загрузка...
 
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛАВНЫХ КИНЕТИЧЕСКИХ КОНСТАНТ
Повернутись до змісту

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛАВНЫХ КИНЕТИЧЕСКИХ КОНСТАНТ

Для расчета субстратной константы Ks необходимо уствновить частные константы скорости к+1 и к.ь что требует очень сложных экспериментов. Величину Км определить несравненно легче, - достаточно измерить скорость реакции при разных концентрациях субстрата. Поэтому предпочитают пользоваться именно константой Михаэлиса, тем более что она обычно почти совпадает по величине с субстратной константой.

Вместе с тем, как видно на рис. 4-11, точность определения Угол* (а отсюда и Км) сравнительно невелика. Во-первых, из-за экспериментальных погрешностей, присущих любым измерениям, нет уверенности, что проведенная кривая действительно достигла предела. Во- вторых, не всегда удается создать достаточно высокие концентрации субстрата (например, из-за плохой его растворимости). Преодолеть эти затруднения можно путем преобразования графика Михаэлиса-Ментен в линейную форму. Одну из таких возможностей реализовали Г. Лайнуивер и Д. Берк. Предложенный ими способ двойных обратных величин основан на известном правиле: если две величины равны между собой, то равны и обратные им величины. Следовательно, уравнение [4-1] может быть представлено в таком виде:

Это соотношение удобнее переписать в несколько иной форме:

Этим преобразованием достигается линеаризация кривой Михаэлиса-Ментен, повышающая надежность усреднения экспериментальных измерений, а тем самым — и точность экстраполяции их к высоким концентрациям субстрата, которая необходима для определения значений и Упих, и Км.

Итак, график зависимости Ус от 1/[Б] представляет собой прямую линию (рис. 4-12). Ее продолжение пересекает ординату в точке, равной 1 Л/щах (она соответствует нулевому значению абсциссы 1/[8], т.е., бесконечно большой концентрации субстрата, которую вообще невозможно создать в эксперименте). Абсциссу же экстраполяция этой линии пересекает при (1/и) = 0, т.е. в точке, отвечающей значению (-1/Км), как это следует из уравнения [4-3].

Экспериментальное определение главных кинетических констант в присутствии эффекторов дает возможность количественно оценить их способность к нековалентному взаимодействию с ферментом. В частности, оно позволяет довольно просто устанавливать тип угнетающего действия обратимых ингибиторов и определять константу угнетения.



загрузка...