загрузка...
 
§3. Рестриктазы как инструмент генетической инженерии
Повернутись до змісту

§3. Рестриктазы как инструмент генетической инженерии

Все химические реакции в живых клетках происходят с участием особых молекул - биологических катализаторов, называемых ферментами или энзимами. Воздействие таких молекул на другие, например молекулы ДНК, заключается в ускорении их химических превращений, причем молекулы самих катализаторов в ходе таких реакций не изменяются и используются многократно. Основополагающим в развитии генетической инженерии стало открытие группы ферментов, способных разъединять молекулы ДНК на фрагменты.

О    существовании таких ферментов стало известно в результате экспериментов по изучению размножения вирусов бактерий - бактериофагов. Вирусы представляют собой небольшие по размерам частицы, состоящие из одной или нескольких молекул нуклеиновой кислоты, заключенных в белковую оболочку, называемую капсид. Поскольку сами вирусы не имеют никаких органоидов и молекул, необходимых для биосинтеза нуклеиновых кислот и белков, для своего размножения они используют клетки других организмов. Такой способ существования относится к симбиотическому, и представляет собой такую разновидность симбиоза, как паразитизм. Как это и свойственно симбиотическим взаимоотношениям, каждый конкретный вид вирусов способен проникать только в клетки определенных видов, что связано, прежде всего, с особенностями поверхностных структур капсида вируса и клетки-хозяина. Другими словами, вирусу сначала необходимо прикрепиться к клетке снаружи. Если такое прикрепление оказывается возможным, вирусы некоторых видов проникают в клетки как целостные частицы, а вирусы других видов особым образом вводят в клетку свою нуклеиновую кислоту, что оказывается достаточным для размножения вируса. Дело в том, что именно нуклеиновая кислота несет в себе информацию о вирусных белках, поэтому проникшие целыми вирусы обязательно претерпевают так называемое «раздевание» - освобождение вирусной нуклеиновой кислоты из капсида. Если нуклеиновая кислота вируса представляет собой двунитевую ДНК (к настоящему времени открыты вирусы, содержащие либо обычные двунитевые молекулы ДНК, либо однонитевые молекулы ДНК, либо молекулы РНК), практически сразу может начаться процесс транскрипции, приводящий к появлению вирусных информационных РНК. В результате трансляции этих иРНК на рибосомах клетки возникают белки, необходимые для создания новых капсидов и для осуществления репликации вирусной ДНК. Новые молекулы вирусной ДНК «упаковываются» в капсиды, и в клетке возникает несколько сотен новых вирусов. Далее вирусы покидают «взрастившую» их клетку либо путем отпочковывания от ее поверхности, либо путем полного разрушения клетки.

Ясно, что для клетки присутствие таких «гостей» крайне нежелательно, поэтому в процессе эволюции у организмов выработался особый способ защиты от чужеродных нуклеиновых кислот, попадающих в их цитоплазму. Эта защита определяется присутствием в клетке особых ферментов - эндонуклеаз, способных «узнавать» и разрушать чужие молекулы ДНК. Такие ферменты способны разрывать ковалентные связи между нуклеотидами в цепи ДНК, причем такое разрушение молекул осуществляется специфически, только в конкретных участках, представляющих определенную последовательность нуклеотидов.

Сравнение эндонуклеаз из клеток организмов различных видов показало, что каждый вид обладает своими, только ему присущими эндонуклеазами, способными узнавать в молекуле ДНК строго определенные сочетания нуклеотидов. Здесь следует вспомнить, что у каждого организма в его молекулах ДНК нуклеотиды расположены в определенном порядке, что собственно и определяет отличие одних организмов от других. Но, с другой стороны, поскольку нуклеотидов в ДНК всего лишь четыре разновидности, определенные их короткие сочетания, могут повторяться. Поэтому разрушительному воздействию эндонуклеаз теоретически должна подвергаться любая молекула ДНК, в которой имеется так называемый сайт узнавания - определенная последовательность нуклеотидов. Такие последовательности, конечно же, имеются и в собственной ДНК клетки, но почему же эта ДНК не разрушается? Оказывается, что нуклеотиды в сайтах узнавания для имеющихся в клетках этого вида организмов эндонуклеаз особым образом изменены химически - к ним присоединены дополнительные группировки (например, метильные остатки СН3), присутствие которых предотвращает присоединение эндонуклеазы. Иными словами говоря, клетки каждого организма особым образом «метят» свою собственную ДНК в сайтах узнавания для собственных эндонуклеаз. Такой процесс в молекулярной биологии называют модификацией ДНК, а ферменты, которые катализируют этот процесс, модифицирующими ферментами. Поскольку у каждого вида организмов ДНК «помечена» в местах узнавания именно для своих рестриктаз, любая «чужая» для этого организма ДНК будет разрушаться эндонуклеазами этой клетки, а своя собственная - сохраняться.

Учитывая то, что такое воздействия на вирусную ДНК ограничивает размножение вирусов, такие ферменты с момента их открытия стали называть рестриктазами (от англ. restriction - ограничение). Этот термин в современной молекулярной биологии используется на равных с термином эндонуклеазы.


Для обозначения рестриктаз (эндонуклеаз) различных видов организмов было решено использовать в названии фермента первые буквы латинского наименования образующего данную рестриктазу вида и далее несколько букв и (или) римских цифр. Дело в том, что в клетках одного и того же вида организмов, как правило, образуется не одна, а несколько рестриктаз, отличающихся по способности узнавать различные сочетания нуклеотидов. Это обеспечивает большую возможность уничтожения разных по нуклеотидному составу «чужих» ДНК, т.е. обеспечивает защиту от большего числа вирусов. В качестве примера приведем названия нескольких рестриктаз: для обозначения эндонуклеаз, образуемых клетками уже известной вам кишечной палочки Escherichia coli используются обозначения EcoRI и EcoRV, где первая буква происходит от названия рода, две последующие - две первые буквы видового эпитета, буква R означает рестриктаза, а следующая за ней римская цифра - ее номер. То есть EcoRI и EcoRV - это первая и пятая рестриктазы из продуцируемых клетками кишечной палочки. Соответственно, подобные, но отличающиеся по сайтам узнавания ферменты из клеток Haemophillus parainfluenzae называются HpaI и HpaII. Необходимость введения таких названий связана с тем, что в настоящее время уже известно несколько сотен различных эндонуклеаз, различающихся по месту и характеру воздействия на ДНК.

Изучение эндонуклеаз различных организмов показало, что они отличаются не только по специфичности к сайтам узнавания. Оказалось, что некоторые эндонуклеазы могут, в зависимости от условий, не разрывать фосфодиэфирную связь между нуклеотидами в цепи ДНК, а присоединять к нуклеотидам дополнительные химические группировки, защищающие этот участок ДНК от расщепления такой же эндонуклеазой. Такую активность называют модифицирующей, и она нужна клеткам для того, чтобы защищать свою собственную вновь синтезируемую перед делением ДНК от расщепления. Кроме того, для проявления модифицирующей активности некоторых эндонуклеаз обязательно наличие молекул АТФ. С учетом особенностей узнавания и разрезания молекул ДНК, а также наличия у них модифицирующей активности и зависимости от присутствия молекул АТФ эндонуклеазы разделили на три класса (или типа). Эндонуклеазы класса I способны не только расщеплять молекулу ДНК в своем сайте узнавания, но и модифицировать ее, для их работы необходимо присутствие АТФ. Эндонуклеазы класса II обладают только рестрицирующей активностью в пределах сайта узнавания и не нуждаются для ее проявления в молекулах АТФ. Эндонуклеазы класса III прикрепляются к молекуле ДНК в одном месте (сайте узнавания), но разрыв связей между нуклеотидами осуществляют в другом участке, расположенном на расстоянии нескольких десятков нуклеотидов от сайта узнавания. Их активность также зависит от АТФ.

Открытие вышеописанного механизма защиты от вирусов, да и вообще от любой чужеродной генетической информации оказалось важным не только чисто в теоретическом плане, но и в плане развития генетической инженерии. Оказалось, что выделенные из клеток различных видов бактерий эндонуклеазы способны разъединять молекулы ДНК и вне клетки, как говорят биологи in vitro (т.е. вне живого). А это означало, что можно, используя конкретную рестриктазу разделить множество одинаковых молекул ДНК на одинаковые фрагменты. С другой стороны, учитывая то, что эндонуклеазы различных видов бактерий разрезают молекулы ДНК в разных участках, можно последовательно воздействовать на одни и те же молекулы, получая с каждым этапом все более мелкие фрагменты. Фактически, открытие рестриктаз дало в руки генетическим инженерам своеобразные волшебные ножницы, позволяющие правильно нарезать невидимые глазом молекулы. Удобнее всего в качестве такого инструмента оказалось использовать эндонуклеазы класса II - и АТФ в реакционную смесь добавлять не надо, и они всегда будут только резать. Поэтому в настоящее время для целей генетической инженерии на специальных предприятиях выращивают бактерии различных видов и получают из их клеток уже более сотни различных рестриктаз, но все они относятся ко второму классу.

Фрагментация ДНК, называемая в генетической инженерии рестрикцией, необходима для того, чтобы отобрать из полученных небольших участков те, которые содержат интересующую генных инженеров наследственную информацию, и далее использовать их для объединения с ДНК другого организма. Как именно удается проводить такой отбор, вы узнаете из следующего раздела.

Вопросы к §3. 1. В чем суть рестрикции как биологического явления? 2. Почему именно эндонуклеазы класса II были выбраны для целей генетической инженерии? 3. Почему в генетической инженерии используют не одну, а множество различных рестриктаз?



загрузка...