Помимо ряда уже упоминавшихся субстратов МтО, сотнями граммов в сутки образуются в организме человека и такие метаболиты. как пировиноградная кислота (ПВК) и а-кетоглутарат (а-КГ). Редокс-потенциап каждой из этих а-кетокислот (-0,7 В) намного ниже, чем у никотинамидных коферментов (-0,32
В). Такая разница создает большой энергетический ресурс, которым природа не могла не воспользоваться. Если обычные субстраты полной цепи поставляют НАД-//2 комплексу I с помощью простых («одноступенчатых») НАД-дегидрогеназ, то для а-кетокислот в матриксе митохондрий существуют специальные надмолекулярные ансамбли. Каждый из них производит НАД-//г лишь после предварительного декарбоксилирования а-кетокислоты (отщепление СОг). Отсюда и название - мупъти- ферментный комплекс окислительного декарбоксилирования а-кетокислот (на рис. 5-10 он обозначен как ОДК). Реализуя многостадийный процесс, этот комплекс, по существу, удлиняет начальное звено полной дыхательной цепи, а главное - использует освобождаемую при этом энергию для образования макроэрги- ческих соединений. Поэтому всю систему окисления а-кетокислот (включая мембранные комплексы I, III и IV) удобно обозначать термином удлиненная цепь митохондриального окисления (имея в виду, что путь пары атомов водорода к комплексу I длиннее, чем в полной дыхательной цепи).
Комплекс окислительного декарбоксилирования объединяет три разных фермента, каждый из которых содержит свою простетиче- скую группу. Кроме того, в его работу вовлечены еще и два кофермента - НАД и Ко А, строение которого показано на рис. 2-5. Там же отмечено, что реактивным центром КоА (ко- фермент ацилирования) является группа -ЗН. Поэтому в уравнениях реакций его обычно представляют как МБ-КоА.
Простетичеекая группа одного из ферментов (Е0 представлена тиаминдифосфатом (ТДФ) - фосфорилированной формой витамина В] (рис. 5-13). В этой молекуле углерод, заключенный между атомами азота и серы тиа- золового кольца, обладает высокой реакционной способностью. Именно к нему присоединяется субстрат в ходе ферментативной реакции. Поэтому тиаминдифосфат кратко обозначают как НС=ТДФ (как это сделано на рис. 5-15).
Другой фермент комплекса (Ег) имеет в качестве простетической группы липоевую кислоту (рис. 5-14), которая соединена кислотоамидной (пептидной) связью с одним из ли- зильных радикалов апофермента. Функционально активной частью липоевой кислоты (Л.к.) является дисульфидная группа, способная легко восстанавливаться, присоединяя два атома водорода (см. рис. 5-14).
Наконец, третий фермент комплекса (Е3) в качестве простетической группы содержит молекулу ФАД (см. рис. 2-7).
Объединение ферментов в стабильный комплекс является залогом быстрого и упоря-
Рис. 5-14. Окисленная (А) и восстановленная (Б) формы липоевой кислоты (Л.к.) и их сокращенные обозначения (В и Г).
доченного течения последовательных стадий катализируемого процесса. При этом продукт действия одного фермента сразу же поступает на активный центр следующего, чем предотвращается рассеяние промежуточных метаболитов в окружающей среде.
Рис. 5-15. Окислительное декарбоксилирование ПВК: стадии процесса и итоговое уравнение.
Известны два комплекса окислительного декарбоксилирования а-кетокислот, а именно: пируват-дегидрогеназный и а-кетоглутарат- дегидрогеназный. Они различаются строением белковой части двух из трех своих ферментов (Е1 и Е2), ио не коферментами или простетиче- скими группами. Механизм их функииониро- вания представлен на рис. 5-15 на примере окислительного декарбоксилирования ПВК.
Первой на субстрат воздействует пируват- декарбоксшаза (Еі), которая производит отщепление СО2. Как показано на рис. 5-15 (стадия І), сначала ПВК углеродом своей карбонильной группы присоединяется к ферменту (точнее - к активному углероду его тиаминди- фосфата), а затем теряет карбоксильную группу в виде углекислоты, превращаясь в гидро- ксиэтильный фрагмент, ковалентно связанный с ТДФ.
Вторую стадию процесса можно считать самой важной. Как видно на схеме, гидрокси- этильный остаток теряет два атома водорода. Один из них переходит к углероду тиамииди- фосфата, а другой - к одному из атомов серы липоевой кислоты (второй атом серы соединяется с тем, что осталось от бывшего гидрокси- этильного фрагмента, занимая место, принадлежавшее тиаминдифосфату). Фактически на этой стадии происходит окисление гидрокси- этильного остатка до остатка уксусной кислоты, который сразу же передается на Л.к. (про- стетическую группу второго фермента комплекса). Принятое обозначение Е2 - дигидро- липоил-трансацетилаза — обусловлено тем, что этот фермент катализирует и стадию 3 процесса, осуществляя дальнейший перенос ацетильного остатка (см. ниже). Но все же именно дегидрогеназное действие (сталия 2, рис. 5-15) является самым важным эффектом фермента Е2. Окисляя продукт стадии 1 за счет восстановления собственной липоевой кислоты, ди- гидролипоил-трансацетилаза заодно переносит на нее возникающий остаток уксусной кислоты, вытесняя при этом пируватдекарбоксилазу (Е[) в ее исходной форме (#С=ТДФ-Еі). Энергия этого окисления концентрируется в виде макроэргической связи между ацетильным остатком и атомом серы липоевой кислоты.
На стадии 3 этот ацетильный фрагмент вместе с макроэргической связью передается на кофермент А (образуя ацетил-КоА), а сама трансацетилаза освобождается в восстановленной форме (точнее, восстановленной оказывается просгетическая группа фермента, превратившаяся в остаток дигидролипоевой кислоты).
Третий фермент комплекса (Ез) завершает процесс, возвращая дигидролипоевую кислоту дигидролипоил-трансацетилазы в окисленную (дисупьфндную) форму. Отсюда и название фермента - дигидролипоилдегидрогеназа. Отнимая два атома водорода у дигидролипо- ильной группы трансацетилазы, он сначала присоединяет их к собственной простетиче- ской группе, каковой является ФАД (стадия 4), а затем, на стадии 5, передает на молекулу НАД, превращая ее в НАД-//2, - субстрат комплекса I системы МтО.
Таким образом, суммарный итог работы пируват-дегидрогеназного комплекса сводится к тому, что субстрат (ПВК) превращается в активную форму уксусной кислоты (ацетил- КоА), подвергшись сначала декарбоксилиро- ванию, а затем - окислению путем отнятия водорода, который в конечном счете оказывается в составе НАД-//2 (см. итоговое уравнение на рис. 5-15). Здесь важно подчеркнуть, что образование СС>2 не связано непосредственно с окислительными процессами и, уж тем более, не является следствием присоединения кислорода к углероду окисляемого вещества: такого процесса в митохондриях попросту нет. В этом - еще одно отличие митохондриального окисления от обычного горения.
Аналогичным образом работает и а-кето- глутарат-дегидрогеназный комплекс. От ПВК молекула а-кетоглутаровой кислоты отличается тем, что вместо группы —СНч несет на карбонильном углероде более крупный радикал -СН2-СН2-СООН. Теряя С02, эта молекула превращается в янтарную кислоту (сукцинат): НООС-СН2-СН2-СООН.
Понятно, что лишь первые два фермента а-КГ-дегидрогеназного комплекса обладают иной субстратной специфичностью, чем в комплексе для ПВК. Соответственно их называют а-КГ-декарбоксилазой и дигидролгтоат-тронс- сукцинилазой. С поправкой на специфику радикала, все уравнения процесса окислительного декарбоксилирования а-КГ выглядят точно так же, как это показано на рис. 5-15 для ПВК. Итоговое же уравнение этого процесса приведено на рис. 5-16. Можно видеть, что конечным продуктом окислительного декарбоксилирования а-КГ является активная форма янтарной кислоты - сукцинил-КоА (наряду с обычными для такого процесса молекулами С02 и НАД Яг).
Есть данные, что комплексы окислительного декарбоксилирования а-кетокислот примыкают к внутренней мембране митохондрий (со стороны матрикса). Это облегчает передачу митохондриальному комплексу I атомов водорода от НАД-#2, генерируемого в ходе декар- боксилирующего окисления а-кетокислот. Дальнейший транспорт электронов и протонов по полной дыхательной цепи приводит к образованию 2,5 молекул АТФ в расчете на каждую молекулу окисленного пиру вата или а-КГ.
Рис. 5-16. Итоговое уравнение процесса окислительного декарбоксилирования а-кГ.
Но этим количеством АТФ не исчерпывается энергетическая эффективность удлиненной цепи МтО. Ибо еще одним из конечных продуктов здесь является молекула ацетил- КоА либо сукцинил-КоА. В каждой из них ацильный остаток соединен с атомом серы ко- фермента А не обычной, а макроэргической связью (как это показано на рисунках 5-15 и 5-16). Она легко трансформируется в макроэр- гическую связь молекулы АТФ (или ее аналогов — других нуклеозидтрифосфатов). Именно такова судьба основной массы молекул сукци- нил-КоА. Механизм трансформации показан на рис. 5-17.
Процесс, катализируемый сукцинат-тио- киназой, протекает в две стадии. Сначала кофермент А «вытесняется» неорганическим фосфатом, но с сохранением макроэргической связи в составе образующегося сукцинил- фосфата. Затем остаток фосфата вместе с макроэргической связью переносится на ГДФ, превращая его в ГТФ, а янтарная кислота (сук- цинат) выделяется в свободном виде. По существу, это реакция фосфорилирования нуклео- зиддифосфата (в данном случае — молекулы ГДФ). Однако оно не может быть названо
Рис. 5-17. Фосфорилирование гуанозиндифосфата за счет макроэргической связи молекулы сукцинил-КоА.
окислительным, ибо энергетическая «подпитка» обеспечивается здесь не трансмембранным градиентом протонов и вообще не зависит от работы дыхательной цепи. Это - так называемое фосфорилирование на уровне субстрата, что означает: внедрение фосфата в нуклеозид- дифосфат путем использования готовой макроэргической связи, возникшей в каком-либо субстрате. В данном случае им является сукцинил-КоА. В дальнейшем изложении будут встречаться и другие метаболиты такого рода.
Субстратным фосфорилированием называют феномен синтеза АТФ (и его аналогов) , осуществляемого за счет энергии макроэргических связей, появляющихся в каком-либо субстрате в ходе его метаболических превращений.
В приведенном примере специфика фермента такова, что фосфатный остаток переносится не на АДФ (как чаше и бывает), а на ГДФ, превращающийся в молекулу ГТФ. Однако в клетках есть активные нуклеозидди- фосфаткиназы (раздел 2.2.2), которые легко осуществляют взаимообмен фосфатными остатками между различными мононуклеотидами, богатыми энергией. Поэтому и образующийся ГТФ находится в равновесии с АТФ:
При подсчете энергетических балансов запас «полезной» энергии выражают обычно числом молекул именно АТФ. Так удобнее, тем более что АТФ количественно преобладает над своими аналогами и участвует в подавляющем большинстве энергоемких процессов. Поэтому не будет ошибкой считать, что превращение сукцинил-КоА в молекулу янтарной кислоты может быть использовано для образования молекулы АТФ из АДФ и фосфата.
Итак, в удлиненной дыхательной цепи энергетический итог может достигать 3,5 молекул АТФ на молекулу окисленного субстрата. Из них 2,5 молекулы АТФ образуются путем нестехиометрического процесса окислительного фосфорилирования, а еще одна - посредством субстратного. Поэтому удлиненная цепь энергетически выгоднее других вариантов системы МтО.
Независимость субстратного фосфорилирования от митохондриального окисления важна, по меньшей мере, в двух отношениях.
Во-первых, становится возможной выработка АТФ вне митохондрий, за счет только тех метаболических реакций, которые протекают в цитоплазме. Благодаря этому источнику энергии многие клетки могут оставаться жизнедеятельными даже при недостатке кислорода (или полной его недоступности). Подробнее этот аспект будет рассмотрен в разделе
посвященном бескислородному распаду углеводов (.гликолиз).
Во-вторых, появление макроэргической связи в молекуле какого-либо вещества вовсе не обязательно должно завершаться субстратным фосфорилированием. Такая связь зачастую непосредственно используется для энергетического обеспечения химического соединения этого вещества с другим. Иными словами - для реакции синтеза сложной молекулы из более простых. Самое важное заключается в том, что такой биосинтез не требует затраты АТФ. Происходит прямая утилизация макроэргической связи, без предварительной наработки АТФ, необходимого для почти всякого биосинтеза. Причем, утилизация целевая, приспособленная для данных конкретных участников процесса.
В частности, сукцинил-КоА может напрямую использоваться в биосинтетических реакциях. Например, для синтеза гема. Это очень сложный, многоступенчатый процесс. Но начинается он с реакции между сукцинил-КоА и глицином (рис. 5-18). Продукт их конденсации служит материалом для построения пятичленных пиррол ьных колец, входящих в состав порфириновой структуры гема и гемоподоб- ных веществ.
Лишь малая доля возникающего сукцинил- КоА идет на биосинтез более сложных моле-
Рис. 5-18. Первая стадия биосинтеза гема.
кул. Основная же его масса утилизируется реакцией субстратного фосфорилирования.
Напротив, ацетип-КоА - продукт другого комплекса окислительного декарбоксилирова- ния - практически весь используется не для прямого получения АТФ, а в биосинтетических процессах. Главнейшими из них являются:
синтез лимонной кислоты;
синтез кетоновых тел;
синтез жирных кислот;
синтез холестерола и других стеролов.
Значительно преобладает первая из перечисленных реакций. Именно с нее начинается так называемый цикл трикарбоновых кислот. Остальные три процесса будут рассмотрены в главе 7, посвященной метаболизму липидов (разделы 7.3.4, 7.4 и 7.7.1).
Уксусная кислота, входящая в состав аце- тил-КоА, - самое простое из всех перечисленных выше органических веществ, возникающих при митохондриальном окислении. Вместе с тем, эта двухуглеродная молекула чрезвычайно стабильна и не может быть разрушена без применения жестких воздействий, несовместимых с жизнью. Природа смогла, однако, «изобрести» особый прием для преодоления этой трудности. Он заключается в том, что ацетильный фрагмент сначала переносится с ацетил-КоА на щавелевоуксусную кислоту (оксалоацетат) с образованием шестиуглеродной лимонной кислоты. Последняя содержит три карбоксильные группы и одну гидроксильную, а потому вполне «удобоварима» для декарбоксилаз и дегидрогеназ. Их поочередное воздействие приводит в итоге к появлению молекулы воды и двух молекул С02, что по числу углеродных атомов эквивалентно составу ацетильного фрагмента. В конечном счете, лимонная кислота (цитрат) вновь превращается в щавелевоуксусную (ЩУК), готовую принимать очередной ацетильный фрагмент и снова повторять весь путь.
Этот циклический процесс, в ходе которого ацетильные фрагменты расщепляются до С02 и Н20, обозначают как цикл трикарбоновых кислот или цикл лимонной кислоты.
Ферменты цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) локализованы в митохондриях. Некоторые из его промежуточных метаболитов становятся субстратами дыхательных цепей - полной, укороченной или удлиненной. Это значит, что каждая дегидрогеназа, выполняя свою роль в реакциях собственно цикла, вместе с тем «дает старт» транспорту пары атомов водорода по соответствующей дыхательной цепи от субстрата (метаболита цикла) до кислорода с образованием молекулы воды. Именно таким образом окислительное превращение (дегидроге- нирование) одного метаболита цикла в другой оказывается «состыкованным» с процессами митохондриального окисления, с которыми, в свою очередь, сопряжен механизм биосинтеза АТФ (окислительное фосфорилирование). Из всего этого следует, в частности, что ЦТК является строго аэробным процессом, т.е., может протекать только в присутствии кислорода и обязательно с его привлечением (абсолютная зависимость от кислорода).
ХИМИЗМ РЕАКЦИЙ ЦТК
Собственно ЦТК состоит из 8 последовательных стадий, каждую из которых реализует свой фермент или ферментный комплекс.
Рис. 5-19. Синтез лимонной кислоты и ее изомеризация: 1 - Цитретсинтетаза; 2 - Аконитаза.
На первой стадии в цикл вводится двухуглеродный фрагмент. Механизмом альдоль- ной конденсации цитратсинтетаза (1 на рис. 5-19) присоединяет к карбонильному углероду ЩУК (оксалоацетата) метальную группу ацетильного фрагмента молекулы ацетил-КоА (оба углеродных атома этого фрагмента отмечены звездочками здесь и в последующих реакциях ЦТК). Попутно фермент гидролизует макроэргическую связь (с освобождением
Н8-КоА), благодаря чему реакция синтеза лимонной кислоты становится практически необратимой.
Вторая стадия ЦТК заключается в изомеризации лимонной кислоты до изолимонной. Эту реакцию катализирует оконитаза (2 на рис. 5-19), которая легко отнимает от субстрата молекулу воды (с образованием г/г/с-аконито- вой кислоты), а затем вновь присоединяет ее, но уже с переменой позиции гидроксильной группы. Реакция обратима, и в состоянии равновесия на долю изоцитрата приходится менее 10% смеси обеих кислот. Однако поскольку в дальнейшем используется именно изоцитрат, вторая стадия ЦТК протекает фактически в одном направлении — в сторону образования изолимонной кислоты.
Третью стадию ЦТК обеспечивает изо- цитратдегидрогеназа, катализирующая превращение изоцитрата в а-кетоглутаровую кислоту (а-КГ). Как показано на рис. 5-20, сначала фермент отнимает от изоцитрата два атома водорода и передает их на свой кофермент, восстанавливая его до НАД-Н2. При этом гидроксильная группа изоцитрата превращается в кетогруппу, знаменуя возникновение щавелевоянтарной кислоты. - промежуточного продукта, который быстро преобразуется в а-КГ путем отщепления С02 за счет одной из трех карбоксильных групп (выделенной курсивом на рис. 5-20).
Следует заметить, что происходящее на третьей стадии образование СО2 не является окислительно-восстановительным процессом: просто окисление (дегидрогенирование) изоцитрата делает молекулу очень нестабильной, легко и необратимо теряющей карбоксильную группу.
Рис. 5-20. Превращения изолимонной кислоты под действием изоцитратдвгидрогеназы (3).
Четвертую стадию ~ окислительное де- карбоксилирование а-КГ - реализует мульти- ферментный комплекс, являющийся одним из вариантов начального звена удлиненной дыхательной цепи. Детально механизм работы таких комплексов рассмотрен в разделе 5.2.7, а на рис. 5-16 было приведено суммарное уравнение а-КГ-дегидрогеназной реакции. Здесь же оно дано немного подробнее, чтобы напомнить главные моменты процесса, осуществляемого а-кетоглутарат-дегидрогеназным комплексом (4 на рис. 5-21).
Как и третья стадия, четвертая протекает с выделением С02, - и тоже независимо от окислительных процессов: в данном случае оно даже предшествует дегидрогеназной реакции (но «спровоцировано» созданием кето-группы на предыдущей стадии). Кроме того, продуктами этой стадии являются ИАД Н2 и сукцииил-КоА.
Рис. 5-21. Реакции, катализируемые а-КГ-двгидрогеназным комплексом (4) и сукцинат-тиокиназой (5).
На пятой стадии молекула сукцинил- КоА используется для субстратного фосфори- лирования, реализуемого в данном случае сук- цинат-тиокиназои (5 на рис. 5-21). Его механизм рассмотрен ранее (см. рис. 5-17). Теперь же показан только суммарный итог процесса, в ходе которого макроэргическая связь сукци- нил-КоА строго стехиометрически обеспечивает реакцию синтеза ГТФ из ГДФ и фосфата
(что равнозначно образованию молекулы АТФ,
см. уравнение [5-3]).
Шестая стадия ЦТК сводится к окислению янтарной кислоты до фумаровой, которое катализирует флавиновый фермент - сукцинатдегидрогеназа (6 на рис 5-22). Ее обозначают еще как мембранный комплекс II системы МтО. Как отмечалось в разделе 5.2.3, он является одним из вариантов начального звена укороченной дыхательной цепи.
На седьмой стадии фумаратгидратаза (7 на рис 5-23), часто именуемая для краткости фумаразойу обеспечивает присоединение воды по месту двойной связи в молекуле фумарата. Тем самым происходит превращение его в Ь-изомер яблочной кислоты (Ь-малат), являющейся, как отмечалось в разделе 5.2.2, одним из субстратов полной дыхательной цепи.
Последняя — восьмая - стадия заключается в окислении яблочной кислоты под действием НАД-зависимая малатдегидрогеназы (8 на рис. 5-23). Лишая свой субстрат пары водородных атомов, этот фермент преобразует его в ЩУК (оксалоацетат).
Возникновение ЩУК на восьмой стадии - это не только завершение цикла, но и возможность его повторения, которое начинается с «посадки» очередного ацетильного фрагмента на высвободившуюся молекулу ЩУК. Интенсивность оборотов циклического процесса такова, что реальная концентрация ЩУК в клетке очень низка (менее 1 мкМ), несмотря на огромное количество метаболитов, перерабатываемых в ЦТК ежесуточно.
