Далеко не все вещества взаимодействуют с молекулой фермента нековалентно. Многие соединения способны химически реагировать с белком. Если вызываемая ими ковалентная модификация фермента ведет к потере каталитической активности, то такие вещества относятся к ингибиторам необратимого типа. Некоторые из них вызывают денатурацию белка, т.е. инактивируют практически любой фермент. Поэтому их называют неспецифическими ингибиторами. К таким относятся, в частности, катионы тяжелых металлов (ртуть, свинец, медь и др.).
Есть, однако, и такие необратимые ингибиторы, которые в большей или меньшей степени обладают избирательностью действия. Она обусловлена способностью таких эффекторов реагировать не с любыми белками, а только с вполне определенными группировками в активном центре или в других участках молекулы конкретного фермента (или группы близких по строению ферментов).
Взаимодействие фермента с необратимым ингибитором представляет собой одностороннюю бимолекулярную реакцию:
Поскольку концентрация ингибитора обычно значительно превышает концентрацию фермента, рано или поздно весь фермент превратится в неактивное производное Е-1. В такой ситуации разные ингибиторы, взятые в одинаковых концентрациях, различаются лишь временем, необходимым для достижения полного угнетения фермента: более сильные делают это быстрее. Измеряя ферментативную активность через разные сроки от начала инкубации фермента с определеиной концентрацией такого ингибитора, можно рассчитать константу скорости необратимого угнетения:
где: [I] — концентрация ингибитора в инкубационной смеси; I - время от начала инкубации (обычно - в минутах); и0 - скорость ферментативной реакции в отсутствие ингибитора; - скорость реакции после инкубации с ингибитором в течение времени и 1п - натуральный логарифм.
Чем меньше ингибитора и/или времени требуется для развития его действия, тем он эффективнее и, значит, тем больше величина константы необратимого угнетения (в отличие от обратимых ингибиторов, она является константой скоростиу а не равновесия).
Избирательность некоторых необратимых ингибиторов обусловлена их сходством с субстратом соответствующего фермента. Однако в отличие от субстрата, такие ингибиторы образуют прочную ковалентную связь с радикалом той или иной аминокислоты в составе активного центра и тем самым блокируют его работу. При этом, как и в случае обратимого угнетения конкурентного типа, высокие концентрации субстрата затрудняют доступ ингибитора к активному центру и, как следствие, ослабляют его угнетающее действие («защищают» свой фермент).
Своеобразным механизмом действия обладают фосфорорганические ингибиторы (ФОИ). Некоторые из них были специально синтезированы в качестве боевых отравляющих веществ нервно-паралитического действия (табун, зарин), инсектицидов (дихлофос, карбофос и др.), а некоторые - и как хорошие смазки в различных механизмах. Многие из них являются сильными ингибиторами ацетилхолинэстеразы (АХЭ), поскольку обладают сходством с ее субстратом - ацетилхолином (формула его показана на рис. 4-7). Только вместо ацетильного остатка они содержат фосфорильную группу, соединенную сложноэфирной связью с холи- ном или каким-либо другим спиртом (X—ОН):
Радикалы К фосфорильной группы (она выделена жирным шрифтом) могут быть представлены алкилами, алкоксилами, алкиламина- ми, которые легко сорбируются вблизи серина- 203 активного центра, где, как выяснилось, имеются достаточно обширные гидрофобные зоны. Это способствует «правильной» ориентации сложноэфирной группы ингибитора на каталитическом участке фермента. Как и в случае истинного субстрата (ацетипхолина), начальная стадия акта катализа (см. рис. 4-7) приводит к отщеплению спирта (Х-ОН) и ковалентному присоединению кислотного фрагмента к серину-203. И только теперь обнаруживается «подмена» истинного субстрата: вместо остатка уксусной кислоты ковалентно связанным с серином-203 оказывается производное гораздо более сильной кислоты - фосфорной. Этот фосфорильный фрагмент почти совсем не поддается удалению с активного центра и тем самым прекращает его работу. Аналогично действуют и такие ФОИ (обычно еще более токсичные), которые вместо сложноэфирной связи с Х-ОН содержат кислотоан- гидридную связь фосфорильного фрагмента с НЕ или НСИ.
Как известно, холинэргическая передача нервного импульса осуществляется путем выброса нервным окончанием порции ацетилхо- лина. Этот медиатор обратимо воздействует на холинорецепторы клетки-мишени, но одновременно подвергается гидролизу под действием АХЭ. Высокой активностью мембранной АХЭ обеспечивается быстрое разложение ацетилхо- лина (ведущее к удалению его с рецепторов) и, следовательно, гарантируется кратковременность передачи импульса. Угнетение АХЭ под действием яда приводит сначала к усилению возбужденности клеток-мишеней, а затем - к полной дезорганизации работы холинэргиче- ских структур. К этому сводятся главные эффекты ФОИ в организме. Однако многие из таких ядов могут воздействовать и на другие белки, в том числе — на сериновые протеиназы.
Во всех этих случаях молекула ФОИ расщепляется ферментом точно так же, как и молекула настоящего субстрата, но один из образующихся продуктов остается ковалентно связанным с ферментом и полностью блокирует его работу. Такого рода ингибиторы называют «ложными» субстратами (псевдосубстратами)
Ингибиторами псевдосубстратного действия бывают не только искусственные соединения, как ФОИ. Не так давно выяснилось, что и в живой природе вырабатываются вещества, названные эндогенными ингибиторами за их способность угнетать тот или иной фермент собственного организма (или попавший извне). По своему строению они обычно являются белками (или пептидами). Многие из них обладают выраженным предпочтением к протеолитическим ферментам, что обычно зафиксировано в названиях соответствующих белков плазмы крови: агантитрипсин, агантихимотрипсин, антитромбин, аг-антиплазмин, а2-макроглобулин. Оказалось, что по механизму угнетающего действия они относятся к «плохим» субстратам. Осуществив расщепление одной из пептидных связей в молекуле такого белка-ингибитора, протеина- за не может затем избавиться от «обломков» расщепленного псевдосубстрата и остается блокированной. Эндогенные ингибиторы вносят очень важный вклад в регуляцию различных процессов.
