодальных поражений в некоторых органах.

Выводы

Значительное повышение сывороточного уровня IL-6 характерно преимущественно для НЛ ВСЗ и плазмацитоидного варианта НЛ НСЗ.

Генерализация лимфомного процесса сопровождается повышением сывороточной концентрации TNFa и снижением продукции этого цитокина (наряду с IL-1?) мононуклеарами периферической крови in vitro. В случае с НЛ ВСЗ дополнительно может наблюдаться повышение концентрации IL-6.

Повышение уровня продукции IFNy клетками периферической крови ассоциировано с высокой вероятностью метастазирования лимфом-ного процесса.

Повышение сывороточного уровня IL-6 при снижении уровня IL-1 ? ассоциировано с преимущественным метастатическим поражением печени, тогда как при поражении костного мозга высокие уровни IL-6 не отмечаются.

 

ЛИТЕРАТУРА:

Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и при патологии. — М.: Медицина, 1996. — 140 с.

Новик А.А. Клинические особенности поражения внутренних органов и их влияние на выживаемость у больных неходжкинскими лимфомами: Авто-реф. дис. ... д-ра мед. наук. — СПб., 1996. — 43 с.

Новицкий А.В. Характеристика некоторых биологических маркеров активности неходжкинских злокачественных лимфом: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. — СПб., 1999. — 23 с.

Серебряная Н.Б., Новик А.А., Мельниченко В.Я. и др. Диагностическое и прогностическое значение интерлейкина 6 при злокачественных неходж-кинских лимфомах // Вестник АМН. — 1998. — № 10. — С. 32-36.

Akira S., Taga Т., Kishimoto T. Interleukin-6 in biology and medicine // Adv. Immunol. — 1995. — Vol. 54. — P. 5-78.

Aoudjit F., Potworowski E.F., St-Pierre Y. The metastatic characteristics of murine lymphoma cell lines in vivo are manifested after target organ invasion // Blood. — 1998. — Vol. 91. — P. 623-629.

Bajer J.E., Sandmann M., Schmutz G. Concentration of IL-1-a, IL-1-fi, IL-2, interferon-y and TNF-a in lymphoma patients vary according to stage // Exp. Hemat. — 1995. — Vol. 23, № 8. — P. 931.

Bendizen K. Cytokilnes and natural regulators of cytokines // Immunol. Let. —

1994. — Vol. 43, № 1/2. — P. 111-113.

Clinical application of cytokines. Role in pathogenesis, diagnosis and therapy / Ed. by J.J. Oppenheim, J.L. Rossio, A.J.H. Gearing. — New York: Oxford University Press, 1993. — 379 p.

De Maeyer E., De Maeyer-Guignard J. Interferons and other regulatory cytokines. — New York: Wiley, 1988. — 611 p.

Dinarello C.A. Interleukin-1 and its biologically related cytokines // Adv. Immunol. — 1989. — Vol. 44. — P. 153-206.

Dinarello C.A. Biology of Interleukin-1 // FASEB. — 1988. — Vol. 2, № 1. —

P. 108-115.

Gause A., Pohl C., Da Costa L. et al. Clinical significance of soluble CD30 angen in the sera of patients with untreated Hodgkin's disease // Blood. — 1991.

 

Vol. 77, № 9. — P. 1983-1988.

Gruss H.J., Dower S.K. Tumor necrosis factor ligand superfamily: involvement in the pathology of malignant lymphomas // Blood. — 1995. — Vol. 85, № 12.

P. 3378-3404.

Helle M., Brakenhoff J.P. J., De Groot et al. Interleukin-6 is involved in interleukin-1-induced activities // Eur. J. Immunol. — 1988. — Vol. 18, № 8. — P. 957-959.

Hilbert D.M., Kopf M., Mock B.A. et al. Interleukin 6 is essential for in vivo development of B lineage neoplasms // J. Exp. Med. — 1995. — Vol. 182,

№ 1. — P. 243-248.

Hsu S.M., Waldron J.W., Hsu P. L., Hough A.J. Cytokines in malignant lymphomas: review and prospective evaluation // Hum. Pathol. — 1993. — Vol. 24,

№ 10. — P. 1040-1057.

Kato H., Kinoshita T., Suzuki S. et al. Elevated serum interleukin-6 is derived from neoplastic lymphoid cells in patients with B-cells non-Hodgkin's lymphoma // Br. J. Haematol. — 1996. — Vol. 92, № 4. — P. 1014-1021.

Kurzrock R. Cytokine deregulation in hematological malignancies: clinical and biological implications // Clin. Cancer Res. — 1997. — Vol. 3, № 12, pt. 2. —P. 2581-2584.

Lollini P. L, De Giovanni C, Nicoletti G. et al. Enhancement of experimental metastatic ability by tumor necrosis factor-alpha alone or in combination with interferon-gamma // Clin. Exp. Metastases. — 1990. — Vol. 8, № 2. — P. 215-224.

Nachbaur D.M., Herold M., Maneschg A. et al. Serum level of IL-6 in multiple mieloma and other hematological disorders: correlation with disease activity and other hrognostic parametrs // Ann. Hematol. — 1991. — Vol. 62, № 2/3.

— P. 54-58.

Peters M., Muller A.M., Rose-John S. Interleukin-6 and soluble interleukin-6 receptor: direct stimulation of gpl30 and hematopoiesis // Blood. — 1998. — Vol. 92, № 10. — P. 3495-3504.

The cytokine handbook / Ed. by A.W. Thomson. — London.: Academic Press,

1992. — 425 p.

Zaraisky M.I., Podoltseva E.I., Serebrianaya N.B. Prognosric significance of IL-6 and HLA phenotype in multiple myeloma (MM) patients // In: «Abstr. 23rd Congr. Eur. Sos. Med. Oncol. — Athens, 1998. — P. 232.

Clinical significance of some cytokines in malignant non-Hodgkin's lymphomas

N.B. Serebrianaya1, A.A. Novik2, S.V. Voloshin2, A.V. Novitskiy2 1 St Petersburg Medical Academy of Postgraduate Education, 2 Medical Military Academy, St Petersburg

The objective of the study was to define associations of cytokine serum levels and cytokine production (TNFa, IL-ip, IL-6, IFNa, IFNy) by peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with the important clinical features in non-Hodgkin's lymphoma (NHL) patients. Seventy two NHL patients have been studied. 43 of them had low grade (LG) and 26 high grade (HG) of malignancy. High IL-6 serum levels were typical for HG NHL patients with generalized stages (III and IV) and common symptoms of intoxication (so-called B-symptoms). NHL patients with generalized stages of the disease had elevated TNFa serum levels as well. The increased production of IFNy by PBMC in vitro was usually associated with high prevalence of metastases. High serum concentrations of IL-6 together with low IL-ip level were revealed in patients with liver metastases. Dissemination to the bone marrow was not associated with the increase of IL-6 level. Thus, the measurement of cytokine concentrations can provide important information about the degree of malignancy, stage of disease, and probability of metastases, as well as point out the tissues exposed to high risk of being seeded.

Цитокины: 11-1, рецепторный антагонист IL-l(IL-lRa),

IL-4, IL-8, TNFa, G-CSF, IFNa, IFNy

Компоненты номплемента: С3, С4, С5, С3а, С5а, Cl-ингибитор, фантор Н

Полная номплентация, внлючая 96-луночные планшеты, стандартные образцы, буферные растворы, онрашивающие реагенты, подробные инструнции.

Высоная чувствительность, низние цены, доставна по России нурьерсной почтой. 

 

197110, Россия, Саннт-Петербург, Пудожсная ул., д.7
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ 

© Коллектив авторов, 2002 УДК 612.015.36:616-006.6-085 

Цитокины в терапии рака

 

И.В. Киселева, С.Ф. Протасова, С.М. Щеканова, В.В. Жунко, А.Ю. Егоров

НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург;

 НИИ гриппа РАМН, Санкт-Петербург

Новый высокоэффективный противоопухолевый препарат местно-резорбтивного действия был получен на основе комбинации некоторых рекомбинантных цитокинов человека. В наблюдениях in vivo была показана противоопухолевая эффективность рекомбинантного интерлейкина 2 (IL-2) человека, использованного не только в инъекционной форме, но и в виде мази. В опытах на мышах, которым была привита карцинома Эрлиха или лимфома L-1210, было установлено, что ци-токиновые мази, содержащие IL-2 или IL-2 в комбинации c интерфероном а2 и/или фактором некроза опухолей альфа в низких концентрациях, оказывали выраженный противоопухолевый эффект. Полученные результаты расширяют наши знания о свойствах цитокинов, используемых в терапии рака, и позволяют предположить, что простые в приготовлении и дешевые цитокино-вые мази являются перспективными противоопухолевыми препаратами.

Ключевые слова: противоопухолевая терапия, цитокиновые мази, интерлейкин 2, интерферон альфа 2, фактор некроза опухолей альфа, карцинома Эрлиха, лимфома L-1210

В настоящее время в нашей стране и за рубежом широко проводится исследование и лечение больных с различными нозологическими формами заболеваний, включая онкологические, препаратами рекомбинантных цитокинов. Известно, что цитокины, такие как: интерлейкин 2 (1Ъ-2), интерферон а2 (№N012) и фактор некроза опухоли а (ТМЕа) — обладают способностью останавливать опухолевый рост за счет подавления деления опухолевых клеток, ускоренного созревания дендритных клеток (клеток Лангерганса), инициирующих специфический ответ Т-лимфоцитов, и стимуляции активности цитотоксических лимфоцитов и макрофагов [3, 9, 11]. Действие этих медиаторов иммунного ответа, применяемых в виде чистых препаратов, полученных генно-инженерным путем, проявляется при их введении в кровоток животных и людей путем инъекций. В частности, показано, что препарат рекомбинантного 1Ъ-2, используемый для лечения опухолей путем его внутривенного введения, проявляет свою эффективность за счет системной активации клеток-киллеров, поражающих опухолевые клетки [3, 12]. Основным недостатком инъекционной формы -2

Кисилева Ирина Васильевна, e-mail: является необходимость использования высоких доз препарата (более 103 МЕ/кг массы тела), при которых у больных проявляется комплекс тяжелых токсических эффектов вплоть до комы и летальных исходов [10, 13, 14]. Другим недостатком препарата является его нестабильность при введении в кровяное русло, где период его инактивации измеряется минутами [3].

Есть сообщения о том, что применение концентрированных цитокиновых коктейлей приводит к осложнениям, связанным с некрозом тканей при подкожном и внутрикожном введениях, а в отдельных случаях способствует гибели больного.

В литературе описана противоопухолевая композиция, включающая 1Ъ-2, №N02 и двунитевую РНК (днРНК) [10]. Добавление в композицию днРНК в качестве компонента, уменьшающего токсичность цитокинов, позволило снизить необходимые дозы цитокинов, одновременно расширив область их терапевтического применения. Но при такой днРНК-цитокиновой терапии для получения положительного эффекта вливания препарата проводили не чаще двух раз в неделю с использованием дозы интерлейкина порядка 103-104 МЕ/кг массы тела, т.е. дозы, которая, согласно данным [3, 11], уже способна оказывать токсическое действие.



9          11 14

Дни после имплантации опухоли

? Контроль -IL-2

Рис. 2. Эффективность лечения лимфомы 1_-1210 у мышей интерлейкиновой мазью, начатое на поздних сроках после имплантации опухоли.

 

То, что кожа и кожные реакции связаны с внутренними процессами организма, известно давно, но работы последних лет показали, что кожа имеет полный набор клеточных элементов и их продуктов, с помощью которых она функционирует как иммунный орган [2]. Кожа является первичной мишенью во время различных иммунных реакций и участвует как в генерации локальных иммунных ответов, так и распространяющихся на всю иммуную систему [2].

В связи с этим задачей нашей работы явилась разработка нового метода лечения различных онкологических заболеваний путем локальных накожных аппликаций средства, содержащего в качестве активного начала рекомбинантный 1Ъ-2 в сочетании с рекомбинантными №N02 и ТМЕа и приготовленного в виде мази.

Материалы и методы

Цитокины. В работе использовали рекомбинантный IL-2 человека (BIOTECH, Санкт-Петербург), рекомбинантные TNFa и IFNa2 (производства НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ «Вектор», г. Новосибирск).

Животные. Опыты ставили на белых беспородных мышах и мышах линии DBA-2, половозрелых самцах с массой тела 14-16 г разведения питомника «Рапполово» (Всеволожский район, Ленинградская область) и содержали на стандартном рационе.

Моделирование опухолевого роста in vivo. В работе применяли две перевиваемые опухолевые линии — карциному Эрлиха (НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова, Санкт-Петербург) и лимфому L-1210 (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург), которые поддерживали путем перевивания через организм мышей. Для поддержания карциномы Эрлиха использовали белых беспородных мышей, для лимфомы L-1210 — мышей линии DBA-2.

В опытах по моделированию опухолевого роста суспензии опухолевых клеток вводили мышам внутримышечно в правое бедро, что стимулировало локальный рост опухолей и давало возможность оценивать величину опухоли, измеряя ее диаметр (в см). Суспензии опухолевых клеток готовили на среде RPMI-1640 («Биолот», Санкт-Петербург) и вводили в следующих количествах: клетки карциномы Эрлиха — от 5 х 104 до 5 х 105 клеток/мышь. Пальпируемые опухоли появлялись на 6-8 сут. и к 10-14 сут. достигали 3,5-4,0 см в диаметре, что к 25-30 дню опыта приводило к гибели подопытных животных. Кроме измерения величины опухолей, рассчитывали процент животных с опухолями. В каждой группе было использовано не менее 10 животных.

Приготовление цитокиновых мазей. В качестве фармацевтически приемлемого носителя применяли стандартную смесь, которую готовили по общепринятой для приготовления мазей технологии на ланолиново-вазелиновой основе. Смешивая один или сочетания двух или трех цитокинов с носителем, получали мази с различным спектром активностей каждого из участвующих компонентов. В работе использовали следующие концентрации цитокинов (МЕ/г): IFNa2 — от 2 х 103 до 2 х 104; IL-2 — от 5,5 х 103 до 2 х 104; TNFa — 7,5 х 103 [1].

Цитокинотерапия. 100 мг мази наносили одно-трехкратно на зону опухолевого роста, начиная с 4-го дня после имплантации опухоли, втирая в кожу больных животных. Привитых опухолью мышей контрольной (нелеченой) группы обрабатывали одной мазевой основой (носителем) без цитокиновых компонентов, втирая ее в соответствующие сроки в зону опухолевого роста. Наблюдение проводили в течение 10-33 дней от момента имплантации опухоли. Животных, выживших к концу срока наблюдения, выводили из эксперимента в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» посредством эфирного наркоза.

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследований были поставлены эксперименты по лечению у мышей лимфомы Ь-1210. Известно, что эта опухолевая модель является чувствительной к ІЬ-2-терапии [11]. В качестве терапевтического агента использовали содержащую ІЬ-2 в дозе 103 МЕ/г мазь, которую применяли однократно на 4-й день после введения опухолевых клеток.

Для сравнения эффективности мазевой терапии с традиционными методами лечения интерлейкином 2 части мышей вводили ІЬ-2 подкожно в дозе 103 МЕ/мышь три дня подряд на 4, 5 и 6-е сут. после имплантации опухоли. Как видно изчем у 95 % мышей в контрольной группе и группе, получавшей инъекционную форму IL-2, наблюдался выраженный опухолевый рост. Эффективность инъекций IL-2 была заметна только на 6 и 7-е сут. В то же время, после мазевой терапии к 10-у дню наблюдения

число животных-опухоленосителей не превышало 25 % (рис.1).

Таким образом, эффект от терапии средством накожного применения, содержащим IL-2, был значительно более выражен по сравнению с известным способом терапии с помощью инъекций.

В случае начала лечения лимфомы L-1210 в более поздние сроки (на 9-й день после имплантации опухолевых клеток) после трехкратного (на 9, 10 и 11-й дни) нанесения мази, содержащей IL-2 в концентрации 104 МЕ/г, также достигался выраженный терапевтический эффект (рис.2).

Положительный противоопухолевый эффект был достигнут не только при введении чувствительной к IL-2 лимфомы L-1210, но и в отношении опухоли, известной своей резистентностью к IL-2-терапии (карцинома Эрлиха) [11]. Лечение мышей-опухоленосителей проводили однократно на 4-й день после имплантации опухоли. Использовали мази, содержащие 2 х 104 МЕ/г IL-2 или IFNa2, а также мазь, содержащую оба компонента с той же активностью. Цитокиновые мази были эффективны при лечении карциномы Эрлиха в разной степени. Более выраженный лечебный эффект был достигнут при применении комбинированной мази, содержащей интерлейкиновый и интерферо-новый компонент (таблица). По данным литературы [12], подобный лечебный эффект в отношении карциномы Эрлиха в экспериментах на мышах достигался путем многократных инъекций IL-2 в дозе, в 100 раз превышающей используемую нами.

Высокий терапевтический эффект трехкомпо-нентной цитокиновой мази был отмечен при накожном применении для лечения карциномы Эр-лиха даже в случае десятикратного снижения концентрации отдельных компонентов по сравнению с монопрепаратами. Так, при сравнительном изучении противоопухолевой активности однократного использования мазей, содержащих 2 х 104 МЕ/г IFNa2, IFNa2 + TNFa (2 х 104 МЕ/г и 7,5 х 103 МЕ/г соответственно) или IFNa2 + TNFa + IL-2 (2 х 103 МЕ/г, 7,5 х 103 МЕ/г и 5,5 х 103 МЕ/г соответственно), наибольшей эффективностью обладала мазь, содержащая три компонента. Как видно из таблицы, применение трехкомпонентного цитокинового препарата приводило к отчетливому терапевтическому эффекту. Интересно, что гибель мышей от карциномы Эрлиха в группе, которую лечили трехкомпонент-ной мазью, начиналась только тогда, когда в контрольной группе животных летальность составля-ля уже 100 % (рис. 3).

Кроме того, отмечено пролонгированное лечебное действие комбинированного препарата по сравнению с монопрепаратами. Так, к 15-у дню после имплантации опухолей в контрольной группе мышей и в группах, которых лечили монопрепаратами цитокинов (IFNa2 или IL-2), опухоли достигали 3-4 см в диаметре и составляли 1/5-1/6 часть от веса тела животных. В группе мышей, получавших комбинированный препарат, к 15-у дню опыта диаметр опухолей составлял около 1 см и не превышал 1,5-2,0 см ко дню учета опыта — 33-м сут. после имплантации.

Таким образом, была установлена высокая противоопухолевая эффективность мазевого средства, содержащего низкие (нетоксичные) концентрации цитокинов (на 1-2 порядка ниже применяемых в лечении традиционными методами введения). Она достигалась за счет возможного синергизма действия IL-2, IFNa2 и TNFa. При этом полностью отсутствовало побочное токсическое действие препаратов, проявлялся выраженный пролонгированный эффект.

Начато изучение разработанных мазевых препаратов, содержащих разрешенные для применения у людей цитокины, на ограниченном количестве добровольцев, больных раком разной локализации (рак легкого, яичников и др.) [4-7]. Показано, что, не оказывая побочного действия, а также быстро снимая токсикоз и улучшая общее состояние больных, препараты обладали еще и анальгезирующими свойствами. В силу использования низких концентраций активного начала в мазях лечение может обходиться в 100 и более раз дешевле, чем традиционная цитокинотера-пия в виде инъекций.

Вероятно, локальное использование разработанных препаратов многократно усиливает их стимулирующее воздействие содержащихся в них цитокинов на клеточный противоопухолевый иммунитет непосредственно в месте расположения опухоли, но при этом из-за применения нетоксичных доз цитокинов отсутствуют специфические для такой терапии осложнения.

Полученные результаты расширяют наши знания о свойствах цитокинов, используемых в терапии рака, и позволяют предположить, что простые в приготовлении и дешевые цитокиновые мази являются перспективными противоопухолевыми препаратами.

 

 ЛИТЕРАТУРА:

 

Егоров А.Ю., Щеканова СМ., Протасова С.Ф., Киселева И.В. Противоопухолевое средство местно-резорбтивного действия на основе интерлейкина 2 человека: Патент РФ № 2117472 // Бюл. изобр. — 1998. — № 23.

Зимина И.В., Лопухина Ю.М., Арион В.Я. Кожа как иммунный орган: клеточные элементы и цитокины // Иммунология. — 1994. — № 1. — С. 8-12.

Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев А.А. Эндогенные иммуномоду-ляторы. — СПб.: Гиппократ, 1992. — 256 с.

Киселева И.В., Протасова С.Ф., Жунко В.В., Щеканова С.М. Цитокины в лечении рака // Русский журнал «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы». —

1999.  — Т. 3. — № 1. — С. 48.

Киселева И.В., Протасова С.Ф., Жунко В.В., Щеканова С.М. Трансдермаль-ные препараты цитокинов в лечении рака // В сб.: Всеросс. науч. конф. с международн. участием, посвящ. 150-летию со дня рожд. акад. И.П. Павлова. — СПб., 1999. — С.177.

Киселева И.В., Протасова С.Ф., Жунко В.В., Щеканова С.М. Препараты ци-токинов местно-резорбтивного действия в лечении опухолей // В сб.: Мат. научн. конф. «Актуальные проблемы фундаментальных исследований в области биологии и медицины», посвящ. 110-летию НИИЭМ РАМН. — СПб.,

2000.  — С. 75-76.

Протасова С.Ф., Щеканова С.М., Киселева И.В., Жунко В.В. Новые подходы к лечению рака // Int. J. Immunorehabil. — Т. 3. — № 1. — С. 184.

Пустыльник Е.И. Статические методы анализа и обработки наблюдений. — М.: Наука, 1968. — 288 с.

Фрейдлин И.С. Дендритные клетки и клетки Лангерганса // В кн.: Иммунная система и ее дефекты: Руководство для врачей. — СПб.: Полисан. — 1998. — С. 34-36.

Хем Ричерс Инк, Картер B.A. Противоопухолевая композиция: Патент СССР № 1836103 // Бюл. изобр. — 1993. — № 31.

Heaton K.M., Grimm E.A. Cytokine combination in immunotherapy for solid tumors: a review // Cancer Immunol. Immunother. — 1993. — Vol. 37. — P. 213-219.

Herberman R.B. Summary: potential of Interleukin-2 for the therapy of cancer // J. Biol. Response Modifiers. — 1994. — Vol. 3. — P. 527-532.

Smith K.A. Lowerst dose interleukin-2 immunotherapy // Blood. — 1993. — Vol. 81, № 6. — Р. 1414-1423.

Walters R.S., Theriault R.L., Holmes F.A. et al. Phase II study of recombinant alpha-interferon and recombinant interleukin-2 metastatic breast cancer //J. Immunother. With Emphasis On Tumor Immunol. — 1994. — Vol. 16. — № 4. — Р. 303-305. 

Cytokines in cancer therapy

I.V. Kiseleva1, S.F. Protasova2, S.M. Shchekanova2, V.V.Zhunko2, A.Yu.Egorov1 1 Institute of Experimental Medicine RAMS, St.Petersburg; 2 Institute of Influenza RAMS, St.Petersburg

A new highly effective antitumor transdermal preparation containing combination of recombinant human cytokines was obtained. Recombinant human interleukin 2 (IL-2) was shown to act in vivo both in injection form and in transdermal ointment form from the skin and mucous membranes. Experiments in mice infected with two tumor cell lines (Ehrlich carcinoma or lymphoma L-1210) demonstrated that the effect of local therapy with ointment containing IL-2 alone, or various combinations of IL-2, al-pha-2-interferon and/or tumor necrosis factor-alpha, was marked. These studies extend our knowledge of the properties of cytokines used for cancer treatment and suggest that cytokine ointment may have future potential for development as a specific antitumor drug.

Key words: antitumor therapy, cytokine ointments, interleukin 2, alpha-2-interferon, tumor necrosis factor

alpha, Ehrlich carcinoma, lymphoma L-1210.

 

© Коллектив авторов, 2002 УДК 616-002.77-085

 



загрузка...