загрузка...
 
РЕПЛИКАЦИЯ (СИНТЕЗ ДНК)
Повернутись до змісту

РЕПЛИКАЦИЯ (СИНТЕЗ ДНК)

Удвоение наследственного материала, которое предшествует делению клеточного ядра, а затем и всей клетки, осуществляется путем репликации каждой молекулы ДНК. Процесс этот очень сложный и обеспечивается большой группой ферментов и других белков. Он требует расхождения двух нитей ДНК с тем, чтобы на каждой из них можно было синтезировать комплементарную ей половину.

Инициирование репликации ДНК наступает в S-фазе клеточного цикла. Оно происходит путем локального разделения полинук- леотидных цепей в пункте, именуемом точкой начала репликации. Здесь имеется специфическая последовательность оснований с повышенной долей пар А     Т, обеспечивающая

Рис. 2-16. Синтез дочерних цепей ДНК на расплетенном участке родительской ДНК [вертикальными прерывистыми стрелками отмечено положение репликативных вилок, горизонтальными - направление их продвижения вдоль оси двойной спирели; затенением выделены РнК-праймеры лидирующих цепей (А) и фрагментов Оказаки (БД.

возможность сорбции особых белков, которые

способствуют расхождению цепей. Один из них - фермент хеликаза — расплетает двойную спираль, используя для этого энергию расщепления АТФ. Другие белковые молекулы (SSB- белки — Single Strand Binding Proteins) связываются с каждой одиночной цепью, препятствуя реставрации двойной спирали.

От точки начала репликации процесс расплетения постепенно продвигается вдоль молекулы ДНК в обе стороны. В каждой из них начальный участок, где двуспиральная ДНК разделяется на одиночные нити, обозначается как репликативная вилка (рис. 2-18). Именно здесь располагается хеликаза. Она продолжает раскручивать двойную спираль со скоростью около 50 п.о. в секунду (у эукариот).

Обе репликативных вилки, удаляясь друг от друга, проходят не всю молекулу ДНК, а лишь расстояние до таких же вилок, движущихся навстречу от соседних точек начала репликации. Полагают, что в молекуле эукариотической ДНК более тысячи таких точек, и все они включаются в процесс одновременно. Поэтому полная репликация генома млекопитающих завершается довольно быстро (8-9 ч), несмотря на медленное продвижение репликативных вилок.

Хеликаза не может вращать всю громадную молекулу ДНК, особенно если учесть и высшие структуры полимера. Поэтому ее продвижение не только ведет к разделению цепей, но и порождает тенденцию к усилению скрученности впереди хеликазы. Проблему снимает топоизомераза. Этот фермент способен разрывать фосфатную перемычку в одной из цепей ДНК. Тем самым создается возможность свободного вращения вокруг фосфоэфирной связи, находящейся на таком же уровне в другой цепи. Это помогает дальнейшему раскручиванию двойной спирали под действием приближающейся хеликазы.

Важно, что топоизомераза разрывает по- линуклеотидную цепь не путем гидролиза, а посредством «переключения» З'-фосфоэфир- ной связи с дезоксирибозы на группу -ОН радикала тирозина в молекуле самого фермента. Поэтому реакция легко обратима: после завершения проворачивания фосфодиэфирный мостик восстанавливается (без затраты энергии), а освободившаяся топоизомераза может повторять свою акцию в других участках двойной спирали. Известна и такая топоизомераза, которая разрывает обе полинуклеотидные цепи, а после «проворачивания» двойной спирали вновь сшивает их.

Синтез новой цепи ДНК на одноцепочечной матрице требует наличия всех четырех субстратов - (1-АТФ, (1-ГТФ, (1-ЦТФ и (1-ТТФ. Осуществляется он под действием ДНК-полимераз. Их известно несколько типов. Как и РНК-полимераза, все они образуют фос- фодиэфирные связи только в направлении 5'—>3' (см. раздел 2.3.1). Однако, в отличие от нее, ДНК-полимеразы не могут соединить два мононуклеотида (т.е., инициировать синтез новой цепи), а способны лишь удлинять уже существующую цепь, даже если она является ри- бонуклеотидиой. Такая начальная цепь, обозначаемая термином праймер (затравка), синтезируется с участием особой РНК-полимеразы, которую именуют праймазой. Субстратами ее являются, естественно, рибонуклеотиды в их трифосфатной форме. Они фиксируются водородными связями на родительской (дезокси- рибонуклеотидной!) цепи, образуя комплементарные пары оснований (против Г оказывается Ц будущего праймера, против Ц - Г, против Т - А, но против А размещается У, а не Т, поскольку ТМФ не включается в состав РНК). По мере выстраивания рибонуклеотидов на дезок- сирибонуклеотидной матрице праймаза осуществляет замыкание фосфоэфирных связей 5'—>3' (как это было показано на рис. 2-12). И только после завершения синтеза праймера (длиной от 2 до 10 рибонуклеотидных звеньев) дальнейший рост начинает осуществлять ДНК-полимераза. Она продолжает наращивание 3'-конца новообразуемой цепи, но уже де- зоксирибонуклеотидными мономерами, которые поочередно выстраиваются на одноцепочечной нити родительской ДНК.

Синтез дочерней полинуклеотидной цепи начинается в репликативной вилке сразу после ее возникновения и продолжается по мере ее продвижения. - сначала в форме затравочной РНК (праймера), а затем в виде ДНК, копирующей родительскую нить. Эта копия формируется в антипараллельном направлении, как это и свойственно двойной спирали ДНК. Иными словами, синтез дочерней цепи в направлении 5'—>У происходит вдоль направления 3'—>5' одиночной нити материнской ДНК, как это показано на рис. 2-18. Образующаяся дочерняя копия этой нити обозначается термином лидирующая цепь. Другая нить материнской ДНК не может удваиваться таким способом, ибо ее расплетение протекает в направлении 5'—*3' и, следовательно, синтез дочерней ДНК на ней возможен только в направлении, обратном движению репликативной вилки (см. рис. 2-18). Создание этой дочерней нити (обозначаемой как запаздываюгцая цепь) начинается в виде отдельных отрезков, которые затем соединяются между собой (не покидая матрицу). Эти отрезки называются фрагментами Оказаки (в честь открывшего их ученого); их длина составляет от 100 до 200 мононуклео- тидных звеньев. Именно с таким интервалом появляется (по мере продвижения репликативной вилки) каждый новый праймер запаздывающей цепи (см. рис. 2-18). По завершении синтеза праймера дальнейшее наращивание этой цепи осуществляет уже ДНК-полимераза (тоже в направлении 5'—»3')» продолжая это почти вплоть до достижения праймера предыдущего фрагмента Оказаки (возникшего ранее). Оставшуюся небольшую брешь достраивает ДНК-полимераза другого типа. Достигнув предыдущего праймера, она поочередно отщепляет от него рибонуклеотидные звенья, заменяя их соответствующими дезоксирибонуклеотид- ными. Когда весь праймер будет заменен, особый фермент - ДНК-лигаза - соединяет З'-конец вновь образованного отрезка с 5'-кон- цом предыдущего фрагмента Оказаки (эта реакция несвойственна полимеразам нуклеиновых кислот и требует затраты энергии в виде расщепления АТФ до АМФ и ФФ).

Как отмечалось, от каждой точки начала репликации расходятся две репликативных вилки, движущихся в противоположных направлениях. Поэтому дочерняя цепь ДНК, которая синтезируется как лидирующая вслед за движением одной вилки, со стороны другой репликативной вилки формируется (на той же родительской цепи) как запаздывающая цепь (т.е.. прерывисто), и самый ранний из ее фрагментов Оказаки стыкуется с лидирующей частью цепи тоже ДНК-лигазой (см. рис. 2-18).

В ходе репликации ДНК расплетение двойной спирали является окончательным: возврата одиночных цепей родительской ДНК в исходное состояние невозможно, т.к. на каждой из них возникает новая цепь, которая вместе с родительской образует дочернюю двойную спираль, совершенно идентичную родительской. Это совершенство обеспечивается многими механизмами контроля. Одни из них реализуют упомянутые выше ДНК-полимера- зы. Как оказалось, эти ферменты не только наращивают полинуклеотидную цепь, но и способны исправлять свои ошибки. Если последний из включенных в цепь мононуклеотидов окажется почему-либо некоплементарным матрице, то ДНК-полимераза сразу же замечает свою ошибку и отщепляет (путем гидролиза) неверно вставленный фрагмент, а потом заменяет его «правильным» мономером, и только после этого способна продолжать наращивание цепи. Механизм коррекции неточного спаривания оснований дополняется системами репарации повреждений ДНК, вызываемых УФ-излучением, ионизирующей радиацией, химическими мутагенами и другими факторами. Эти системы осуществляют распознавание неправильностей в структуре любой из цепей двойной спирали, после чего вырезают более или менее длинный участок, содержащий повреждение, а затем (с участием ДНК-полиме- разы и ДНК-лигазы) заполнять возникшую брешь, используя неповрежденную цепь в качестве матрицы.

Регуляция репликации тесно связана с контролем клеточного цикла. Недавно в этой области достигнут значительный прогресс. У эукариотов выявлено целое семейство белков - циклимое, которые участвуют в регуляции деления ядерной клетки. Одни ИЗ НИХ (01/8) обеспечивают начало перехода фазы в синтетическую (8) фазу клеточного цикла, во время которой и осуществляется синтез ДНК (репликация). Белки другой группы - циклины в2/М - необходимы для инициирования митоза; они постепенно накапливаются на протяжении фазы вг и резко исчезают (разрушаются) в конце М-фазы (в регуляции мейоза участвует особый вариант - циклин А,).

Все циклины действуют не в одиночку, а в виде комплексов с другими белками, среди которых наиболее изучены цикли н-зависимые протеинкиназы. По существу, циклины являются регуляторными субъединицами этих ферментов, переводя их в активное состояние. Чаще всего протеинкиназы, образующие комплексы с циклинами 0^8, катализируют фосфорилирование определенных участков РНК-полимеразы, тем самым позволяя ей приступить к синтезу праймеров. Но есть и такие, которые аналогичным образом активируют ту или иную ДНК-полимеразу, обеспечивая дальнейшее развитие процесса репликации. Наконец, некоторые циклиновые комплексы не активируют, а подавляют полимеразу, - путем либо ее дефосфорилирования, либо фоефори- лирования в «неудобном» месте.

Циклины группы С2/М тоже взаимодействуют с определенными протеинкиназами, образуя белок-белковые комплексы, которые стимулируют переход в фазу митоза. Каждый такой комплекс обозначают как фактор, способствующий созреванию.

Все приведенные сведения отражают лишь начальный этап выяснения регуляторных механизмов репликации. Исследования по их уточнению ведутся очень интенсивно.



загрузка...