загрузка...
 
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Повернутись до змісту

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

Методы электрофореза основаны на регистрации движения заряженных частиц в электрическом поле к аноду (анионы) или к катоду (катионы). Скорость продвижения прямо зависит от величины заряда частицы и от напряженности электрического поля, но обратно пропорциональна сопротивлению трения. Электрофорез оказался очень эффективным средством разделения белков. Во-первых, потому, что суммарный заряд молекулы различен у разных белков, ибо зависит от соотношения катионных и анионных групп (которое характеризуется величиной р1, - см. табл. 1-2). Во-вторых, этот заряд можно изменять в широких пределах, применяя буфер с заданным значением pH.

Первым применил электрофорез для разделения белков А. Тизелиус (1937 г.), удостоенный в 1948 г. Нобелевской премии. С тех пор было разработано множество модификаций метода, в том числе - для применения в клинических лабораториях.

Технология метода обычно состоит в том, что небольшую порцию исследуемой белковой смеси наносят на подходящую подложку (носитель), пропитанную буферным раствором, и пропускают через нее постоянный электрический ток. Проще всего в качестве подложки использовать полоску бумаги. Концы ее опускают в сосуды с тем же буферным раствором, в один из которых помещают катод, а в другой — анод электрической цепи. Во избежание перегрева и денатурации белка следует обеспечить достаточное охлаждение системы. После завершения процедуры разгонки носитель высушивают и обрабатывают подходящим красителем на белок. Белковые фракции обнаруживаются в виде окрашенных полос, если анализируемая проба была нанесена на подложку в виде поперечной полоски. Направление и длина пробега от старта зависят от характера и величины заряда белков каждой фракции, а также от pH буфера.

Высокая разрешающая способность метода электрофореза ярко проявилась в работах Л. Полинга и его сотрудников. В 1949 г. они обнаружили, что при одном из наследственных заболеваний — серповидноклеточной анемии — гемоглобин отличается по своей электрофоретической подвижности от гемоглобина здоровых людей. Выявление особой формы белка при врожденной патологии породило новый термин - «молекулярная болезнь». Дальнейшими исследованиями установлена суть генетического дефекта. Оказалось, что в каждой из одинаковых половин молекулы гемоглобина, состоящих из 287 аминокислотных остатков, имеет место одна-единственная замена (вследствие точечной мутации соответствующего гена): глутаминовая кислота в положении 6 р-це- пи гемоглобина заменена валином. Следовательно, вся молекула аномального белка содержит не 60, а только 58 кислотных групп (при сохранении всех 92 группировок, способных диссоциировать по типу основания). Этого очень небольшого различия оказалось достаточно для выявления его методом электрофореза! Успехи в изучении молекулярных основ


серповидноклеточной анемии стимулировали бурное развитие нового направления - молекулярной патологии. К настоящему времени только для гемоглобина человека обнаружено более 150 аномальных вариантов. К счастью, лишь несколько из них вызывают болезнь.

Развитие техники электрофореза привело к разработке более совершенных модификаций. Важной вехой явилось создание нового препарата - полиакриламидного геля (ПААГ). Варьируя условия его синтеза, легко регулировать размеры пор этого геля и даже создавать градиент пористости. Тем самым-еездана основа для проведения электрофореза не только на поверхности носителя, но и в его толще (в массе пористого геля). Это увеличивает влияние размеров молекул белка на скорость их продвижения. Стало возможным ие только разделять белковые смеси, но и определять молекулярную массу белков каждой фракции.

Следующим важным шагом оказалась разработка серий специальных амфолитов (их назвали амфолинами). Они представляют собой близкие по строению низкомолекулярные вещества, различающиеся по величине изоэпек- трической точки. При электрофорезе каждое из них занимает то место в пространстве между электродами, которое строго соответствует величине его р! (так как именно в этом участке амфолин электронейтрапен). Тем самым создается градиент pH. Каждый белок концентрируется при электрофорезе в той зоне градиента, pH которой совпадает с величиной р! данного белка. В результате достигается очень четкое распределение белков в соответствии со значениями их изоэлектрических точек. Отсюда и название метода — изоэлектрофокусирование.

Наиболее высокой разрешающей способностью при разделении природных белковых смесей обладает метод двумерного электрофореза, разработанный в 1975 г. В данном варианте процедуру электрофореза осуществляют сначала в одном направлении, а затем - в направлении, перпендикулярном первому. При этом стремятся сочетать разные модификации электрофореза. Например, сначала производят изоэлектрофокусирование, а затем - разделение по величине молекул в пористом ПААГ. В качестве второй стадии можно использовать и иммуноэлектрофорез, который осуществляется в геле, содержащем поливалентную антисыворотку (смесь антител к разделяемым белкам). Эффективность двумерного электрофореза видна из следующего сопоставления. В сыворотке крови содержится более 100 белков. При электрофорезе на бумаге их удается раз- делить на 5, а в ПААГ - примерно на 20 фракций. Применение же двумерного электрофореза позволяет получить свыше 30 фракций. Аналогичным методом полипептидные цепи клеточных белков кишечной палочки удалось разделить почти на 2 000 фракций!



загрузка...