В свое время было замечено, что многие обратимые ингибиторы вовсе непохожи на субстрат. Их назвали аллостерическими ингибиторами, имея в виду совсем иную пространственную организацию таких молекул в сравнении с субстратом данного фермента. Несоответствие структур (отсутствие комплементар- ности) препятствует формированию стойких физико-химических взаимодействий между ними и активным центром. Угнетающее действие таких ингибиторов не удается ослабить повышением концентрации субстрата. Следовательно, они являются неконкурентными ингибиторами. Очевидно, они должны связываться не с адсорбционным участком, а где-то в ином месте, вне активного центра фермента. Эти места (сайты, — от английского site) стали называть аллостерическими центрами. Сорбируясь на определенном сайте, неконкурентный ингибитор вызывает такие конформационные изменения белка, которые вовлекают и активный центр фермента, затрудняя его функционирование. Степень угнетения в данном случае не зависит от количества субстрата и определяется только концентрацией ингибитора и степенью его сродства к данному ферменту.
Бывает и так, что взаимодействие какого- то лиганда с соответствующим ему аллостери- ческим участком не затрудняет, а, напротив, облегчает работу активного центра, вызывая, можно сказать, «благоприятные» конформационные подвижки в молекуле фермента. Очевидно, такое вещество следует называть активатором. Важно подчеркнуть, что многие активаторы ферментов оказывают свое влияние именно через аллостерические воздействия и, следовательно, относятся к эффекторам неконкурентного типа.
От термина «аллостерический центр» не стали отказываться даже после того, как выяснилось, что иногда его структура очень близка строению адсорбционного участка. Не обладая элементами каталитического центра, такой не совсем обычный аллостерический участок способен связывать субстрат, но не подвергает его химическим превращениям. При достаточном избытке субстрата могут произойти конформационные изменения фермента, отражающиеся на его работоспособности. Обычно она снижается. Тогда говорят об угнетении фермента избытком субстрата. Это - своеобразный вариант алпостерического угнетения. У некоторых ферментов наблюдается обратный эффект - не затруднение, а улучшение работы активного центра. Такой феномен называют аллостери ческой активацией фермента собственным субстратом.
К числу ферментов, угнетаемых избытком субстрата, относится уже упоминавшаяся аце- тилхолинэстераза Помимо анионного центра в адсорбционном участке, она имеет еще и периферический анионный центр (ПАЦ), который находится за пределами активного центра, но тесно примыкает к нему. Решающими компонентами ПАЦ являются радикалы трп- 286 и асп-74, а также трех остатков тирозина (в положениях 72, 124 и 341). Фиксация ацетил- холина на ПАЦ несколько изменяет ориентацию трп-86 адсорбционного участка, тем самым затрудняя работу всего активного центра. Однако по сродству к ацетилхолину ПАЦ существенно уступает адсорбционному участку АХЭ. Поэтому замедление гидролиза ацетил- холина начинается лишь при высоких концентрациях этого субстрата.
Аллостерические центры бывают (точнее — известны) далеко не у каждого фермента. Обычно они присущи достаточно сложно устроенным белковым молекулам, особенно тем, которые обладают четвертичной структурой (и потому легче поддаются весомым конформа- ционным перестройкам). В молекуле может быть один, а может быть и несколько аллосте- рических центров, обычно очень разных. Благодаря их избирательности, активность фермента по-разному меняется под действием различных эффекторов, в роли которых могут выступать те или иные метаболиты, вторичные посредники, лекарственные препараты и т.д. При этом принципиально важна обратимость вызываемого эффекта. Ферменты, способные обратимо изменять интенсивность своей функции под действием определенных метаболитов, называются регуляторными.
Можно заключить, что природа в ходе эволюции специально «отбирала» и «шлифовала» удачные фрагменты белковой молекулы, которые мы теперь называем аллостерическими центрами. Шлифовала их (и не только у ферментов!) именно как инструмент для реализации посреднической миссии молекул-«ин- форматоров». В этом смысле вполне оправдан термин «центр» - то есть, участок, специально созданный для выполнения какой-то конкретной функции (в данном случае - узнавание строго определенного вещества и жестко заданный характер реагирования на его воздействие). Вместе с тем, сложность и разнообразие рельефа белковой молекулы делают возможным синтез какого-либо вещества, комплементарного достаточно протяженному участку поверхности фермента. Его взаимодействие с этим участком может вызвать конформационные сдвиги, отражающиеся на эффективности ферментативного катализа. Именно так действуют многие искусственно синтезированные лекарственные препараты. Соответствующие участки фермента тоже называют аллостериче- скими центрами, хотя в данном случае природа не «придумывала» их специально, а просто удалось создать комплементарное им вещество-эффектор. Детальное выяснение устройства поверхности белковой молекулы, ее третичной и четвертичной структуры позволяет предсказывать строение веществ, которые могут оказаться эффективными лигандами. Целенаправленный синтез веществ с заданными физикохимическими характеристиками (и последующее испытание серии таких веществ) является наиболее перспективным направлением в разработке лекарств новых поколений. Оно уже дает свои плоды: десятки препаратов, созданных таким путем, применяются в практической медицине.
В заключение раздела важно подчеркнуть, что активному и всем аллостерическим центрам вместе принадлежит ничтожная доля молекулы фермента. Неверно, однако, было бы расценивать остальную ее часть просто в качестве инертного носителя этих функционирующих группировок. Эти остальные структуры тоже существенны для работы фермента. В частности, именно их особенностями предопределяется характер возможных конформаиион- ных подвижек как в ходе ферментативного катализа, так и в реализации регуляторных воздействий активаторов и ингибиторов, особенно аллостерических.
Любая ферментативная реакция протекает через серию промежуточных стадий - так называемых элементарных актов. Но все они могут быть сведены к трем основным, принципиально различным этапам (рис. 4-9).
Рис. 4-9. Основные этапы ферментативного катализа.
Этап I - сорбция субстрата (8) на активном центре фермента (Е) с образованием фермент- субстратного комплекса (Е-8). Реализуется путем формирования слабых типов связи, а потому протекает легко и полностью обратим. Конформационные подвижки в процессе сорбции усиливают пространственное соответствие активного центра структуре субстрата. Приспособление («подгонка») их друг другу обеспечивается в основном адсорбционным центром и характеризует эффективность его работы.
Этап II - ковалентные преобразования субстрата в составе фермент-субстратного комплекса, в результате чего появляется комплекс фермента с химически измененным субстратом (Е • 8’), т.е. с почти готовым продуктом (Р). В этом этапе участвует каталитический центр. Он обеспечивает разрыв одних ковалентных связей, формирование других. Поэтому данный этап необратим (за исключением тех реакций, которые по природе своей обратимы, - для них в схеме на рис. 4-9 обозначены пунктиром стрелки в обратном направлении). Необходимость ковалентных превращений субстрата делает этот этап, как правило, гораздо более трудным и медленным, чем этап I (да и чем этап III тоже). Поэтому константа скорости этого этапа (к+2) обычно гораздо меньше всех остальных частных констант скорости (к+ь к_ь к+з). Иными словами, именно этап II определяет (лимитирует) скорость всей реакции в целом, а величина к+2 дает количественное представление об эффективности работы каталитического центра.
Этап III - десорбция готового продукта реакции (Р) из комплекса Е ? 8’, которая сопровождается освобождением фермента в его исходном виде. Чаще всего этот этап протекает легче предыдущего, но, как и этап II, является необратимым (опять же, за исключением случаев катализа обратимой химической реакции).
Здесь уместно отметить, что многие белковые молекулы связываются со своим специфическим лигандом примерно так же. как фермент сорбирует молекулу субстрата на этапе 1.
Отличаются же они неспособностью химически преобразовывать молекулы связанного лиганда. К наиболее известным представителям таких белков относятся гемоглобин, который нековалентно присоединяет кислород в легких и разносит его по организму. Другой пример - клеточные рецепторы, которые обратимо связывают определенный гормон или медиатор, а наступающей при этом своей кон- формационной перестройкой передают соответствующий сигнал внутриклеточным структурам. Все белки такого рода являются как бы ферментами, реализующими этап I, но неспособными осуществлять каталитическую функцию (т.е., этапы II и III). Поэтому к ним применимы те методы кинетической характеристики, которые разработаны для количественной оценки функциональных возможностей этапа I ферментативной реакции.
